A mefloquina (MQ), fármaco utilizado na profilaxia e tratamento da malária ocasionada por Plasmodium falciparum resistente à cloroquina, é comercializada na forma racêmica. Apresenta disposição cinética estereosseletiva e ação farmacológica diferencial entre os enantiômeros. A maioria dos métodos analíticos desenvolvidos para análise do fármaco em plasma utiliza como técnicas de preparação das amostras, a extração líquido-líquido ou a extração em fase sólida. Por outro lado, a microextração em fase líquida (LPME), técnica recentemente desenvolvida, pode oferecer resultados bastante satisfatórios para amostras complexas, como fluidos biológicos. Portanto, o presente trabalho teve por finalidade o desenvolvimento e validação de um método analítico empregando a cromatografia líquida de alta eficiência com fases estacionárias quirais juntamente com a LPME para a análise enantiosseletiva da MQ em plasma. Empregando-se a coluna Chiralpak AD com fase móvel constituída por hexano/etanol/DEA (97:3:0,05, v/v/v), obteve-se a separação dos enantiômeros da MQ, com tempos de retenção reduzidos e resolução apropriada. Utilizando-se uma membrana capilar de polipropileno, juntamente com éter diexílico (fase orgânica) e ácido perclórico 10 mmol L-1 (fase aceptora) como componentes do sistema de três fases, obteve-se excelente isolamento dos interferentes endógenos aliado a um enriquecimento satisfatório dos analitos, sendo então possível a validação do método desenvolvido. A metodologia otimizada apresentou linearidade satisfatória no intervalo de 50 ? 1500 ng mL-1 com coeficientes de determinação > 0,998 para ambos enantiômeros. Os valores de recuperação absoluta de (-)-(SR)-MQ e (+)-(RS)-MQ foram 33,2% e 35,0%, respectivamente. Precisão e exatidão, avaliadas por estudos intra-ensaio e interensaio, foram < 15% para ambos enantiômeros. Além disso, não foram observadas racemização ou degradação do fármaco durante a preparação das amostras e análise cromatográfica. Posteriormente, o método desenvolvido e validado foi aplicado em um estudo-piloto de disposição cinética em ratos. Verificou-se que a disposição cinética da MQ em ratos foi estereosseletiva, já que maiores concentrações de (+)-(RS)-MQ foram obtidas em todos os tempos de análise avaliados. / Mefloquine (MQ), a drug used for prophylaxis and treatment of malaria caused by chloroquine-resistant strains of Plasmodium falciparum, is commercialized as a racemic mixture. MQ enantiomers demonstrate differential stereoselective dispositions and pharmacodynamic actions. The majority of methods developed for the determination of mefloquine in plasma includes liquid-liquid or solid-phase extraction as sample preparation. On the other hand, liquid-phase microextraction (LPME), a recently developed technique, may offer satisfactory results for complex matrices, such as biological fluids. Therefore, the aim of this work was to develop and validate an analytical method using chiral high-performance liquid chromatography combined with LPME for the enantioselective analysis of MQ in plasma. Employing a Chiralpak AD column with hexane/ethanol/DEA (97:3:0.05, v/v/v) as mobile phase, separation of MQ enantiomers was achieved with short retention times and appropriate resolution. Using a polypropylene-based capillary membrane together with di-n-hexyl ether (organic phase) and 10 mmol L-1 perchloric acid (acceptor phase) as components of a three-phase system, an excelent clean-up of endogenous interferents, allied with a satisfactory enrichment of analytes, was obtained, which allowed method validation. The optimized methodology exhibited good linearity over a 50 - 1500 ng mL-1 range with correlation coefficients of > 0.998 for both enantiomers. The mean recoveries of (-)-(SR)-MQ and (+)-(RS)-MQ were 33.2 and 35.0%, respectively. Precision and accuracy, demonstrated by within-day and between-day assays, were lower than 15% for both enantiomers. Furthermore, no racemization or degradation were seen during sample preparation and chromatographic analysis. Finally, the developed and validated method was applied to a pilot pharmacokinetic assay in rats. An enantiosselective kinetic disposition of MQ enantiomers was observed in rat plasma, as concentrations of (+)-(RS)-MQ were greater than its antipode at all measured times.

Foi desenvolvido um método para determinar canabinóides (canabidiol, canabinol e delta-9-tetraidrocanabinol) no cabelo. Uma amostra de 10mg foi descontaminada com diclorometano, seguida de digestão alcalina, microextração em fase sólida por headspace (HS-SPME) e analisada por espectrometria de massa associada à cromatografia em fase gasosa (GC/MS). Os limites de detecção e de quantificação foram de 0,07 e 0,12 ng/mg, respectivamente, para todos canabinóides estudados. O método demonstrou ser simples, rápido, preciso e linear no intervalo de 0,12 a 12 ng/mg (r2 > 0,98). Amostras de cabelo de 8 usuários de Cannabis foram coletadas de pacientes provenientes de uma clínica dependentes pela equipe médica. O método mostrou-se eficiente em amostras de cabelos de usuários que faziam uso da droga pelo menos 10 vezes por semana. / A method was to develop to detect cannabinoids (cannabidiol, cannabinol and delta-9-tetrahydrocannabinol) in hair. A 10 mg of hair sample was descontaminated by dichloromethane followed by alkalin digestion, headspace solid-phase microextraction technique (HS-SPME) and analyzed by gas chromatography-mass spectrometry (CG/MS). The detection and quantitation limits were 0,07 and 0,12ng/mg respectively for all studied cannabinoids. The method proved to be simple, fast, precise and linear at the range of 0,12 to 12ng/mg (r2 > 0,98). Eight hair samples of Cannabis user were collected from patients at admittance from a dependence clinic by clinical staff. The method showed efficient in samples of users who use the drug at least 10 fold a week.

O Bisfenol A (BPA, acrônimo da língua inglesa - bisphenol A) é uma substância utilizada na fabricação de embalagens alimentícias e resinas odontológicas. Sua toxicidade deve-se ao fato de que, como disruptor endócrino, afeta o sistema reprodutor, cardiovascular, neuro-endócrino e pode apresentar potencial carcinogênico. Em métodos bioanalíticos, o preparo da amostra tem sido requerido para aumentar a seletividade e sensibilidade analítica, através da remoção dos interferentes da amostra biológica e concentração dos analitos, quase sempre presentes em níveis de traços. A microextração em ponteiras (DPX, acrônimo das iniciais em língua inglesa - Disposable Pipette Extraction), baseada no equilíbrio de sorção do soluto com a fase extratora, consiste em uma ponteira padrão de micropipeta modificada, na qual o sorvente está contido livremente entre dois filtros, permitindo rápida extração do analito em diferentes matrizes complexas. Os polímeros de impressão molecular (MIP acrônimo das iniciais em língua inglesa - Molecularly Imprinted Polymer) consistem em uma rede polimérica tridimensional que possui cavidades seletivas para o reconhecimento molecular do analito ou de substâncias de estrutura análoga. Essa rede polimérica é sintetizada ao redor da substância molde (analito), e a cavidade seletiva é formada após a remoção do molde. As vantagens do processo sol-gel para a síntese do MIP são o controle do tamanho e forma das partículas, ajuste da hidrofobicidade e alta estabilidade térmica. No presente trabalho, o MIP foi sintetizado e utilizado como sorvente para a técnica DPX para a determinação de bisfenol A em amostras de urina por cromatografia em fase gasosa acoplada à espectrometria de massas (GC-MS, acrônimo das iniciais em língua inglesa - Gas Chromatography coupled to Mass Spectrometry). O MIP foi sintetizado pela via sol-gel utilizando aminopropiltrietoxisilano (APTES) como mônomero funcional e tetraetil-orto-silicato (TEOS) como reagente de ligação cruzada. Como molde foram avaliados o BPA para o MIP, e o tetrabromobisfenol A (TBBPA) para o polímero molecularmente impresso com molécula análoga ao analito (DMIP, acrônimo das iniciais em língua inglesa - Dummy Molecularly Imprinted Polymer). Para avaliar a seletividade do MIP, o polímero não impresso (NIP, acrônimo das iniciais em língua inglesa - Non-imprinted Polymer) foi sintetizado seguindo o mesmo procedimento de síntese do MIP com exceção da adição da molécula molde. Apesar de a capacidade de sorção do MIP ser ligeiramente maior, o DMIP foi selecionado como sorvente para minimizar o efeito de memória. O DMIP foi caracterizado por microscopia eletrônica de varredura (MEV) e por espectroscopia vibracional na região do infravermelho por transformada de Fourier (FTIR, acrônico das inicias em língua inglesa - Fourier Transform Infrared). Os parâmetros da técnica DPX, tais como, o tempo de equilíbrio de sorção entre a amostra e o sorvente e condições de dessorção foram otimizadas por técnicas quimiométricas. A robustez do DMIP sintetizado via sol-gel foi comprovada pela reutilização deste sorvente por mais de 100 vezes, sem perda da eficiência da extração. O método desenvolvido DPX/GC-MS apresentou linearidade na faixa de 50 a 500 ng mL-1, precisão com CV (coeficientes de variação) entre 4 e 14% e de exatidão com valores de erro padrão relativo (EPR) de -13,6 a 12,3%. O método de referência utilizando a extração líquido-líquido e GC-MS (LLE/GC-MS), faixa de linearidade de 5 a 50 ng mL-1, foi desenvolvido e validado. Embora o método DPX/GC-MS inovador, quando comparado ao LLE/GC-MS, tenha apresentado maior limite de quantificação, apresentou as seguintes vantagens: simplicidade, rapidez e utilização de menores volumes de amostra e de solventes orgânicos na etapa do preparo da amostra / Bisphenol A (BPA) is widely used in food package and dental resins manufacturing. Its toxicity is due to its endocrine disruptor activity that affects the reproductive, cardiovascular, neurological system and may have carcinogenic potential. In bioanalytical methods the sample preparation has been required to increase the selectivity and analytical sensibility by removing the interfering from the biological matrix and concentration of the analytes that are in trace levels most of the times. The disposable pipette extraction (DPX) is based on sorption equilibrium of the analyte between the sample and the extraction phase. It consists in a pipette that contais the sorbent phase freely between two filters. Then, the extraction of the solute from the complex sample occurs quickly. Molecularly imprinted polymer is a tridimensional polimeric network that has selectivity cavities that can recognize an analyte or a substance with a similar structure. The polimeric network is synthesized around to a template molecule and after removing this template, a selective cavity is formed. The advantages of the sol-gel process for the synthesis of MIP are the control of the size and shape of the particles, hydrophobicity adjustment and high thermal stability. In the present study MIP was synthesized and used as sorbent to DPX method for determination of BPA in urine samples by gas chromatography coupled to mass spectrometry (GC-MS). Sol-gel methodoly was used to synthesize the polymers. Aminopropyltriethoxysilane (APTES) was used as a functional monomer and tetraethyl orthosilicate (TEOS) as crosslinking reagent. BPA and tetrabromobisphenol A (TBBPA) were evaluated as template to the synthesis of MIP and dummy molecularly imprinted polymer (DMIP) which is a molecularly imprinted polymer that uses a template structurally similar to the analyte. The non-imprinted polymer (NIP) was synthesized following the same procedure that MIP, except for the addition of template. It was made to verify the improvement of selectivity and sensibility of molecularly imprinted polymers. Although the sorption capacity of the MIP is slightly larger, DMIP has been selected as a sorbent in order to minimize the memory effect. The DMIP was characterized by Scanning Electron Microscopy (SEM) and Fourier Transform Infrared spectroscopy (FTIR). The parameters of DPX, such as time sorption equilibrium between the sample and the sorbent and desorption conditions were optimized by chemometrics. Robustness of DMIP sinthesized by sol-gel process was evidenciated for the reuse of DMIP for more than a 100 times. The developed method DPX/GC-MS showed linearity on the range from 50 to 500 ng ml-1, precision values with coefficient of variation (CV) betweeen 4 and 14% and accuracy with relative standard deviation values (RSD) from -13.6 to 12.3%. The reference method using liquid- liquid extraction and GC-MS (LLE/GC-MS) was developed and validated, showing linearity from 0.5 to 50 ng mL-1. Althout the innovative method DPX/GC-MS has showed limit of quantification larger than LLE/GC-MS, it presents the following advantages: simplicity, rapidy and utilization of smaller volumes of organic solvents on the sample preparation step

Estudos de metabolismo in vitro possuem o intuito de caracterizar e quantificar possíveis metabólitos, elucidar as vias metabólicas e sugerir modelos a serem seguidos para a realização de estudos in vivo. Com o intuito de estudar o metabolismo in vitro não estereosseletivo da rosiglitazona (RSG) empregando fração microssomal de fígado de ratos,foi desenvolvida uma metodologia por cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) com detecção UV em 245 nm, para analisar a RSG e seus principais metabólitos, p-hidroxi rosiglitazona (?-OH-R) e N-desmetil rosiglitazona (N-Dm-R). Os analitos foram separados em fase reversa, utilizando uma coluna X-Terra MS C-18 (partículas de 3,5 ?m) e fase móvel composta por água:acetonitrila:ácido acético (85:15:0,5, v/v/v), na vazão de 1 mL min-1. Matrizes biológicas contém um grande excesso de proteínas, lipídeos e outros materiais endógenos que interferem na análise de fármacos e metabólitos, tornando necessário um procedimento adequado de preparação das amostras antes da análise cromatográfica. A microextração em fase líquida com membrana cilíndrica oca (HF-LPME) é uma técnica promissora para a preparação de amostras em estudos de metabolismo in vitro, pois, além de promover o clean-up, promove também o enriquecimento dos analitos na amostra. A HF-LPME foi aplicada pela primeira vez para a extração simultânea desse fármaco e seus metabólitos. O sistema de três fases foi escolhido como o mais apropriado, empregando uma solução de ácido clorídrico como fase aceptora e 1-octanol como solvente orgânico. A otimização dos demais parâmetros foi realizada através de planejamento fatorial fracionário. O método foi validado e foi linear no intervalo de 50-6000 ng mL-1, apresentando limites de quantificação de 50 ng mL-1 e recuperações acima de 47 % para a RSG e seus metabólitos (?-OH-R e N-Dm-R). O método validado foi empregado em um estudo de metabolismo in vitro com fração microssomal de fígado de ratos. Nesse estudo, foi possível estimar as constantes de Michaelis-Menten (Km) e a velocidade inicial máxima (Vmax). N-Dm-R e ?-OH-R apresentaram valores de Vmax de 87,30 ± 8,04 e 51,64 ± 12,25 ?mol min-1 mg proteína-1, respectivamente, enquanto que os valores de Km foram de 58,14 ± 11,85 e 77,84 ± 36,77 mmol L-1, respectivamente. Outros metabólitos foram observados nos cromatogramas e a identificação foi feita por espectrometria de massas: ?rto-hidroxi-rosiglitazona e N-desmetil-hidroxi-rosiglitazona. A RSG é comercializada como uma mistura racêmica, apesar de possuir sua atividade antidiabética relacionada essencialmente com o enantiômero (S). O centro quiral desse fármaco possui um grupo carbonila, por isso, o enantiômero (R) pode se converter no enantiômero (S) ou vice-versa, via tautomerismo cetoenólico. Dados da literatura indicavam que essa racemização poderia ser lenta o suficiente para possibilitar o estudo dos enantiômeros isoladamente. Entretanto, até o momento não há dados sobre a disposição cinética ii e metabolismo enantiosseletivos desse fármaco. Sendo assim, propôs-se o desenvolvimento de metodologias analíticas para estudar a racemização da RSG e seus metabólitos e avaliar a possibilidade de estudar seu metabolismo in vitro de forma estereosseletiva. O método foi desenvolvido empregando HPLC com detecção em 245 nm. A separação dos enantiômeros do fármaco e metabólitos, também quirais, foi obtida empregando uma coluna Chiralcel OJ-H e fase móvel constituída por metanol:etanol (90:10; v/v), na vazão de 0,3 mL min-1. O estudo de racemização mostrou que o fármaco e seus metabólitos são racemizados nas condições em que o estudo de metabolismo é conduzido. Finalmente, para estudar o metabolismo in vitro da pioglitazona (PGZ), foi desenvolvido um método para análise desse fármaco e de seus principais metabólitos, a hidroxi-pioglitazona (M-IV) e a ceto-pioglitazona (M-III) empregando a eletroforese capilar (CE). As análises foram realizadas em capilar de sílica de 50 ?m de diâmetro interno e com comprimento efetivo de 40 cm, utilizando tampão fosfato de sódio 50 mmol L-1, pH 2,5, detecção em 190 nm, tensão de 30 kV e temperatura do capilar de 35 °C. A HF-LPME também foi empregada para a preparação das amostras. O sistema de três fases foi escolhido, empregando solução de ácido clorídrico como fase aceptora e o 1-octanol como solvente orgânico. A otimização dos demais parâmetros foi realizada através de planejamento fatorial fracionário. O método validado foi linear no intervalo de 200 - 25000 ng mL-1 para PGZ e 200 - 2000 ng mL-1 para os metabólitos, apresentando limites de quantificação de 200 ng mL-1 e recuperações acima de 19 % para a RSG e seus metabólitos M-IV e M-III. O método validado foi empregado em um estudo de metabolismo in vitro contendo fração microssomal de fígado de ratos, mas nesse estudo, não foi possível observar a formação dos metabólitos. Entretanto, esse método pode ser usado em outros modelos de metabolismo in vitro (microssomas humanos), nos quais se observa a formação desses metabólitos em concentrações maiores. / In vitro metabolism studies have been used to characterize and to quantify possible metabolites, to elucidate metabolic pathways and to suggest models to perform in vivo studies. So the purpose of this study was to evaluate the in vitro rosiglitazone (RSG) metabolism employing microsomal fraction obtained from rat livers. A high- performance liquid chromatography (HPLC) method with UV detection at 245 nm was developed to analyze RSG and the main metabolites, p-hydroxy rosiglitazone (?-OH-R) e N-desmethyl rosiglitazone (N-Dm-R). The analytes were separated under reversed phase conditions, using a X-Terra MS C-18 column (3.5 ?m particle size) and a mobile phase consisting of water:acetonitrile:acetic acid (85:15:0.5, v/v/v), at a flow rate of 1 mL min-1. Biological matrices contain a large excess of proteins, lipids and other endogenous compounds that interfere in the analysis of drugs and metabolites. So, a suitable sample preparation technique is required. Hollow-fiber liquid phase microextraction (HF-LPME) is a promising technique for the preparation of biological samples. Besides the clean-up, analytes enrichment is also achieved. HF-LPME for the simultaneous analysis of RSG and its main metabolites is described for the first time. The three-phase extraction was performed using hydrochloride acid solution as acceptor phase and 1-octanol as organic solvent. The other parameters were optimized by fractional factorial design. The method was validated and it was linear over the concentration range of 50-6000 ng mL-1, with quantification limits of 50 ng mL-1 and recoveries above 47 %. The validated method was used to estimate Michaelis-Menten (Km) constant and maximum initial velocity (Vmax). N-Dm-R e ?-OH-R showed Vmax values of 87.30 ± 8.04 and 51.64 ± 12.25 ?mol min-1 mg protein-1, respectively, while the Kmvalues were 58.14 ± 11.85 e 77.84 ± 36.77 mmol L-1, respectively. Other possible metabolites were observed in the chromatograms and they were identified by mass spectrometry: ?rtho-hydroxy-rosiglitazone e N-desmethyl-hydroxy-rosiglitazone. RSG is marketed as a racemic mixture although the antidiabetic activity is related essentially to the (S)-enantiomer. The chiral center has a carbonyl group, therefore the (R)-enantiomer could be transformed to the (S)-enantiomer or vice-versa by keto-enolic tautomerism. The literature indicates that this racemization is slow enough to allow the evaluation of the properties of the isolated enantiomers. However, there is no information in the literature about enantioselective RSG kinetic disposition and metabolism. Considering this facts, an analytical procedure was developed to study the racemization of RSG and its metabolites under different conditions and to determine if the enantioselective metabolism would be performed. The method was developed by HPLC with detection at 245 nm. The chiral separation of RSG and metabolites was achieved on a Chiralcel OJ-H column, with the mobile phase consisting of methanol:ethanol (90:10,v/v). The results obtained showed that the racemization occurs under the conditions used in in vitro iv metabolism studies. Finally, to study the in vitro metabolism of pioglitazone (PGZ), another method was developed by capillary electrophoresis (CE) to determine this drug and its main metabolites, hydroxy-pioglitazone (M-IV) and keto-pioglitazone (M-III). The analyses were conducted using a fused silica capillary (50 ?m inner diameter and 40 cm effective length), sodium phosphate buffer 50 mmol L-1, pH 2.5, detection at 190 nm, voltage of 30 kV and capillary temperature of 35°C. HF-LPME was also used for sample preparation with hydrochloride acid solution as acceptor phase and 1-octanol as organic solvent. The other parameters were optimized by fractional factorial design. The method was validated showing to be linear in the concentration range of 200 - 25000 ng mL-1 for PGZ and 200 - 2000 ng mL-1 for the metabolites. Quantification limits were 200 ng mL-1 for all analytes and the recoveries were higher than 19%. The validated method was used to study the in vitro metabolism of PGZ by rat liver microsomal fraction, but it was not possible to observe the formation of the metabolites in this study. However this method could be used in other in vitro metabolism models (human microssomes), in which higher concentrations of these metabolites are observed. Keywords:

Esta tese apresenta o desenvolvimento de procedimentos analíticos em sistemas de análises em fluxo com multicomutação para a determinação de anti-hipertensivos. A determinação de captopril foi baseada na redução de Cu(II) na presença do fármaco, seguida da reação de Cu(I) com sal dissódico de 4,4-dicarboxi-2,2-biquinolina (BQA). O procedimento apresentou frequência de amostragem de 47 determinações/h, com coeficiente de variação de 2,2% (n=20) e consumo de 290 &#181;g de BQA por determinação. Os resultados das análises das amostras foram concordantes com os obtidos por titulação iodométrica. O procedimento foi aplicado à construção de curvas de dissolução de medicamentos utilizando-se um aparato alternativo, sendo os resultados concordantes com a literatura. A determinação de diltiazem foi realizada pela reação entre o fármaco e ClO-, seguida da reação de N,N-dietil-p-fenilenodiamina (DPD) com o ClO- remanescente. A metodologia apresentou limite de detecção de 7,0 &#181;mol/L, frequência de amostragem de 34 determinações/h e coeficiente de variação de 0,9% (n=10), porém a aplicação foi dificultada por efeitos de matriz. Um procedimento baseado na microextração líquido-líquido do par iônico formado entre diltiazem e azul de bromotimol em meio ácido foi então desenvolvido. Foram obtidos limite de detecção de 0,9 &#181;mol/L, frequência de amostragem de 78 determinações/h e eficiência de extração de 60%. O consumo de CHCl3 foi de apenas 50 &|#181;L, gerando 383 &#181;L de resíduo por determinação. Resultados da análise das amostras foram concordantes com o procedimento de referência. Microextração líquido-líquido do par iônico formado entre losartana e alaranjado-II em meio ácido foi empregada para a determinação do fármaco. A frequência de amostragem foi de 77 determinações/h, com coeficiente de variação de 0,9% (n=10) e consumo de CHCl3 de 150 &#181;L por determinação. Porém, diferentemente do observado no procedimento análogo em batelada, foram observados problemas relacionados à seletividade do procedimento. / This thesis focused the development of flow-based analytical procedures exploiting multicommutation for the determination of anti-hypertensive drugs. The reduction of Cu(II) in the presence of captopril, followed by the reaction of Cu(I) with 4,4-dicarboxy-2,2-bichinoline disodium salt (BCA) was employed for captopril determination. The procedure showed a sampling rate of 47 determinations per hour, coefficient of 2.2% (n = 20) and consumption of 290 &#181;g BCA per determination. The results for pharmaceutical samples agreed with those obtained by iodometric titration. The procedure was applied to dissolution studies of pharmaceutical preparations using an alternative apparatus, yielding results in agreement with the literature. One of the analytical procedures for diltiazem determination was based on the reaction between the drug and ClO-, followed by the reaction between N,N-diethyl-p-phenylenediamine (DPD) and the remaining ClO-. The methodology showed a detection limit of 7.0 &#181;mol/L, sampling rate of 34 determinations per hour and coefficient of variation of 0.9% (n = 10), but application was hindered by matrix effects. Thus, on-line liquid-liquid microextraction was evaluated, based on the ion pair formation between diltiazem and bromothymol blue in acidic medium. Detection limit of 0.9 &#181;mol/L, sampling rate of 78 determinations per hour and extraction efficiency of 60% were attained. The CHCl3 consumption was only 50 &#181;L, with waste generation of 383 &#181;L per determination. The results for diltiazem determination in commercial pharmaceutical preparations agreed with the reference procedure. Finally, a procedure for losartan determination was developed based on flow injection liquid-liquid microextraction of the ion pair formed between the drug and orange-II in acidic medium. Sampling rate of 77 determinations per hour and coefficient of variation of 0.9% (n = 10) were achieved, consuming 150 &#181;L of CHCl3 per determination. However, selectivity was poor, differently that observed in the analogous batch procedure.

As drogas facilitadoras de crime (DFC) são uma série de substâncias químicas que permitem o ato sexual e/ou roubo com pouca ou nenhuma resistência da vítima. Benzodiazepínicos, gama-hidroxibutirato (GHB), cetamina e etanol são clássicas DFC, porém outras substâncias também têm sido utilizadas. Devido às diferentes classes de DFC e a necessidade de métodos sensíveis, a determinação dessas substâncias é um desafio aos toxicologistas forenses. A proposta do estudo foi desenvolver métodos analíticos para determinação principais analitos alvos de DFC para benzodiazepínicos, cetamina e GHB em amostras de urina. Esta matriz biológica é considerada uma amostra não-invasiva e apresenta um período de detecção maior que o sangue. A preparação das amostras foi avaliada através de microextração em fase líquida (LPME) e extração líquido-líquido (LLE). A LPME é uma técnica de extração de drogas que utiliza menor quantidade de solventes orgânicos, maior praticidade e possibilidade de obtenção de altos valores de recuperação. Os analitos foram determinados por cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas (GC-MS). A LPME validada para benzodiazepínicos e seus produtos de biotransformação exigiu uma combinação de solventes e dupla derivatização para atingir a sensibilidade exigida, enquanto o método para determinação de cetamina, norcetamina e deidronorcetamina utilizou óleo essencial de eucalipto como meio extrator, caracterizando-se um procedimento ecologicamente correto com alta sensibilidade. A extração de GHB foi efetiva por LLE com redução da quantidade de solvente e tempo de análise sem o prejuízo na sensibilidade. Em geral, os métodos desenvolvidos neste trabalho são sensíveis e confiáveis para todos os analitos relatados e conclui-se que a LPME é uma técnica de preparo de amostra eficiente, versátil de baixo custo. Estas condições permitem que sua implementação em qualquer laboratório de análises toxicológicas, podendo ser aplicada em situações de DFC ou de qualquer outra natureza. / Drug-facilitated crime (DFC) are a series of chemicals that allow the sexual act and/or theft with little or no resistance from the victim. Benzodiazepines, gamma-hydroxybutyrate (GHB) and ketamine and ethanol are considered classic DFC, however other substances were also used as the DFC. Due to the different classes of DFC and the need for sensitive methods, the determination of these substances is a challenge to forensic toxicologists. The purpose of this study was to develop analytical methods for determination of the main target analytes of DFC for benzodiazepines, ketamine and GHB in urine samples. This biological matrix is considered a non-invasive sample and shows a larger window of detection than blood. Sample preparation was assessed using liquid phase microextraction (LPME) and liquid-liquid extraction (LLE). The LPME is a drug extraction technique that uses less organic solvents, greater practicality and possibility of obtaining high recovery values. The analytes were determined by gas chromatography - mass spectrometry (GC-MS). The validated LPME technique for benzodiazepines and their metabolites required a combination of solvents and double derivatization to achieve the required sensitivity, while the ketamine, norketamine and dehydronorketamine method used essential oil of eucalyptus as solvent, characterizing a green chemistry approach with high sensitivity. The extraction of GHB was effective by LLE with a reduced amount of solvent and the analysis time without loss in sensitivity. In general, the methods developed in this work using GC-MS are sensitive and reliable for all analytes reported and LPME technique showed to be an efficient sample preparation, versatile and low cost. These conditions allow LPME implementation in any laboratory of toxicological analysis and it can be applied in situations of DFC or any other kind of analysis.

Este trabalho descreve o desenvolvimento de seletivas fases extratoras para técnicas de microextração empregadas para a determinação de fármacos e endocanabinóide em amostras de plasma por cromatografia líquida acoplada a espectrometria de massas em Tandem (LC-MS/MS). O capítulo I descreve o desenvolvimento e aplicação da fase extratora de material de acesso restrito (RAM) para a extração em ponteiras descartáveis (DPX) de dezesseis fármacos psicotrópicos em amostras de plasma de pacientes esquizofrênicos. Em virtude da complexidade de sintomas associados à esquizofrenia, a politerapia tem sido uma prática clínica cada vez mais comum. A maioria destes fármacos possui estreito índice terapêutico, o que requer acompanhamento adequado por meio de estudos de monitorização terapêutica. Tais estudos visam otimizar as doses terapêuticas, minimizar os efeitos adversos e avaliar a anuência do paciente ao regime de dosagens. O emprego da fase seletiva, RAM, permitiu a exclusão das macromoléculas, simultaneamente, a pré-concentração dos analitos de forma rápida e eficiente. A otimização das variáveis DPX favoreceu a sensibilidade e seletividade do método, empregando pequenos volumes de amostra biológica e de solvente orgânico. O método DPX/LC-MS/MS, desenvolvido e validado, apresentou linearidade adequada com limite inferior de quantificação na faixa de concentração de 0,5-20,0 ng mL-1, precisão inter e intra-ensaio com coeficientes de variação inferiores a 15% e exatidão com valores de EPRs variando de -12% a 11%. O método proposto foi aplicado com êxito na determinação destes fármacos em amostras de plasma de pacientes esquizofrênicos. As variações encontradas nas concentrações plasmáticas de alguns pacientes podem ser atribuídas a interações farmacocinéticas ou a variações inerentes ao paciente. No capítulo II, um polímero molecularmente impresso foi sintetizado in situ, no interior de um capilar de sílica fundida, para microextração em fase sólida no capilar (in-tube SPME) do endocanabinóide, anandamida (AEA), em amostras de plasma de pacientes com Doença de Parkinson (DP). A DP é caracterizada pela neurodegeneração dos neurônios dopaminérgicos. Estudos demonstram correlação entre os sistemas endocanabinóide e dopaminérgico, ligados ao controle motor. O processo de impressão molecular (não-covalente) do MIP, bem como os reagentes de síntese empregados, originaram sítios seletivos, complementares, em forma e tamanho à AEA. Micrografias eletrônicas de varredura (MEV) e espectros de infravermelho (FTIR) ilustraram as modificações físicas e químicas da superfície do capilar impresso e não impresso (NIP), após a polimerização. A otimização das variáveis in-tube SPME, favoreceu a eficiência das extrações. O método in-tube SPME/LC-MS/MS apresentou intervalo linear de 5 ng mL-1 (LOQ) a 20 ng mL-1; os ensaios de precisão apresentaram CV variando de 1,2 a 13% e exatidão com valores de EPRs variando de -3,6 a 7,5 %. Amostras de plasma de pacientes com DP foram analisadas pelo método de adição de padrão, e a concentração plasmática média de AEA de 0,2 ng mL-1, está em concordância com os valores da literatura, demonstrando a aplicabilidade do método in-tube SPME/LC-MS/MS na área clínica. / This work describes the development of highly selective sorbents for use in microextraction techniques for determination of drugs and endocannabinoid in plasma samples by liquid chromatography coupled to Tandem mass spectrometry (LC-MS/MS). Chapter I describes the development and application of a restricted access material (RAM-BSA) for use as extractive phase in DPX technique (\"Disposable pipette extraction\") for determination of 16 psychotropic drugs in plasma samples obtained from schizophrenic patients. Polytherapy has been increasingly common in clinical practice associated with schizophrenia due the complexity of its symptoms. Most of these drugs have narrow therapeutic index, wherefore requires adequate follow-up through therapeutic monitoring studies. This monitoring aims to optimizing therapy, to minimize adverse effects and verify patient adherence to treatment. By using a selective phase, RAM, we were able to exclude the macromolecules and to pre-concentrate the analytes quickly and efficiently. Optimization of the DPX variables improved the sensitivity and selectivity of the method, which demanded only small volumes of sample and organic solvent. The DPX/LC-MS/MS method developed and validated presented adequate linearity; the lower limit of quantification ranged from 0.5 to 20.0 ng mL-1. The inter- and intra-assay precision tests provided coefficients of variation (CV) lower than 15%; and the relative standard error (RSD) values, of the accuracy tests, varied from -12% to 11%. We successfully applied the proposed method to determine drugs in plasma samples from schizophrenic patients. Variations in the plasma concentrations of drugs in some patients may result from pharmacokinetic interactions or variations inherent in the patient. Chapter II details the \"in situ\" synthesis of a molecularly imprinted polymer within a fused silica capillary for capillary solid phase (in-tube SPME) of the endocannabinoid, anandamide (AEA), in plasma samples obtained from patients with Parkinson\'s Disease (PD), which is characterized by neurodegeneration of dopaminergic neurons. Studies have demonstrated a relationship between this endocannabinoid and dopaminergic systems, which are linked to motor control. The molecular imprinting process (non-covalent) and the synthesis reagents used to obtain the MIP gave rise to complementary, selective sites with the same shape and size as AEA. Scanning electron micrographs (SEM) and infrared spectra (FTIR) helped to illustrate the physical and chemical modification of the printed and non-printed capillary surface (NIP) after polymerization. Optimization of in-tube SPME variables favored the extraction process efficiency. The \"in tube\" SPME/LC-MS/MS method showed a linear range from 5 ng mL-1 (LOQ) to 20 ng mL-1. The precision tests presented CV that varied from 1.2 to 13%; and the RSD accuracy ranged from -3.6 to 7.5%. We analyzed plasma samples from patients with PD by the standard addition method. The mean plasmatic concentration was 0.2 ng mL-1, in agreement with the literature. This resut suggested that the \"in tube\" SPME/LC-MS/MS employing the MIP extractive phase is suitable to determine AEA in plasma samples

Este trabalho apresenta o desenvolvimento de diferentes métodos para a determinação de fluoxetina, norfluoxetina e bisfosfonatos, utilizando técnicas modernas de preparo de amostras. Dentre eles, um método simples e sensível, empregando microextração em fase sólida (SPME) e cromatografia líquida foi desenvolvido para a análise de fluoxetina e norfluoxetina em plasma. As condições de SPME foram otimizadas empregando planejamento fatorial. A extração foi realizada utilizando fibras com PDMS-DVB, e a etapa de dessorção foi realizada em uma nova interface homemade com sistema de aquecimento. Extração com sorção em barra de agitação (SBSE) com derivatização in-situ, combinada com dessorção com solventes ou dessorção térmica, acoplada à cromatografia gasosa e espectrometria de massas (GC-MS), foi também empregada para a determinação de fluoxetina em plasma. Avaliou-se a derivatização dos analitos in situ com cloroformato de etila, bem como os parâmetros tempo de extração, solvente e tempo de dessorção. A combinação de SBSE e LC-MS foi também avaliada. As amostras de plasma foram submetidas à precipitação de proteínas com ácido tricloroacético, extraídas com SBSE, e analizadas por LC-MS. Os métodos SPME-LC, SBSE-GC e SBSE-LC desenvolvidos foram completamente validados, demonstrando serem adequados para analisar fluoxetina em amostras de plasma. Métodos rápidos para a determinação de etidronato, clodronato, pamidronato e alendronato, baseados em cromatografia de troca iônica com detecção indireta no ultravioleta, foram também desenvolvidos. Os métodos são simples e demonstraram precisão, exatidão e especificidade. Além disso, os métodos validados empregam colunas de sílica, mais baratas e de mais disponibilidade do que as colunas poliméricas, frequentemente utilizadas em métodos descritos na literatura para o mesmo propósito. / This study describes different methods to analyze fluoxetine, norfluoxetine and bisphosphonates, employing modern sample preparation techniques. A simple and sensitive procedure using solid-phase microextraction (SPME) coupled with liquid chromatography was developed for the analysis of fluoxetine and norfluoxetine in plasma samples. SPME conditions were optimized employing a factorial design. The sampling step was performed using a PDMS-DVB fiber and desorption was carried out in a novel homemade heated interface. Stir bar sorptive extraction (SBSE) with in situ derivatization, in combination with either thermal or liquid desorption on-line coupled to gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS), was employed for the analysis of fluoxetine. In situ derivatization using ethylchloroformate was evaluated as well as parameters such as solvent polarity, time for analytes desorption, and extraction time. SBSE combined with liquid chromatography and mass spectrometry was also used to analyze fluoxetine in plasma. Plasma samples were first submitted to protein precipitation with trichloroacetic acid, subjected to SBSE, and thereafter analyzed by LC-MS. SPME-LC, SBSE-GC, and SBSE-LC methods were completely validated showing to be adequate to assess fluoxetine in plasma samples. Rapid methods for etidronate, clodronate, pamidronate and alendronate assay were also developed. The methods were based on ion chromatography with indirect ultraviolet detection, which avoids the need for chemical derivatization procedures. The methods were simple, rapid, and demonstrated precision, accuracy, and specificity. Furthermore, they employed silica-based columns, cheaper and more readily available than polymeric columns, frequently used in previous reported methods.

Segundo a Organização Mundial da Saúde (OMS), a esquizofrenia é reconhecida como um transtorno neuropsiquiátrico grave que afeta mais de 21 milhões de pessoas em todo o mundo. Para diminuir os sintomas associados a esta doença, a maioria dos pacientes esquizofrênicos fazem uso concomitantemente de antipsicóticos, antidepressivos, ansiolíticos e anticonvulsivantes. O desenvolvimento de métodos analíticos para a determinação desses fármacos em fluidos biológicos é importante para ajustar as doses administradas, minimizar os efeitos adversos e verificar a anuência do paciente à terapia. A química analítica moderna tem se direcionado para a simplificação, através da miniaturização dos sistemas analíticos. Neste contexto, pode-se destacar a técnica de microextração em sorvente empacotado (MEPS). O desenvolvimento de novas fases extratoras para MEPS, como, os monolitos de sílica híbrida permitem pré-concentração seletiva dos analitos. Neste projeto monolitos de sílica híbrida funcionalizados com grupos aminopropil ou cianopropil foram sintetizados pelo processo sol-gel. Estes monolitos apresentaram estrutura contínua, uniforme e porosa, como evidenciado pelas imagens de microscopia eletrônica de varredura (MEV). As análises de espectroscopia vibracional na região do infravermelho por transformada de Fourier (FTIR) dos monolitos de sílica híbrida exibiram picos facilmente identificáveis, característicos dos grupos cianopropil e aminopropil. Estes monolitos foram avaliados como fase estacionária para a MEPS para a determinação de fármacos em amostras de plasma por cromatografia líquida acoplada a espectrometria de massa em Tandem (LC-MS/MS). As variáveis MEPS (influência do pH na sorção dos analitos, número de ciclos aspirar/dispensar, etapa de limpeza do sorvente e solvente de eluição) foram otimizadas para aumentar a eficiência da extração. Em comparação com a fase de sílica híbrida aminopropil, a fase de sílica híbrida cianopropil apresentou maior capacidade de sorção para os fármacos em estudo. O método desenvolvido, MEPS/LC-MS/MS, empregando a fase extratora de sílica híbrida cianopropil, apresentou linearidade adequada com concentrações que variaram desde o limite inferior de quantificação (0,05-1,00 ng.mL-1) até o limite superior de quantificação (40-10.500 ng.mL-1) com coeficientes de determinação (R2) maiores do que 0,9955. Este método apresentou precisão com coeficientes de variação (CV) inferiores a 14% e exatidão com erro padrão relativo (EPR) de -12 a 14%. O método MEPS/LC-MS/MS foi aplicado com êxito para análise simultânea de cinco antipsicóticos (olanzapina, quetiapina, clozapina, haloperidol e clorpromazina), em combinação com sete antidepressivos (mirtazapina, paroxetina, citalopram, sertralina, imipramina, clomipramina e fluoxetina), dois anticonvulsivantes (carbamazepina e lamotrigina) e dois ansiolíticos (diazepam e clonazepam) em amostras de plasma de pacientes esquizofrênicos para fins de monitorização terapêutica. / According to World Health Organization (WHO), schizophrenia is recognizably a devastating neuropsychiatric disorder that affects more than 21 million people worldwide. To lessen the symptoms associated with the disease, most schizophrenic patients use other classes of drugs such as antidepressants, anxiolytics, and anticonvulsants concomitantly with antipsychotics. Developing analytical methods to quantify these drugs in biological fluids is important in therapeutic drug monitoring (TDM) to adjust doses, minimize adverse effects, and check patient adherence to the therapy. Regarding miniaturization and automation, microextraction by packed sorbent (MEPS) is a promising sample preparation technique. Sample preparation of biological matrixes is an important step in analytical processes: it removes endogenous components from the sample and pre-concentrates trace-level analytes. The development of new phases for MEPS such as the hybrid silica monoliths allows selective pre-concentration of the analytes. The present study reports on the synthesis of two hybrid silica monoliths functionalized with aminopropyl or cyanopropyl groups by the solgel process; evaluates these monoliths as selective stationary phase for MEPS to determine drugs in plasma samples by liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS); and discusses important factors (influence of pH on the sorption of analytes, number of draw/eject cycles, washing step, and elution solvent) related to the optimization of MEPS efficiency. The prepared hybrid silica monoliths consisted of a uniform, porous, and continuous silica monolithic network, as shown by scanning electron microscopy (MEV) images. The Fourier-transform infrared spectroscopy (FTIR) spectra of the hybrid silica monoliths displayed readily identifiable peaks, characteristic of the cyanopropyl and aminopropyl groups. Compared with the aminopropyl hybrid silica phase, the cyanopropyl hybrid silica phase exhibited higher binding capacity for most of the target drugs. The developed method, MEPS/LC-MS/MS, afforded adequate linearity at concentrations ranging from the lower limit of quantification (0.05 to 1.00 ng.mL-1) to the upper limit of quantification (40 to 10500 ng.mL-1); the coefficients of determination (R2) were higher than 0.9955. The precision of the method presented coefficients of variation (CV) lower than 14%; the relative standard error (RSE) of the accuracy ranged from -12 to 14%. The developed MEPS/LC-MS/MS method allowed for simultaneous analysis of five antipsychotics (olanzapine, quetiapine, clozapine, haloperidol, and chlorpromazine) in combination with seven antidepressants (mirtazapine, paroxetine, citalopram, sertraline, imipramine, clomipramine, fluoxetine), two anticonvulsants (carbamazepine and lamotrigine), and two anxiolytics (diazepam and clonazepam) in plasma samples from schizophrenic patients, which should be valuable for TDM purposes.

As drogas facilitadoras de crime (DFC) são uma série de substâncias químicas que permitem o ato sexual e/ou roubo com pouca ou nenhuma resistência da vítima. Benzodiazepínicos, gama-hidroxibutirato (GHB), cetamina e etanol são clássicas DFC, porém outras substâncias também têm sido utilizadas. Devido às diferentes classes de DFC e a necessidade de métodos sensíveis, a determinação dessas substâncias é um desafio aos toxicologistas forenses. A proposta do estudo foi desenvolver métodos analíticos para determinação principais analitos alvos de DFC para benzodiazepínicos, cetamina e GHB em amostras de urina. Esta matriz biológica é considerada uma amostra não-invasiva e apresenta um período de detecção maior que o sangue. A preparação das amostras foi avaliada através de microextração em fase líquida (LPME) e extração líquido-líquido (LLE). A LPME é uma técnica de extração de drogas que utiliza menor quantidade de solventes orgânicos, maior praticidade e possibilidade de obtenção de altos valores de recuperação. Os analitos foram determinados por cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas (GC-MS). A LPME validada para benzodiazepínicos e seus produtos de biotransformação exigiu uma combinação de solventes e dupla derivatização para atingir a sensibilidade exigida, enquanto o método para determinação de cetamina, norcetamina e deidronorcetamina utilizou óleo essencial de eucalipto como meio extrator, caracterizando-se um procedimento ecologicamente correto com alta sensibilidade. A extração de GHB foi efetiva por LLE com redução da quantidade de solvente e tempo de análise sem o prejuízo na sensibilidade. Em geral, os métodos desenvolvidos neste trabalho são sensíveis e confiáveis para todos os analitos relatados e conclui-se que a LPME é uma técnica de preparo de amostra eficiente, versátil de baixo custo. Estas condições permitem que sua implementação em qualquer laboratório de análises toxicológicas, podendo ser aplicada em situações de DFC ou de qualquer outra natureza. / Drug-facilitated crime (DFC) are a series of chemicals that allow the sexual act and/or theft with little or no resistance from the victim. Benzodiazepines, gamma-hydroxybutyrate (GHB) and ketamine and ethanol are considered classic DFC, however other substances were also used as the DFC. Due to the different classes of DFC and the need for sensitive methods, the determination of these substances is a challenge to forensic toxicologists. The purpose of this study was to develop analytical methods for determination of the main target analytes of DFC for benzodiazepines, ketamine and GHB in urine samples. This biological matrix is considered a non-invasive sample and shows a larger window of detection than blood. Sample preparation was assessed using liquid phase microextraction (LPME) and liquid-liquid extraction (LLE). The LPME is a drug extraction technique that uses less organic solvents, greater practicality and possibility of obtaining high recovery values. The analytes were determined by gas chromatography - mass spectrometry (GC-MS). The validated LPME technique for benzodiazepines and their metabolites required a combination of solvents and double derivatization to achieve the required sensitivity, while the ketamine, norketamine and dehydronorketamine method used essential oil of eucalyptus as solvent, characterizing a green chemistry approach with high sensitivity. The extraction of GHB was effective by LLE with a reduced amount of solvent and the analysis time without loss in sensitivity. In general, the methods developed in this work using GC-MS are sensitive and reliable for all analytes reported and LPME technique showed to be an efficient sample preparation, versatile and low cost. These conditions allow LPME implementation in any laboratory of toxicological analysis and it can be applied in situations of DFC or any other kind of analysis.