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Avec la hausse mondiale de la fréquence des floraisons de cyanobactéries (CB), dont certaines produisent des cyanotoxines (CT), le développement d’une méthode de détection/quantification rapide d’un maximum de CT s’impose. Cette méthode permettrait de faire un suivi quotidien de la toxicité de plans d’eau contaminés par des CB et ainsi d’émettre rapidement des avis d’alerte appropriés afin de protéger la santé publique. Une nouvelle technologie utilisant la désorption thermique induite par diode laser (LDTD) couplée à l’ionisation chimique sous pression atmosphérique (APCI) et reliée à la spectrométrie de masse en tandem (MS/MS) a déjà fait ses preuves avec des temps d'analyse de l’ordre de quelques secondes. Les analytes sont désorbés par la LDTD, ionisés en phase gazeuse par APCI et détectés par la MS/MS. Il n’y a donc pas de séparation chromatographique, et la préparation de l’échantillon avant l’analyse est minimale selon la complexité de la matrice contenant les analytes. Parmi les quatre CT testées (microcystine-LR, cylindrospermopsine, saxitoxine et anatoxine-a (ANA-a)), seule l’ANA-a a généré une désorption significative nécessaire au développement d’une méthode analytique avec l’interface LDTD-APCI. La forte polarité ou le poids moléculaire élevé des autres CT empêche probablement leur désorption. L’optimisation des paramètres instrumentaux, tout en tenant compte de l’interférence isobarique de l’acide aminé phénylalanine (PHE) lors de la détection de l’ANA-a par MS/MS, a généré une limite de détection d’ANA-a de l’ordre de 1 ug/L. Celle-ci a été évaluée à partir d’une matrice apparentée à une matrice réelle, démontrant qu’il serait possible d’utiliser la LDTD pour effectuer le suivi de l’ANA-a dans les eaux naturelles selon les normes environnementales applicables (1 à 12 ug/L). Il a été possible d’éviter l’interférence isobarique de la PHE en raison de sa très faible désorption avec l’interface LDTD-APCI. En effet, il a été démontré qu’une concentration aussi élevée que 500 ug/L de PHE ne causait aucune interférence sur le signal de l’ANA-a. / Within the context of the worldwide increasing frequency of cyanobacterial (CB) blooms, some containing cyanotoxins (CT), the development of a detection/quantification method for the fast analysis a maximum of CT is necessary. This method would allow daily tracking of the toxicity of CB-contaminated water such that, as warranted, appropriate measures can be taken quickly to protect public health. A new technology using laser diode thermal desorption (LDTD) coupled to atmospheric pressure chemical ionization (APCI)-tandem mass spectrometry (MS/MS) has shown great potential to reduce analysis time to seconds. Analytes are desorbed by the LDTD, ionized in gas-phase by APCI and detected by MS/MS. Therefore, there is no chromatographic separation and sample treatment prior to analysis is minimal, depending on the complexity of the sample matrix. Among the four CT tested (microcystin-LR, cylindrospermopsin, saxitoxin and anatoxin-a (ANA-a)), only ANA-a exhibited sufficient desorption which is necessary to develop an analytical method with the LDTD-APCI interface. The strong polarity or high molecular weight of the other CT probably inhibited their efficient desorption. Optimization of instrumental parameters, while accounting for the isobaric interference caused by the acid amino phenylalanine (PHE) in the detection of ANA-a by MS/MS, generated a detection limit of the order of 1 ug/L ANA-a. This value was obtained in a simulated natural matrix, demonstrating that it would be possible to use LDTD to monitor ANA-a in natural waters within the range of current applicable environmental guidelines (1 to 12 ug/L). Because PHE desorption is limited with the LDTD-APCI interface, this method avoids its interference on ANA-a analysis, even at PHE concentrations as high as 500 ug/L.

In this diploma thesis, I deal with the influence of the sampling site on water quality in natural bathing lakes (Hostivar reservoir, Seberak pond and Vyzlovka pond) in this. I have established that hygienically significant kinds of phytoplankton may differ in terms of water quality especially where there are cyanobacteria constituting water bloom. Surface water bloom may be moved by wind to the lee side of the water body (Microcystis sp.). Aphanizomenon flos-aquae water bloom floating in water column can be affected by wind and by water flow (which may be partly affected by wind as well). With the prevailing fibrous Planktothrix agardhii which does not connstitute water bloom the concentration of chlorophyll-a and cyanobacterial cell abundance in individual sampling sites are similar although the concentration of chlorophyll-a a is about 200 g.l-1 . Microcystis sp. and Scenedesmus sp. survive under eutrophic conditions in competition. From the microbiological perspective, water quality can differ within a single sampling site in places at a distance of less than 100 m. Microbial contamination can be caused by bathers, water birds, farm animals and probably by the removing of microorganisms from sand, mud and sediments on the beach or shore. Rain episodes probably increase the abundance of E.coli...

A demanda crescente de água doce de boa qualidade são problemas atuais e mundiais, além do descaso com os dejetos lançados nos ambientes aquáticos que comprometem a qualidade dos recursos hídricos. Um dos parâmetros que atesta a potabilidade da água é a presença de cianobactérias e cianotoxinas. Cianobactérias são microrganismos procariontes aeróbicos fotoautróficos que sintetizam as cianotoxinas. Estes compostos podem ser classificados de acordo com seus mecanismos de ação em hepatotóxicos, neurotóxicos e dermatotóxicos. Por sua diversidade, representam diferentes riscos não só ao ecossistema e a outros organismos dos ambientes aquáticos, como também aos seres humanos. Esse projeto visou o isolamento e cultivo de cepas de cianobactérias produtoras de toxinas para a investigação da biossíntese desses compostos. Com este intuito, foram realizadas coletas de água em três reservatórios no estado de São Paulo e um no Paraná. Cepas de cianobactérais foram isoladas, identificadas e analisadas quanto à produção de toxinas. Uma cepa de Microcystis aeruginosa (LTPNA 02) produtora de microcistinas (MC-LR, MC-RR, MC-YR, MC-LF, MC-LW e desm-MC-LR e desm- MC-RR) foi escolhida para ser estudada frente diferentes condições de cultivo e ter o seu crescimento, produção de toxinas e expressão gênica estudados. Foram utilizados os meios de cultura já referidos na literatura: ASM-1 (N:P=1, 10 e 20), MLA (N:P=10), Bold 3N (N:P=16) e BG-11 (N:P=10 e 100). Para acompanhar o crescimento, dois métodos foram utilizados: contagem de células e espectrofotometria. As toxinas foram quantificadas por LC-MS - QTrap. A análise da expressão gênica foi realizada por reação de PCR em tempo real pelo método de quantificação relativa &#916;&#916;Ct. Foi observada diferença no crescimento da cepa estudada nos diferentes meios de cultivo empregados. A contagem das células permitiu a identificação das fases logarítmica e total de crescimento. Durante a fase logarítmica, três experimentos demonstraram diferenças estatísticas quando comparadas ao controle (p<0,05). Ao se avaliar o crescimento total, quatro experimentos foram menores (p<0,01). As leituras das absorvâncias e a contagem de células demonstraram alta correlação Para ambas as leituras em 680 nm e 750 nm o coeficiente de correlação (r) esteve entre 0,93 e 0,99. A quantificação das microcistinas (MC) foi realizada por LC-MS - QTrap. Foram quantificadas as variantes MC-LR, MR-RR e MC-YR. Apesar da relação toxina/célula ser distinto para cada experimento, não representou grande variação naqueles realizados com meio ASM-1 (N:P 1; 10 e 20), meio MLA (N:P=10) e BG11(N:P=10). O experimento realizado em Bold3N (N:P=16,6) apresentou menor concentração de toxina/célula e as variantes MC-LR e MC-YR não foram detectadas. Por outro lado, o experimento realizado em BG-11 (N:P=100) apresentou a maior relação toxina por célula. Estes resultados sugerem que o excesso de nitrato seja um fator estressante para o desenvolvimento e crescimento da cepa de M. aeruginosa avaliada e ao mesmo tempo um fator estimulante para a produção das toxinas analisadas. Os experimentos que avaliaram a expressão dos genes 16S e mcyB em relação ao gene da ficocianina (controle endógeno) foram realizados em meio ASM-1 (N:P=10 e 100) e BG 11 (N:P= 10 e 100). Os parâmetros anteriores, como crescimento e produção de toxinas também foram avaliados. Novamente foram encontradas diferenças entre as fases de crescimento e produção de toxina, porém a expressão dos genes avaliados não demonstrou variação significativa entre os experimentos. Porém ambos os genes avaliados demonstraram menor expressão nos experimentos condizidos em (N:P=100). / There is a great concern these days about potable and good quality water due to the increase of the population needs and also to the arising problems with contamination caused by anthropogenic sources. The presence of cyanobacteria and cyanotoxins are some parameters that attest water potability. Cyanobacteria are prokaryotic aerobic photoautotrophic microorganisms that may synthesize cyanotoxins. These compounds can be classified as hepatotoxic, neurotoxic and dermatotoxic according to their action mechanisms. Because of their diversity, they may represent different risks, not only to their ecosystem and other aquatic living organisms, but also to human beings. The aim of this project was the isolation and cultivation of cyanotoxin-producing cyanobacteria for further investigation on the biosynthesis of these compounds. Water samples from three different reservoirs in São Paulo state and one in Paraná state were collected in order to isolate cyanobacteria strains and accomplish their identification and to evaluate the toxin production. The Microcystis aeruginosa (LTPNA 02) microcystin producer strain (MCLR, MC-RR, MC-YR, MC-LF, MC-LW, desm-MC-LR and desm-MC-RR) was chosen to be grown in different cultivation conditions and later analyzed for its growth rate, toxin production and gene expression. All culture media used in this research were chosen according to the literature: ASM-1 (N:P=1, 10 and 20), MLA (N:P=10), Bold 3N (N:P=16) and BG-11 (N:P=10 and 100). To evaluate growth rate, two techniques were used: cell counting and absorbance determination in two different wavelengths (680 nm and 750 nm). Toxins were quantified by LC-MS in a hybrid triple-quadrupole instrument (Qtrap). Gene expression was assessed by real time PCR, using the &#916;&#916;Ct relative quantification method. Cell counting allowed total growth and logarithmic phase identification. During the last, three experiments showed statistical difference from control group (p<0,05). Four experiments resulted in a lower total growth rate (p<0,05). A high correlation between cell counting and absorbance levels was found for both wavelengths tested. Correlation coefficients (r) were from 0,93 to 0,99. Three microcystin variants (MC-LR, MR-RR e MC-YR) were quantified by LC-MS. The toxin content per cell was calculated and showed no statistc variation among those experiments performed on ASM-1 (N:P 1; 10 and 20), MLA (N:P=10) and BG-11 (N:P=10). The lowest toxin/cell concentration was found for Bold3N (N:P=16,6) medium, where MC-LR and MC-YR production was not detected. On the other hand, the experiment with BG-11 (N:P=100) medium showed the highest toxin/cell content. These results suggest that high levels of nitrate in the culture medium may be a stressing factor for the development and growth of the M. aeruginosa tested strain, as well as a disturbing factor for microcystin production. Gene expression experiments regarding 16S and mycB genes using the phycocyanin gene as endogen control were performed on ASM-1 (N:P=10 and 100) and BG 11 (N:P= 10 and 100) media, along with the evaluation of growth rate and toxin production. Differences between growth rates and toxin production were once more observed, however gene expression did not show a significant variation among experiments.

A filosfera da Mata Atlântica é um importante nicho de colonização por micro-organismos, cuja comunidade ainda é pouco conhecida. Algumas bactérias associadas à superfície das folhas possuem habilidade de fixar nitrogênio, mineralizar substratos orgânicos e também suprir as árvores com dióxido de carbono e fatores de crescimento. Este trabalho teve como objetivo gerar informações sobre a comunidade cianobacteriana que coloniza a filosfera de algumas plantas da Mata Atlântica e investigar a comunidade diazotrófica presente nesse habitat. Um total de 40 linhagens de cianobactérias da filosfera de Merostachys neesii (bambu), Euterpe edulis (palmeira Juçara), Guapira opposita e Garcinia gardneriana foram isoladas e cultivadas. Os isolados foram caracterizados por análises morfológicas e filogenia do gene 16S RNAr. Essa abordagem permitiu a identificação de uma linhagem do gênero Nostoc, sete Desmonostoc, seis Leptolyngbya, uma Oculatella, cinco Brasilonema, uma Pleurocapsa e duas Chroococcidiopsis. Dezessete linhagens (uma Microchaetaceae, dez Nostocaceae e seis Pseudanabaenaceae) não puderam ser identificadas ao nível de gênero. Vinte e seis linhagens (24 pertencentes às ordens Nostocales e duas à Pseudanabaenales) foram caracterizadas como diazotróficas pela amplificação, sequenciamento e filogenia do gene nifH. Além disso, caracterizou-se o perfil de fixação biológica de nitrogênio da linhagem Desmonostoc sp. CENA362. Com relação ao potencial biotecnológico dessas linhagens, treze isolados foram identificados como potenciais produtores de ácido indol acético (IAA) de acordo com o teste Salkowski. Diversas linhagens apresentaram genes associados à via biossintética do inibidor de protease microviridina, sendo que três delas codificam para novas variantes. Além disso, dez linhagens foram identificadas como potenciais produtoras aeruginosina, três de cianopeptolina e três de microcistina. A comunidade bacteriana diazotrófica avaliada por pirosequenciamento do gene nifH apresentou um perfil de variação espécie-específica para Proteobacteria e uma correlação positiva entre a riqueza e a fixação biológica de nitrogênio. Neste estudo, cianobactérias que habitam a filosfera da Mata Atlântica foram isoladas estão sendo mantidas em condições de cultivo. Novos táxons foram descobertos e vários gêneros conhecidos foram descritos pela primeira vez neste hábitat, o que contribuiu para o aprimoramento da sistemática de Cyanobacteria. As linhagens em cultivo e as informações geradas sobre os seus compostos metabólitos representam uma valiosa fonte para estudos posteriores. Além disso, informações sobre a comunidade bacteriana diazotrófica da filosfera pode auxiliar no entendimento da dinâmica do nitrogênio, elemento limitante e pouco disponível na Mata Atlântica / The phyllosphere of the Atlantic Forest is an important niche for colonization by microorganisms, whose community is still little known. Some bacteria associated with leaf surfaces may possess the ability to fix nitrogen, mineralize the organic substrates and also supply the trees with carbon dioxide and growth factors. Therefore, this study aimed to generate information about cyanobacterial community that colonize the phyllosphere of some plants of the Atlantic Forest and investigated the diazotrophic community in this habitat. A total of 40 strains of Cyanobacteria from the phyllosphere of Merostachys neesii (bamboo), Euterpe edulis (Juçara palm), Garcinia gardneriana and Guapira opposita was isolated and cultivated. The isolates were characterized by morphological analyses and phylogeny of the 16S rRNA gene. This approach allowed the identification of one strain of the genus Nostoc, seven Desmonostoc, six Leptolyngbya, one Oculatella, five Brasilonema, one Pleurocapsa and two Chroococcidiopsis. Seventeen strains (one Microchaetaceae, ten Nostocaceae and six Pseudanabaenaceae) could not be identified at the genus level. Twenty-six strains (24 belonging to Nostocales and two belonging to Pseudanabaenales) were characterized as diazotrophic by amplification, sequencing and phylogeny of nifH gene. Also, it was characterized the profile of biological nitrogen fixation for the strain Desmonostoc sp. CENA362. Regarding the biotechnological potential of these strains, thirteen strains were identified as potential producers of indole acetic acid (IAA) according to Salkowski test. Several strains presented genes involved in the biosynthetic pathway of the protease inhibitor microviridin, three of them encoding putative novel variants. Moreover, ten strains were identified as potential producers of aeruginosin, three of cyanopeptolin and three of microcystin. The diazotrophic bacterial community evaluated by pyrosequencing of the nifH gene showed a profile of variation plant species-specific for Proteobacteria, and a positive correlation between richness and biological nitrogen fixation. In this study, cyanobacteria that inhabiting Brazilian Atlantic Forest phyllosphere were isolated and are been maintained in culture conditions. New taxa were discovered and several known genera were described for the first time in this habitat, which contributed to improvement of the cyanobacterial systematic. The culturable strains and the information generated about their metabolites compounds represent a valuable source for further studies. In addition, information about the diazotrophic bacterial community inhabiting the phyllosphere may help in understanding the dynamics of nitrogen, a limiting and low available element in Atlantic Forest

O crescimento desordenado das cidades, a utilização de áreas para plantio próximas aos mananciais e o lançamento de águas residuárias domésticas e industriais sem tratamento são consideradas as principais fontes de poluição dos corpos d´água. Tal poluição contribui para o enriquecimento dos corpos hídricos em relação aos nutrientes. Isto, combinado com fatores climáticos proporciona condições para a ocorrência de florações de algas que podem apresentar espécies potencialmente tóxicas. Desta forma, aumenta a preocupação com desenvolvimento de técnicas de tratamento que forneçam água de qualidade garantindo a saúde da população consumidora. Nesta pesquisa, foram preparadas águas de estudo com diferentes concentrações de microcistina, com as quais foram testados alguns processos de tratamento, em escala de bancada, que consistiram na pré-cloração, adsorção em carvão ativado em pó, coagulação/floculação, flotação por ar dissolvido e centrifugação. O fluxograma de tratamento com aplicação de carvão ativado logo após a mistura rápida foi o que apresentou melhores resultados em termos de cor aparente, turbidez e concentração residual de microcistina. Foi avaliada a influência da concentração de microcistina nos tratamentos simulados. Constatou-se que para 104,92 µg/L de microcistina a aplicação de 3,0 mg\'CL IND.2\'/L (10 segundos antes da mistura rápida) e 30 mg/L de CAP (logo após a mistura rápida) não foram capazes de reduzir a concentração de microcistina para menos de 1 µg/L, conforme o limite estabelecido pela Portaria 518/04 do Ministério da Saúde. Assim, optou-se pela estimativa da dosagem mínima de carvão ativado em pó (CAP) em função da concentração inicial de microcistina das três águas preparadas. O residual de microcistina em cada água preparada, após a aplicação da dosagem estimada de CAP, foi: Água de Estudo 1 = 0,80 µg/L, Água de Estudo 2 = 0,82 µg/L e Água de Estudo 3 = 0,23 µg/L. / The disordered growth of cities, the use of planting areas near the water sources and the launch of domestic and industrial wastewater without treatment are the main sources of water bodies\' pollution. Such pollution contributes to increase the nutrient loading in the water bodies. In association with climatic factors, this enrichment of nutrient provides suitable conditions for the bloom of potentially toxic algae. Thus, increases the concern over to develop treatment techniques that provide water quality able to ensure the health of the consumer population. In this research, waters were prepared with different concentrations of microcystin and some treatments were tested in bench scale. These tests consisted in prechlorination, adsorption on powdered activated carbon, coagulation/flocculation, dissolved air flotation and centrifugation. The diagram of treatment with activated carbon application after the rapid mix showed better results of apparent color, turbidity and residual concentration of microcystin. The influence of the concentration of microcystin in the simulated treatments was evaluated. It was found that for 104.92 µg/L of microcystin the application of 3.0 mg\'CL IND.2\'/L (10 seconds before rapid mix) and 30 mg/L of PAC (after a quick mixture) were not able to reduce the concentration of microcystin to less than 1 µg/L, as the limit established by Order 518/04 of the Health Ministry. Thus, it was decided to estimate the minimum dosage of powdered activated carbon (PAC) according to the initial concentration of microcystin found in the three prepared waters. The residual concentration of microcystin in each water, after the estimated dosage application of PAC was: Water 1 = 0.80 µg/L; Water 2 = 0.82 µg/L; Water 3 = 0, 23 µg/L.

A demanda crescente de água doce de boa qualidade são problemas atuais e mundiais, além do descaso com os dejetos lançados nos ambientes aquáticos que comprometem a qualidade dos recursos hídricos. Um dos parâmetros que atesta a potabilidade da água é a presença de cianobactérias e cianotoxinas. Cianobactérias são microrganismos procariontes aeróbicos fotoautróficos que sintetizam as cianotoxinas. Estes compostos podem ser classificados de acordo com seus mecanismos de ação em hepatotóxicos, neurotóxicos e dermatotóxicos. Por sua diversidade, representam diferentes riscos não só ao ecossistema e a outros organismos dos ambientes aquáticos, como também aos seres humanos. Esse projeto visou o isolamento e cultivo de cepas de cianobactérias produtoras de toxinas para a investigação da biossíntese desses compostos. Com este intuito, foram realizadas coletas de água em três reservatórios no estado de São Paulo e um no Paraná. Cepas de cianobactérais foram isoladas, identificadas e analisadas quanto à produção de toxinas. Uma cepa de Microcystis aeruginosa (LTPNA 02) produtora de microcistinas (MC-LR, MC-RR, MC-YR, MC-LF, MC-LW e desm-MC-LR e desm- MC-RR) foi escolhida para ser estudada frente diferentes condições de cultivo e ter o seu crescimento, produção de toxinas e expressão gênica estudados. Foram utilizados os meios de cultura já referidos na literatura: ASM-1 (N:P=1, 10 e 20), MLA (N:P=10), Bold 3N (N:P=16) e BG-11 (N:P=10 e 100). Para acompanhar o crescimento, dois métodos foram utilizados: contagem de células e espectrofotometria. As toxinas foram quantificadas por LC-MS - QTrap. A análise da expressão gênica foi realizada por reação de PCR em tempo real pelo método de quantificação relativa &#916;&#916;Ct. Foi observada diferença no crescimento da cepa estudada nos diferentes meios de cultivo empregados. A contagem das células permitiu a identificação das fases logarítmica e total de crescimento. Durante a fase logarítmica, três experimentos demonstraram diferenças estatísticas quando comparadas ao controle (p<0,05). Ao se avaliar o crescimento total, quatro experimentos foram menores (p<0,01). As leituras das absorvâncias e a contagem de células demonstraram alta correlação Para ambas as leituras em 680 nm e 750 nm o coeficiente de correlação (r) esteve entre 0,93 e 0,99. A quantificação das microcistinas (MC) foi realizada por LC-MS - QTrap. Foram quantificadas as variantes MC-LR, MR-RR e MC-YR. Apesar da relação toxina/célula ser distinto para cada experimento, não representou grande variação naqueles realizados com meio ASM-1 (N:P 1; 10 e 20), meio MLA (N:P=10) e BG11(N:P=10). O experimento realizado em Bold3N (N:P=16,6) apresentou menor concentração de toxina/célula e as variantes MC-LR e MC-YR não foram detectadas. Por outro lado, o experimento realizado em BG-11 (N:P=100) apresentou a maior relação toxina por célula. Estes resultados sugerem que o excesso de nitrato seja um fator estressante para o desenvolvimento e crescimento da cepa de M. aeruginosa avaliada e ao mesmo tempo um fator estimulante para a produção das toxinas analisadas. Os experimentos que avaliaram a expressão dos genes 16S e mcyB em relação ao gene da ficocianina (controle endógeno) foram realizados em meio ASM-1 (N:P=10 e 100) e BG 11 (N:P= 10 e 100). Os parâmetros anteriores, como crescimento e produção de toxinas também foram avaliados. Novamente foram encontradas diferenças entre as fases de crescimento e produção de toxina, porém a expressão dos genes avaliados não demonstrou variação significativa entre os experimentos. Porém ambos os genes avaliados demonstraram menor expressão nos experimentos condizidos em (N:P=100). / There is a great concern these days about potable and good quality water due to the increase of the population needs and also to the arising problems with contamination caused by anthropogenic sources. The presence of cyanobacteria and cyanotoxins are some parameters that attest water potability. Cyanobacteria are prokaryotic aerobic photoautotrophic microorganisms that may synthesize cyanotoxins. These compounds can be classified as hepatotoxic, neurotoxic and dermatotoxic according to their action mechanisms. Because of their diversity, they may represent different risks, not only to their ecosystem and other aquatic living organisms, but also to human beings. The aim of this project was the isolation and cultivation of cyanotoxin-producing cyanobacteria for further investigation on the biosynthesis of these compounds. Water samples from three different reservoirs in São Paulo state and one in Paraná state were collected in order to isolate cyanobacteria strains and accomplish their identification and to evaluate the toxin production. The Microcystis aeruginosa (LTPNA 02) microcystin producer strain (MCLR, MC-RR, MC-YR, MC-LF, MC-LW, desm-MC-LR and desm-MC-RR) was chosen to be grown in different cultivation conditions and later analyzed for its growth rate, toxin production and gene expression. All culture media used in this research were chosen according to the literature: ASM-1 (N:P=1, 10 and 20), MLA (N:P=10), Bold 3N (N:P=16) and BG-11 (N:P=10 and 100). To evaluate growth rate, two techniques were used: cell counting and absorbance determination in two different wavelengths (680 nm and 750 nm). Toxins were quantified by LC-MS in a hybrid triple-quadrupole instrument (Qtrap). Gene expression was assessed by real time PCR, using the &#916;&#916;Ct relative quantification method. Cell counting allowed total growth and logarithmic phase identification. During the last, three experiments showed statistical difference from control group (p<0,05). Four experiments resulted in a lower total growth rate (p<0,05). A high correlation between cell counting and absorbance levels was found for both wavelengths tested. Correlation coefficients (r) were from 0,93 to 0,99. Three microcystin variants (MC-LR, MR-RR e MC-YR) were quantified by LC-MS. The toxin content per cell was calculated and showed no statistc variation among those experiments performed on ASM-1 (N:P 1; 10 and 20), MLA (N:P=10) and BG-11 (N:P=10). The lowest toxin/cell concentration was found for Bold3N (N:P=16,6) medium, where MC-LR and MC-YR production was not detected. On the other hand, the experiment with BG-11 (N:P=100) medium showed the highest toxin/cell content. These results suggest that high levels of nitrate in the culture medium may be a stressing factor for the development and growth of the M. aeruginosa tested strain, as well as a disturbing factor for microcystin production. Gene expression experiments regarding 16S and mycB genes using the phycocyanin gene as endogen control were performed on ASM-1 (N:P=10 and 100) and BG 11 (N:P= 10 and 100) media, along with the evaluation of growth rate and toxin production. Differences between growth rates and toxin production were once more observed, however gene expression did not show a significant variation among experiments.

Florescimentos de cianobactérias têm sido cada vez mais frequentemente detectados em reservatórios do Estado de São Paulo, especialmente naqueles da bacia do Médio rio Tietê. A presença de cianobactérias pode acarretar prejuízos à qualidade da água nestes ambientes, em razão de seu potencial tóxico à biota aquática, incluindo riscos à saúde humana. O presente estudo teve por objetivo analisar a estrutura da comunidade zooplanctônica de três reservatórios do Médio rio Tietê, SP (Barra Bonita, Bariri e Ibitinga) e sua relação com as cianobactérias presentes nas florações, com ênfase nos efeitos da toxicidade destas sobre o dafinídeo Ceriodaphnia silvestrii, uma espécie nativa. Para tanto, amostragens foram realizadas nos períodos de junho e setembro de 2008, e janeiro e maio de 2009. Foram efetuadas medições de diversos parâmetros físicos, químicos e biológicos em cada reservatório. As florações de cianobactérias foram coletadas com redes de plâncton, e armazenadas para análise e quantificação de cianotoxinas e também para a realização de ensaios ecotoxicológicos. Verificou-se que a comunidade zooplanctônica dos reservatórios é dominada por copépodos e rotíferos na maior parte das camadas de água dos reservatórios. Os copépodes Cyclopoida foram mais abundantes que os Calanoida, com grande representatividade de formas jovens (náuplios e copepoditos). A espécie de Cladocera Bosminam longirostris e grande parte das espécies de rotifera, como Brachionus calyciflorus foram frequentes em todas as represas, indicando que podem ter estratégias para coexistir com as toxinas dos blooms de cianobactérias. As concentrações de microcistinas LR foram detectadas em todas as amostras de florações dos reservatórios do médio rio Tietê, com concentrações variando e 18,2 a 100 \'mü\'g/L. Os testes de toxicidade aguda revelaram que os extratos brutos das florações de cianobactérias foram tóxicos ao dafínideo Ceriodaphnia silvestrii, provocando inibição dos movimentos natatórios mesmo em baixas concentrações de microcistina-LR, podendo portanto influenciar negativamente a biota aquática. / Cyanobacteria blooms are increasingly being detected in São Paulo state reservoirs, particularly in those of middle Tietê river basin. The presence of cyanobacteria can cause deterioration of water quality in these systems due to its potential toxicity to the aquatic biota, and also risks to human health. The aim of the present srtudy was to analyse the structure of the zooplankton community in three reservoirs placed in middle Tietê river basin, SP (Barra Bonita, Bariri and Ibitinga) and its relationships with blooms of cyanobacteria, with emphasis on its toxic effects upon the daphnid Ceriodaphnia silvestrii, a native species. Sampling was carried out in June and September 2008 and January and May 2009. Measurements of several physical, chemical and biological parameters were carried out in each reservoir. Samples of cyanobacteria blooms were taken with phytoplankton nets and properly kept for posterior analysis of species composition, cyanotoxin quantification and also for acute toxicity testing. It was found that zooplankton communities in the reservoirs are dominated by rotifers and copepods in most of the water layers sampled. The cyclopoid copepods were more abundant than calanoid ones with great representativiness of the young forms (nauplii and copepodids). The Cladocera species Bosmina longirostris and some species of Rotifera as Brachionus calyciflorus were frequent in all reservoirs, indicating that they might have strategies to cope with the cyanobacteria bloom toxicity. Microcystin LR concentrations were detected in all samples of blooms from Middle Tietê River reservoirs with concentrations varying from 18,2 to 100 \'mü\'g/ L. Acute toxicity tests revealed that raw extracts from cyanobacteria scums were toxic to the daphnid Ceriodaphnia silvestrii, causing immobilization of natatory movements even at low LR microcystin concentrations, thus negatively affecting the aquatic biota.

The investigation presented in this thesis examined the microbial and functional diversity of the meltwater ponds Fresh, Orange and Salt Ponds on the McMurdo Ice Shelf, near Bratina Island, Antarctica. These sites were chosen because of the ecological importance and absence of detailed characterisations of their diversity and function as part of Antarctica?s largest wetland. Particular focus was on cyanobacterial diversity, nitrogen fixation and secondary metabolite production. Using 16S rRNA gene and morphological analysis a large diversity of cyanobacteria (more than 22 phylotypes) was identified with high phylogenetic similarities (up to 99% sequence identity) to cyanobacteria from mats in other regions of Antarctica. In addition biogeographical distributions were identified including potentially endemic and cosmopolitan cyanobacteria. High salinities were also connected to the change and reduction of diversity. Lipid marker analyses were performed targeting hydrocarbons, ether-linked hydrocarbons, methylated fatty acid esters (FAME), wax esters, hopanols and sterols. Lipid biomarker profiles were similar to typical cyanobacteria dominated mats with major input from microorganisms including oxygenic and anoxygenic phototrophs, obligate aerobic and anaerobic heterotrophs that conduct the metabolic processes of fermentation, sulphate reduction, sulphate and iron-oxidation, methanogeneses. Signature lipids indicative of Chloroflexus and archaea, as well as branched aliphatic alkanes with quaternary substituted carbon atoms (BAQCs), were identified for the first time in Fresh, Orange and Salt Ponds. Based on nifH gene analysis, the nitrogen fixing diversity characterised in Orange Pond consisted of cyanobacterial Nostoc sp. as well as firmicutes, beta-, gamma- and delta-proteobacteria. Acetylene reduction assays and nifH gene RNA transcript diversity identified Nostoc sp. as a main contributor of nitrogenase activity in these ponds. Furthermore, analytical methods were used to identify the cyanobacterial secondary metabolites microcystins, although the genetic basis for this production and the toxin producer could not been identified. However non-ribosomal peptide synthetases (NRPS) and polyketide synthases (PKS) genes were identified which could be the genetic basis for novel bioactives. The use of a multi-disciplinary approach synthesis and subsequent results significantly increased our understanding of the diversity and function of microbial mat communities in the unique meltwater ponds of the McMurdo Ice shelf, Antarctica.