Le 7 août 2009, un pipeline transportant du pétrole brut s'est rompu, provoquant le déversement de 5100 m3 de brut sur 5 hectares de la Réserve Naturelle des Coussouls de Crau. Le pétrole a atteint l'aquifère et a formé un LNAPL qui alimente un panache de polluants dissous, dont le benzène, composé cible car toxique. Cette étude vise à montrer que la biodégradation du pétrole (biostimulation ou atténuation naturelle), en particulier des composés dissous, est une mesure efficace de gestion à long terme des risques pour la ressource en eau. Une première étude en microcosmes a montré la biodégradation, même dans les conditions les plus réductrices, des composés cibles dont le benzène. Cette étude a confirmé que la disponibilité en oxydant est un facteur limitant et que le phosphate est un levier puissant pour stimuler la croissance bactérienne. Une seconde étude sur site a prouvé la faisabilité de la biostimulation par injection de nitrate et de phosphate dans la nappe et son efficacité pour l'abattement des concentrations en polluants dissous. L'utilisation du radon comme traceur pour estimer la saturation en pétrole dans l'aquifère a été évaluée dans une troisième étude. La facilité de mise en oeuvre de la méthode ainsi que les résultats offrent des perspectives intéressantes pour l'optimisation des systèmes de pompage-écrémage sur des sites ayant un NAPL. Une dernière étude portant sur la mise en place des processus d'oxydoréduction et de dégradation sur site a montré une évolution rapide des conditions après l'accident, traduisant un environnement favorable à l'atténuation naturelle. La dégradation in situ du benzène a été mise en évidence via des mesures isotopiques. / On August 7, 2009 a pipeline transporting crude oil broke in the heart of the Nature Reserve of Coussouls de Crau, and 5,100 m3 of oil were spilled over 5 hectares. Oil infiltrated through the subsurface and reached the most important regional aquifer where it formed a LNAPL that created a plume of dissolved compounds. Among these compounds, benzene is of particular concern because of its toxicity and high solubility. This thesis aims at showing that biodegradation of crude oil, especially of dissolved compounds, is a good option for long-term management of risks for the water resource. A first study in microcosms demonstrated biodegradation of targeted compounds, including benzene, even under the most reducing conditions. This study also revealed that the availability of electrons acceptors was a limiting factor and that phosphate was a powerful lever to stimulate bacterial growth. An on-site study proved the feasibility of biostimulation by nitrate and phosphate injection in the aquifer and showed that biostimulation was efficient to reduce concentrations of dissolved compounds. Naturally occurring radon was used as a tracer to estimate oil saturation in the saturated zone in a third study. The ease of implementation of this method and the results offer interesting perspectives to optimize the yield of pump-and-skim systems in LNAPL-contaminated sites. The last study focused on the implementation of redox processes and degradation in the saturated zone after the spill. This study showed that processes quickly evolved and that conditions were favorable to natural attenuation. In situ benzene degradation was proven by the measurements of stable isotopes of carbon.

De plus en plus de substances chimiques sont produites dans le monde et une grande partie d'entre elles entrent dans la composition des produits phytosanitaires. La France en est le premier consommateur européen et le troisième au niveau mondial. L'objectif de nos recherches est de comprendre le devenir et les effets de ces molécules dans l'environnement, notamment agricole, grâce à l'utilisation d'un invertébré bioindicateur, l'escargot Helix aspersa. Nous avons choisi de caractériser l'exposition, le transfert et les effets sur l'escargot de 8 formulations commerciales de fongicides et d'herbicides (Roundup® et Bypass® = glyphosate; Basta® = glufosinate; Valiant® Flash = folpel + cymoxanil + fosétyl-Al; Corail® = tébuconazole; Cabrio® Top = pyraclostrobine + métirame-Zn; Thiovit® = soufre; Bouillie bordelaise = cuivre), communément utilisées en viticulture. Une étude réalisée en conditions in situ a permis de quantifier les retombées au sol des pesticides appliqués sur la vigne, dans la parcelle et en périphérie mettant en évidence les dépôts suite à la dérive des substances. En parallèle, peu d'effets ont été démontrés sur la survie et la croissance d'escargots juvéniles placés en microcosmes et soumis aux différents traitements de pesticides, mis à part un effet inhibiteur du Roundup® sur la masse des organismes, probablement en relation avec d'importants dépôts au sol, l'accumulation et la métabolisation de la substance active dans les tissus. Une méthode d'extraction et d'analyse de deux herbicides (glyphosate et glufosinate) dans le sol a été développée afin de pouvoir mesurer les concentrations d'exposition pour diverses expériences et de caractériser leur persistance dans ce sol de vigne. Les effets du Bypass® et du Basta® ont été étudiés sur l'ensemble du cycle de vie de l'escargot en conditions contrôlées. Aucun effet significatif sur la survie et la croissance n'a été démontré bien qu'une accumulation de glyphosate ait été quantifiée chez des escargots (6 mg kg-1) nourris continuellement par de l'aliment contaminé (à 30 mg kg-1). Cependant, une exposition au glyphosate des escargots durant le développement embryonnaire semble perturber leur reproduction (diminution de la fertilité) du fait d'un effet différé de cet herbicide. Les cibles potentiellement affectées au niveau du contrôle neuroendocrine sont discutées. Tous les pesticides inhibent l'éclosion des œufs de l'escargot à des concentrations inférieures à celles appliquées au champ et l'influence des caractéristiques du sol sur leur toxicité a été démontrée. Ces effets ont été mis en évidence lors d'expériences réalisées en laboratoire dans le cadre d'un développement de bioessais d'embryotoxicité. Ces travaux de thèse ont apporté des connaissances sur le comportement, en surface et dans le sol, ainsi que dans l'escargot (transfert, toxicité), de plusieurs pesticides appliqués sur la vigne. Ils ont également permis de développer plusieurs outils (bioessais de laboratoire, dispositif d'exposition sur le terrain) visant à améliorer les procédures d'évaluation du risque des pesticides dans l'environnement terrestre. Les techniques d'analyse de ces composés mises au point pour des matrices complexes (sols, tissus animaux), constituent un apport original pour l'évaluation du risque environnemental et sanitaire. D'importantes difficultés analytiques ont été rencontrées et il n'a pas été possible de finaliser les méthodes de dosage pour la totalité des substances. Ainsi, la mesure des résidus de pesticides dans les tissus d'origine animale reste un challenge fort et qui plus est, au cœur des préoccupations environnementales actuelles.

L'objectif de ce travail de thèse vise à analyser les effets de quelques pesticides et d'un adjuvant sur des organismes marins, représentatifs de quatre niveaux trophiques, à savoir des micro-algues, un échinoderme, des bivalves et un poisson. L'analyse de la pollu-sensibilité est basée sur l'utilisation de différents bio-essais existants ou adaptés au contexte de cette étude.Les tests de toxicité ont permis d'évaluer la sensibilité de trois espèces phytoplanctoniques (Chaetoceros calcitrans, Isochrysis aff. Galbana et Tetraselmis suecica) vis-à-vis d'un fongicide l'époxiconazole (pur et en formulation commerciale Opus) et de l'adjuvant nonylphénol. D'une manière générale, la croissance de C. calcitrans et I. aff. Galbana s'avère plus sensible à l'action des contaminants étudiés. Ainsi, en utilisant pour C. calcitrans un milieu reproduisant les conditions naturelles du Golfe de Gabès, des valeurs de CE50 de 2 ,31 mg/L et 2,9 μg/l sont obtenues respectivement avec la substance active époxiconazole, et le produit formulé. Ces résultats montrent l'importance des adjuvants dans la toxicité et que les micro-algues peuvent être sensibles aux effets non-cibles d'un fongicide triazole.En outre, l'âge des cellules, les conditions d'éclairement et de composition des milieux de culture induisent des changements de sensibilité au fongicide, suggérant que la densité cellulaire est un paramètre important dans les tests de toxicité.L'analyse de quelques paramètres physiologiques montre que les contaminants utilisés induisent une augmentation du volume cellulaire, des échanges gazeux, de la teneur en pigments et en ATP. Il apparaît ainsi que les toxiques utilisés réduisent la vitesse de croissance, prolongeant le cycle cellulaire, sans affecter la production de nouveaux matériaux, nécessaires à la construction de nouvelles cellules.Par ailleurs, une étude réalisée en microcosmes lors d'un bloom de l'algue toxique Karenia selliformis dans le golfe de Gabès, montre que les différents contaminants chimiques (époxiconazole, chlorpyriphos-éthyl, nonylphénol) produisent des modifications drastiques de la structure des communautés phytoplanctoniques, fonction de la nature et de la concentration du contaminant.La toxicité des différents contaminants a été étudiée sur des animaux marins, aux stades embryo-larvaire (oursin, huître, palourde), métamorphose des larves (palourde) et survie des larves (turbot). Les résultats montrent que les larves du turbot sont les plus sensibles à l'action des contaminants avec des CE50 allant de 2,78 à 492 μg/L selon le toxique et que chez la palourde, la métamorphose est le stade le plus sensible parmi les trois stades de développement étudiés. Les contaminants utilisés produisent des anomalies du développement et des malformations embryonnaires qui peuvent induire une réduction de la production naturelle en agissant i) directement sur le développement embryo-larvaire et ii) indirectement sur la qualité et la biodisponibilité de l'aliment à travers la variation de la biomasse phytoplanctonique. Ces résultats soulignent la nécessité d'appliquer les toxiques à différents organismes marins présentant des organisations différentes pour apprécier pleinement leur impact.

Ces travaux s'inscrivent dans une problématique actuelle de compréhension des effets, encore peu connus, des mélanges de pesticides dans le sol. Les formulations d'herbicides S-métolachlore (Dual Gold Safeneur®), mésotrione (Callisto®) et nicosulfuron (Milagro®) ont été appliquées en mélanges et à la dose agronomique recommandée. Les molécules formulées sont plus toxiques que les molécules actives seules (Microtox®) et aucun effet synergique ou antagoniste des mélanges n'a été observé. Cependant, ces mélanges impactent transitoirement et à court terme les communautés microbiennes du sol de Limagne, sans modifier les paramètres généraux de structure et d'abondance. Toutefois, des effets ont été mis en évidence sur des communautés sensibles telles que les phototrophes ou celles impliquées dans les processus de nitrification et de dénitrification. De plus, une comparaison des effets des mélanges sur les communautés phototrophes de deux sols souligne l'importante toxicité du Dual Gold Safeneur® et remet en cause son utilisation d'un point de vue écotoxicologique.

Cette thèse a pour but d'identifier et de préciser les processus biotiques et abiotiques qui contrôlent le comportement du Ca et plus spécifiquement le fractionnement des isotopes du Ca à l'interface géosphère-biosphère-hydrosphère en combinant différentes études expérimentales (hydroponiques et microcosmes). Les résultats obtenus lors des expérimentations hydroponiques ont permis d'identifier 3 niveaux de fractionnement des isotopes du Ca au sein des végétaux, ces 3 niveaux de fractionnement sont induits par des mécanismes physico-chimiques qui enrichissent les organes de végétaux en 40Ca.Les résultats des expérimentations hydroponiques montrent également que l'évolution de la composition isotopique du Ca de la solution nutritive et des plantes suit une loi de fractionnement des isotopes du Ca à l'équilibre (αplantes/solution nutritive = 0,99858). Les expérimentations abiotiques en microcosmes, quant à elles, indiquent que la dissolution de l'apatite par des acides organiques ou inorganiques n'influence pas la signature isotopique en Ca de la phase dissoute résultante. À l'inverse, lors des expérimentations biotiques en microcosmes, seule l'action combinée des racines de pins et des bactéries sur un substratum d'apatite enrichit la solution qui percole en 44Ca de 0,22‰.

Cette thèse a pour but d’identifier et de préciser les processus biotiques et abiotiques qui contrôlent le comportement du Ca et plus spécifiquement le fractionnement des isotopes du Ca à l’interface géosphère-biosphère-hydrosphère en combinant différentes études expérimentales (hydroponiques et microcosmes). Les résultats obtenus lors des expérimentations hydroponiques ont permis d’identifier 3 niveaux de fractionnement des isotopes du Ca au sein des végétaux, ces 3 niveaux de fractionnement sont induits par des mécanismes physico-chimiques qui enrichissent les organes de végétaux en 40Ca.Les résultats des expérimentations hydroponiques montrent également que l’évolution de la composition isotopique du Ca de la solution nutritive et des plantes suit une loi de fractionnement des isotopes du Ca à l’équilibre (αplantes/solution nutritive = 0,99858). Les expérimentations abiotiques en microcosmes, quant à elles, indiquent que la dissolution de l’apatite par des acides organiques ou inorganiques n’influence pas la signature isotopique en Ca de la phase dissoute résultante. À l’inverse, lors des expérimentations biotiques en microcosmes, seule l’action combinée des racines de pins et des bactéries sur un substratum d’apatite enrichit la solution qui percole en 44Ca de 0,22‰. / The aim of this thesis is to identify and to specify biotic and abiotic processes affecting the Ca behavior and specifically the Ca isotope fractionation at the geosphere/biosphere/hydrosphere interface by combining different experimental studies (hydroponic and microcosm).Results of hydroponic experiments allow to identify three Ca isotopic fractionation levels, which are driven by physico-chemical mechanisms and enrich the plant organs in the light 40Ca isotope. Moreover, the evolution of Ca isotopic composition of nutrient solution and plants follow an equilibrium law (αplants/nutrient solution = 0.99858).Abiotic column experiments show no Ca isotopic fractonation during apatite disolution, whatever the nature of the acid (mineral or organic). At the opposite, during biotic microcosm experiments, only the combined action of roots of scots pines and bacteria on apatite substratum enrich the percolate solution in heavy 44Ca of 0.22‰.

Ces travaux s’inscrivent dans une problématique actuelle de compréhension des effets, encore peu connus, des mélanges de pesticides dans le sol. Les formulations d’herbicides S-métolachlore (Dual Gold Safeneur®), mésotrione (Callisto®) et nicosulfuron (Milagro®) ont été appliquées en mélanges et à la dose agronomique recommandée. Les molécules formulées sont plus toxiques que les molécules actives seules (Microtox®) et aucun effet synergique ou antagoniste des mélanges n’a été observé. Cependant, ces mélanges impactent transitoirement et à court terme les communautés microbiennes du sol de Limagne, sans modifier les paramètres généraux de structure et d’abondance. Toutefois, des effets ont été mis en évidence sur des communautés sensibles telles que les phototrophes ou celles impliquées dans les processus de nitrification et de dénitrification. De plus, une comparaison des effets des mélanges sur les communautés phototrophes de deux sols souligne l’importante toxicité du Dual Gold Safeneur® et remet en cause son utilisation d’un point de vue écotoxicologique. / These experiments are part of the actual problematic of understanding the poorknown effects of pesticides mixtures in soil ecosystem. The herbicidal commercial formulations of S-metolachlor (Dual Gold Safeneur®), mesotrione (Callisto®) and nicosulfuron (Milagro®) were applied in mixtures at the recommended field rate. Formulated compounds are more toxic than active ingredients alone (Microtox®) and no synergistic or antagonistic effects were recorded. However, these mixtures impaired rapidly and transitory the Limagne soil microbial communities, without modifying the global parameters of structure and abundance. Effects were also recorded on sensitive communities, such as phototrophic, nitrifying and denitrifying communities. A comparison of mixtures effects on phototrophic communities from two soils underlined the high toxicity of Dual Gold Safeneur® and challenged its use from an ecotoxicological point of view..

L’objectif de ce travail de thèse vise à analyser les effets de quelques pesticides et d’un adjuvant sur des organismes marins, représentatifs de quatre niveaux trophiques, à savoir des micro-algues, un échinoderme, des bivalves et un poisson. L’analyse de la pollu-sensibilité est basée sur l’utilisation de différents bio-essais existants ou adaptés au contexte de cette étude.Les tests de toxicité ont permis d’évaluer la sensibilité de trois espèces phytoplanctoniques (Chaetoceros calcitrans, Isochrysis aff. Galbana et Tetraselmis suecica) vis-à-vis d’un fongicide l’époxiconazole (pur et en formulation commerciale Opus) et de l’adjuvant nonylphénol. D’une manière générale, la croissance de C. calcitrans et I. aff. Galbana s’avère plus sensible à l’action des contaminants étudiés. Ainsi, en utilisant pour C. calcitrans un milieu reproduisant les conditions naturelles du Golfe de Gabès, des valeurs de CE50 de 2 ,31 mg/L et 2,9 μg/l sont obtenues respectivement avec la substance active époxiconazole, et le produit formulé. Ces résultats montrent l’importance des adjuvants dans la toxicité et que les micro-algues peuvent être sensibles aux effets non-cibles d’un fongicide triazole.En outre, l’âge des cellules, les conditions d’éclairement et de composition des milieux de culture induisent des changements de sensibilité au fongicide, suggérant que la densité cellulaire est un paramètre important dans les tests de toxicité.L’analyse de quelques paramètres physiologiques montre que les contaminants utilisés induisent une augmentation du volume cellulaire, des échanges gazeux, de la teneur en pigments et en ATP. Il apparaît ainsi que les toxiques utilisés réduisent la vitesse de croissance, prolongeant le cycle cellulaire, sans affecter la production de nouveaux matériaux, nécessaires à la construction de nouvelles cellules.Par ailleurs, une étude réalisée en microcosmes lors d’un bloom de l’algue toxique Karenia selliformis dans le golfe de Gabès, montre que les différents contaminants chimiques (époxiconazole, chlorpyriphos-éthyl, nonylphénol) produisent des modifications drastiques de la structure des communautés phytoplanctoniques, fonction de la nature et de la concentration du contaminant.La toxicité des différents contaminants a été étudiée sur des animaux marins, aux stades embryo-larvaire (oursin, huître, palourde), métamorphose des larves (palourde) et survie des larves (turbot). Les résultats montrent que les larves du turbot sont les plus sensibles à l’action des contaminants avec des CE50 allant de 2,78 à 492 μg/L selon le toxique et que chez la palourde, la métamorphose est le stade le plus sensible parmi les trois stades de développement étudiés. Les contaminants utilisés produisent des anomalies du développement et des malformations embryonnaires qui peuvent induire une réduction de la production naturelle en agissant i) directement sur le développement embryo-larvaire et ii) indirectement sur la qualité et la biodisponibilité de l’aliment à travers la variation de la biomasse phytoplanctonique. Ces résultats soulignent la nécessité d’appliquer les toxiques à différents organismes marins présentant des organisations différentes pour apprécier pleinement leur impact. / This work aims to study the effects of a few pesticides and one adjuvant on marine organisms, representatives of four trophic levels : micro-algae, echinoderm, bivalves and fish. Analysis of the pollu-sensitivity was based on the utilisation of existing bio-assays or adapted to this study.Phytotoxic assessments were conducted on three phytoplanktonic species (Chaetoceros calcitrans, Isochrysis aff. Galbana et Tetraselmis suecica) using the fungicide epoxiconazole and the adjuvant nonylphenol. Sensitivity to these toxicants of C. calcitrans and I. aff. Galbana was high. Thus, when C. calcitrans was grown in a medium simulating pre-winter conditions in Gabès Gulf, EC50 values were respectively, 2.31 mg/L and 2.9 μg/L for epoxiconazole active ingredient and epoxiconazole-formulated. These results questioned the use of ecotoxicological data obtained solely using active molecules of pesticides rather the complete formulation and show that non-target micro-algae may be affected by a triazole fungicide.Moreover, cell age, light and nutrient composition induced changes in epoxiconazole sensitivity, suggesting that cellular density is an important parameter in toxicity tests.Analysis of a few physiological parameters show that contaminants used in this study induce an increase of pigment content, ATP synthesis, and rates of oxygen exchanges while the cell volume enlarges. Consequently, the toxicants might reduce the growth rate, by a prolongation of the cell cycle without affecting the production of new material for the construction of new cells.Bioassays were conducted using microcosms during a bloom of the toxic algae Karenia selliformis in the Gulf of Gabès. The different toxicants (epoxiconazole, chlorpyrifos-éthyl, nonyphenol) produced drastic changes in the phytoplankton communities, depending on the type and concentration of the contaminant.Phytotoxic assessments were conducted on marine animal models, using different developmental stages: embryo-larval development (sea urchin, oyster, and clam), metamorphosis larvae (clam) and larvae survival (turbot). Results show that turbot larvae are most sensitive to the action of contaminants with EC50 values ranging from 2.78 to 492 μg/L depending on the toxic and that the metamorphosis is the stage the most sensitive of the three stages of development of clam studied.The pollutants produced developmental and embryonic abnormalities that might induce a reduction in the natural production by acting i) directly on the development of the marine organisms and ii) indirectly on the quality and bioavailability of food through the variation of phytoplankton biomass.These results underline the need to study pollutant effects on marine organisms having different organizations to evaluate their full impact.

Le chlorométhane (CH3Cl) est un composé organique volatile responsable de plus de 15 % de la dégradation de l’ozone stratosphérique due aux composés chlorés. Il est produit majoritairement par les plantes vivantes ou en décomposition. Les bactéries capables d’utiliser le CH3Cl comme source de carbone pour leur croissance peuvent jouer un rôle de filtre dans les émissions de CH3Cl vers l'atmosphère. Ce processus biologique reste à quantifier dans l'environnement, notamment pour les sols forestiers considérés comme un puits majeur de ce composé.Dans les études environnementales, le gène cmu A est utilisé comme biomarqueur de la dégradation bactérienne du CH3Cl. Il code une chlorométhane méthyltransférase essentielle à la croissance bactérienne avec le CH3Cl parla voie cmu (pour chloromethane utilisation), la seule caractérisée à ce jour. Mon projet de thèse avait un double objectif : i) l’approfondissement des connaissances de l’adaptation au CH3Cl chez une bactérie méthylotrophe modèle, Methylobacterium extorquens CM4; ii) l’exploration de la diversité des bactéries CH3Cl-dégradantes de sols forestiers. L’étude RNAseq chez la souche CM4 a montré que la croissance avec le CH3Cl s'accompagne de différences dans la transcription de 137 gènes de son génome (6.2 Mb) par rapport à sa croissance sur le méthanol (CH3OH). Les gènes de la voie cmu, ainsi que d’autres gènes impliqués dans le métabolisme de cofacteurs essentiels à l’utilisation du CH3Cl par cette voie et eux aussi portés par le plasmide pCMU01 de la souche, en font partie. Les paralogues de ces gènes localisés sur le chromosome ne sont quant à eux pas différentiellement exprimés. En revanche, d’autres gènes du chromosome, potentiellement impliqués dans l’excrétion de protons produits lors de la déshalogénation (hppA), la régénération du NADP+ (pnt), ou le métabolisme du cofacteur tétrahydrofolate(gènes gcvPHT), le sont. L’étude de la diversité des bactéries CH3Cl-dégradantes de sol forestier de la réserve naturelle de Steigerwald (Allemagne) a été réalisée sur des microcosmes par une approche de « Stable Isotope Probing ». Les microorganismes capables d’assimiler le CH3Cl marqué au [13C] incorporent cet isotope lourd du carbone dans leur ADN. L'analyse des séquences amplifiées par PCR des gènes codant l’ARN 16S des fractions d'ADN enrichies en [13C] a permis de mettre en évidence de nouveaux phylotypes, du genre Methylovirgula et de l’ordre des Actinomycetales, distincts de ceux auxquelles les souches dégradant le CH3Cl isolées jusqu'ici sont affiliées. En revanche, les séquences du gène cmuA et d’autres gènes du métabolisme méthylotrophe obtenues par PCR à partir de l'ADN enrichi en [13C] sont très proches de celles des souches CH3Cl-dégradantes connues. Les résultats obtenus suggèrent ainsi que des bactéries ayant acquis par transfert horizontal les gènes de dégradation de la voie cmu ou ne possédant pas de gène cmuA contribuent au filtrage biologique du CH3Cl des sols forestiers. A l'avenir, le couplage de différentes méthodes moléculaires et des approches culturales visera à découvrir de nouvelles voies microbiennes de l’utilisation du CH3Cl, et à caractériser l’abondance et la diversité des métabolismes impliqués dans la dégradation du CH3Cl dans les sols et d'autres compartiments environnementaux. / Chloromethane (CH3Cl) is a volatile organic compound responsible for over 15% of stratospheric ozone degradation due to chlorinated compounds. It is mainly produced by living and decaying plants. Bacteria utilizing CH3Cl as sole carbon and energy source for growth were shown to be involved in the filtering of CH3Cl emissions to the atmosphere. This biological process remains to be quantified in the environment, especially for forest soil, a major CH3Cl sink. The cmuA gene is used as a biomarker of bacterial CH3Cl degradation in environmental studies. It encodes a CH3Cl methyltransferase essential for bacterial growth by the cmu (chloromethane utilization) pathway for growth with CH3Cl and the only one characterized so far. My thesis project had a double aim: i) In depth studies of CH3Cl adaptation of a model methylotrophic bacterium, Methylobacterium extorquens strain CM4; ii) Exploration of bacterial CH3Cl-utilizers in forest. An RNAseq study of strain CM4 has shown that growth with CH3Cl leads to a difference of transcription of 137 genes in its 6.2 Mb genome compared to growth with methanol (CH3OH). Among those, genes of the cmu pathway and other genes involved in the metabolism of essential cofactors for CH3Cl utilization by this pathway, are all plasmid pCMU01-encoded. Paralogous genes located on the chromosome were not differentially expressed. On the other hand, other chromosomal genes potentially involved in extruding protons generated during CH3Cl deshalogenation (hppA), NADP+ regeneration (pnt), or in the cofactor tetrahydrofolate metabolism (gcvPHT) were differentially expressed. The diversity of CH3Cl-degrading bacteria in forest soil of the German natural park of Steigerwald was studied in microcosms using stable isotope probing. Microorganisms able to assimilate labeled [13C]- CH3Cl incorporate this heavy carbon isotope in their DNA. Sequence analysis of the PCR-amplified 16S RNA encoding gene from [13C]-DNA fractions uncovered phylotypes of the genus Methylovirgula and of the order of the Actinomycetales, which were not associated with bacterial CH3Cl degradation so far. In contrast, PCR-amplified sequences of cmuA and other genes of methylotrophic metabolism were closely related to known CH3Cl-degrading isolates. These results suggest that bacteria containing genes of the cmu pathway acquired by horizontal gene transfer as well as bacteria lacking the cmu pathway contribute to biological filtering of CH3Cl in forest soil. Future experiments coupling molecular and culture methods will aim to discover new CH3Cl-degrading pathways and to characterize the abundance and diversity of CH3Cl-degradation metabolism in soil and other environmental compartments.