The success of many emerging biotechnologies depends upon the ability to tune cell function to mimic conditions found in vivo. Cells exhibit complex interactions with their surrounding environment known and the extracellular matrix (ECM). These interactions control many cell functions such as proliferation, differentiation and cell death. ECM components span the meso-, micro- and nano-length scales. Successful biotechnologies therefore must also exhibit patterning over these length scales. The objective of this study is to fabricate and analyze cell response to micro and nanopatterned polymer substrates. Experiments examined cell alignment and proliferation to various substrates. The substrates used featured micropatterned grooves and holes, micropatterned carbon nanotubes, and combinations of microgrooves and nanogrooves. Results showed significant interactions between cell alignment and the patterned topography for all substrate types, while cell proliferation showed no significant dependence on these topographic parameters.

No description available.

Developmental processes involving symmetry-breaking of homogeneous cell populations into leaders and followers are found in many important contexts. Cells constrained by culture on two-dimensional scaffolds, as well as in three-dimensional shapes, appear to respond to convex curves with an increasing propensity to protrude, while concave curves in contrast appear to inhibit protrusion. This has interesting implications in terms of a potential positive feedback loop. This feedback may act in symmetry-breaking, through amplification of initial stochastic differences in cell shape, and also in collective migration, through reinforcing and directing the coherent movement of collectives. In this study, epithelial cells were cultured on two-dimensional micropatterns with variable curvatures to examine the effect of edge geometry and other variables on the likelihood of protrusions forming. This platform allowed the quantification of F-actin-based protrusions at the periphery of multicellular epithelial clusters, in segments defined by cluster edge curvature. The initial observations confirmed reports in the literature of preferential localisation of protrusions at more convex regions, and relative inhibition at more concave regions. A previously-published work has postulated a role for secreted modulators of motility, with the shape of a group of cells determining the concentration of diffusing morphogen each individual cell is exposed to. To test this hypothesis, a low-shear flow culture chamber was used to disrupt the putative gradients. Despite theoretical and empirical support for the sufficiency of the flow condition to disrupt autocrine signalling, micropatterned cells cultured under flow showed no significant differences from the control condition. These findings form the basis of a manuscript which has been accepted for publication by the Journal of Anatomy. The results of an Atomic Force Microscopy (AFM) study carried out by collaborators were suggestive of a role for cellular mechanotransduction in sensing and responding to micropattern curvature. Differential calcium channel mechanoactivation was hypothesised as being one potential mechanism underlying the response to curvature, given the known involvement of mechanosensitive ion channels in cellular responses to force and substrate stiffness, and the multiple roles of calcium in cellular motility. Artificially increasing cytosolic calcium levels with Ionomycin reduced protrusion rates at convex curves. However, treatment with BAPTA-AM to sequester intracellular calcium had no effect on protrusion rates. ROCK inhibitor, in contrast, increased protrusion rates at concave curves, and Blebbistatin increased protrusion rates globally. These results together are suggestive of differential control of myosin depending on local curvature: cyclic and driven by calcium-activation of MLCK in the convex regions (with lamellipodia undergoing protrusion-retraction cycles), versus sustained and controlled by ROCK in the concave regions (where lamellipodia are inhibited). The unexpected finding that protrusions at convex regions were resistant to the actin cytoskeleton-disrupting drug Cytochalasin D may point to a role for a tropomyosin isoform in defining the differing mechanical characteristics of the actin cytoskeleton in response to local curvature. In addition, the previously-noted lack of effect of BAPTA-AM treatment (which has been shown to interfere with dynamic microtubules) is suggestive of a role for stabilised microtubules in protrusions at convex regions. These indications of unique characteristics to the protrusions promoted by convex curvature give added support to the curvature-protrusion feedback model, and its relevance to tissue morphogenesis. In summary, this work provides evidence against a previously-published suggested mechanism for the curvature-protrusion feedback loop that is proposed to act during epithelial morphogenesis, and evidence in support of a role for a calcium-based mechanism in driving the initiation and maintenance of leader cells in migrating epithelial sheets. Further work is called for in characterising the protrusions promoted by convex curvature, and the mechanisms controlling them. This area is of significance in gaining greater understanding of tissue morphogenesis in pathogenesis and development, and of potential value in tissue engineering applications.

Human embryonic stem cells (hESC) present a potentially unlimited supply of hematopoietic progenitors for cell-based therapies. However, current protocols for generating these progenitors typically also generate undesired cell types due to imprecise control of the hESC microenvironment and poor understanding of the signalling networks regulating mesoderm differentiation (the germ layer from which hematopoietic cells emerge). This report demonstrates that activation of the downstream effectors of Activin/Nodal and bone morphogenetic protein (BMP) signalling (Smad2 (composite of Sma (smaller) and Mad (mothers against decapentaplegic) and Smad1, respectively) are both required for mesoderm differentiation. It is further shown that microcontact printing-mediated control of hESC colony size creates local microenvironments that guide differentiation, via a Smad1-dependent mechanism, preferentially towards the mesoderm lineage. These findings demonstrate the need for precise control of the microenvironment in order to effectively guide hESC differentiation to produce specific cell types for potential therapeutic applications.

Human embryonic stem cells (hESC) present a potentially unlimited supply of hematopoietic progenitors for cell-based therapies. However, current protocols for generating these progenitors typically also generate undesired cell types due to imprecise control of the hESC microenvironment and poor understanding of the signalling networks regulating mesoderm differentiation (the germ layer from which hematopoietic cells emerge). This report demonstrates that activation of the downstream effectors of Activin/Nodal and bone morphogenetic protein (BMP) signalling (Smad2 (composite of Sma (smaller) and Mad (mothers against decapentaplegic) and Smad1, respectively) are both required for mesoderm differentiation. It is further shown that microcontact printing-mediated control of hESC colony size creates local microenvironments that guide differentiation, via a Smad1-dependent mechanism, preferentially towards the mesoderm lineage. These findings demonstrate the need for precise control of the microenvironment in order to effectively guide hESC differentiation to produce specific cell types for potential therapeutic applications.

La création d'un réseau vasculaire fonctionnel est une préoccupation importante afin d'assurer la parfaite vitalité des produits d’ingénierie tissulaire (IT). La compréhension des mécanismes de l'angiogenèse est essentielle dans un objectif de synthèse de produits d’ingénierie tissulaire vascularisés. Dans ce travail, nous avons visé à caractériser le microenvironnement responsable de l'angiogenèse des cellules endothéliales (CEs). Pour cela, nous avons élaboré des biomatériaux bioactifs (polymères fonctionnalisés par des peptides, et contrôlé leur distribution à l'échelle micrométrique) afin de mimer une situation physiologique des CEs.Dans en premier temps, nous avons mis au point une stratégie de fonctionnalisation biochimique d’un matériau polymère (le polyéthylène téréphtalate, PET) en utilisant des peptides spécifiques des CEs. L'immobilisation de ces peptides a permis d’assurer une bioactivité de ces surfaces, et l’amélioration des fonctions des CEs comme l'adhésion, l’étalement et la migration cellulaire.Ensuite, notre travail s’est inscrit dans l’évaluation de l’impact d’une distribution contrôlée de peptides en surface de matériaux (acquise par photolithographie) sur le comportement des CEs et sur l’angiogenèse. Nos résultats ont montré que les CEs adhèrent et sont alignés sur les « micropatterns » peptidiques quelle que soit la taille de ces « micropatterns » (lignes de largeurs comprises entre 10 et 100 µm). Nous avons mis en évidence que la taille des « micropatterns » bioactifs a un réel impact sur le comportement des CEs (l’étalement, l'orientation et la migration cellulaire). La morphogenèse des CEs (la formation d’un « tube-like ») a été mise en évidence sur des matériaux microstructurés par des lignes peptidiques de 10 et 50 µm de largeur, quels que soient les peptides RGD ou SVVYGLR immobilisés en surface. Nous avons montré que la lumière de structures tubulaires peut être constituée d’une à quatre cellules selon la contrainte géométrique appliquée sur les « micropatterns ». Nos travaux ont montré que le « sprouting » ainsi que la formation du réseau vasculaire peuvent être induits seulement sur des surfaces « micropatternés » par des peptides SVVYGLR. Nos résultats démontrent que l'induction de l'angiogenèse est multiparamétrique. Celle-ci est dépendante de constituants biochimiques ainsi que de leur micro-distribution.Troisièmement, nous avons utilisé la modélisation mathématique pour comprendre l'impact de « micropatterns » bioactifs sur la migration des CEs. Un modèle de type continu Patlak-Keller-Segel a été utilisé, et les résultats numériques sont bien conformes avec nos résultats expérimentaux. Pour finir, nos travaux se sont focalisés sur l'étude de la stabilisation de ces structures tubulaires. Les résultats ont montré que les cocultures de CEs avec les péricytes, ainsi que le recrutement de composant de membrane basale (Matrigel) peuvent stabiliser ces structures vasculaires.En conclusion générale, le travail réalisé dans cette thèse a prouvé que le « micropatterning » des principes bioactifs sur polymères est efficace pour stimuler l'angiogenèse et pour construire une vascularisation fonctionnelle. Enfin, ce travail a permis de comprendre la biologie de l’angiogenèse et pourra aider indéniablement tous les travaux en cours s’inscrivant dans l’ingénierie tissulaire. / The creation of a functional vascular network is a major concern to ensure the vitality of perfect tissue engineered products. Understanding the mechanisms of angiogenesis is essential for the vascularization in tissue engineering. In this work, we aimed to characterize the microenvironment responsible for angiogenesis of endothelial cells. To achieve this request, we developed bioactive biomaterials (polymers functionalized mainly with peptides, and controlled their distribution at micrometer scale) to mimic a physiological microenvironment of endothelial cells. First, we developed the biochemical functionalized of polymer materials (polyethylene terephthalate, PET) using endothelial cell specific peptides. The peptide immobilization ensured the bioactivity onto material surfaces, and enhanced endothelial cell functions such as cell adhesion, spreading and migration. Second, we introduced photolithographical technique to control geometrical distribution of peptides on material surfaces, and studied the effects of peptide micropatterning onto endothelial cell (EC) angiogenesis. ECs were adhered and aligned onto peptides micropatterns whatever the size of peptide micropatterns. However, EC behaviors (cell spreading, orientation and migration) were significantly more regulated on smaller micropatterns (10 and 50 µm) than on larger stripes (100 µm). EC morphogenesis into tube formation can also switch onto the smaller micropatterns (10 and 50 µm) with either RGD or SVVYGLR peptides. The central lumen of tubular structures can be formed by single-to-four cells due to geometrical constraints applied on the micropatterns. Sprouting angiogenesis of ECs and vascular network formation can be induced on surfaces micropatterned with angiogenic SVVYGLR peptides. Our overall results revealed that the induction of angiogenesis is multi-parametric. This is dependent on biochemical constituents and their micro-distributions. Third, we employed mathematical modeling to understand the impact of bioactive micropatterns on endothelial cell migration. A continuous Patlak-Keller-Segel type model was used, and the numerical results were in well accordance with our experimental results.Furthermore, we also developed the study of stabilization of tubulogenenic structure in this thesis. The results showed that the co-cultures of endothelial cells with pericytes, as well as the recruitment of basement membrane components (Matrigel) can stabilize the vascular tube structures. In general conclusion, our work in this thesis proved that bioactive micropatterning of polymer is effective to stimulate angiogenesis and to construct functional vascularization. This work helps us to understand the fundamental biology of angiogenesis, and has great potential for application in tissue engineering.

Au cours de son développement depuis la cellule unique jusqu’à la forme adulte, l’embryon passe par de nombreuses étapes de morphogenèse. L'harmonie entre les cellules au cours de ces processus est assurée par l’intégration spatiale des signaux externes qui assurent la cohérence des polarités internes et externes des cellules. Ce travail de thèse se concentre sur la façon dont les cellules intègrent les informations spatiales dans la définition de leur polarité au cours de grandes transformations morphologiques comme la transition épithélium-mésenchyme et la dissémination des cellules tumorales. Nous avons utilisé la position du centrosome comme un indicateur de la polarité cellulaire interne en raison de son rôle actif dans l'organisation des microtubules et donc dans l'orientation du transport intra-cellulaire. La polarité corticale a été inférée à partir de la répartition spatiale des adhérences cellule-cellule (ACC) et cellule-matrice (ACM).Dans la première partie, nous avons étudié l'effet de l'amplification du nombre de centrosomes, une caractéristique fréquente dans les cellules tumorales, sur l’adhérence inter-cellulaire. L'amplification des centrosomes dans les cellules de la glande mammaire a conduit à la rupture des adhérences inter-cellulaires ainsi qu’à la genèse de protubérances cellulaire invasive. Cependant le matériel centrosomal étant plus développé, de nombreux microtubules supplémentaires émanait de ces clusters de centrosomes surnuméraires. L'utilisation de modèles cellulaires in vitro et de conditions de culture contrôlées ont révélées que la simple amplification des centrosomes est suffisante pour moduler le destin de cellules transformées et les rendre invasives. Cette étude a révélé que les mécanismes régissant l’orientation la polarité interne des cellules sont liés à l’arrangement spatial de la polarité corticale et que la diaphonie entre les deux perturbe la physiologie du tissu au point d’induire la formation de métastases tumorales.La deuxième partie de l'étude a porté sur l'exploration de la transition épithélium-mésenchyme (EMT). Nous avons étudié le rôle potentiel des mécanismes de régulation de la polarité pour diriger la précision des mouvements cellulaire au cours de l’EMT. Le remodelage des adhérences inter-cellulaires jouant un rôle central au cours de l’EMT, nous avons supposé qu'il était couplé à des changements de polarité interne. Nous avons suivi le positionnement du centrosome dans les cellules épithéliales et dans les cellules dans lesquelles l’EMT était induite par stimulation au TGFb. La libération des cellules mésenchymateuses de leur confinement nous a montré que la séparation des cellules après l’EMT était dépendante de l’inversion de polarité interne dans ces cellules. Ces résultats suggèrent que la dispersion des cellules observée pendant la formation du mésoderme au cours de la gastrulation impliquent un renversement actif et finement contrôlée du couplage entre l’axe de polarité interne et l’asymétrie des deux types d’adhérences cellulaires.Suite à l’étude de ces deux projets impliquant des dispersions cellulaires, nous avons développé un dispositif pour permettre le criblage de médicaments contre les dérèglements cellulaires impliqués dans la formation des métastases. Nous avons à nouveau utilisé un modèle simplifié de paires de cellules sur des micropattern pour détecter la capacité de dispersion des cellules suite à des stimulations externes comme celle induisant l’EMT. Le test, qui permet de mesurer le degré de séparation des cellules à l’aide d’une seule image, a été validé sur quatre lignées de cellules épithéliales différentes. Le dispositif final a été adapté à un format de plaque 96 puits en collaboration avec l’entreprise Cytoo afin de permettre des criblages à haut contenu. Ce kit a ensuite été validé en testant des médicaments connus contre l’EMT. / Development from single cell embryo to multicellular adult form of organism involves tremendous morphogenesis. The well defined and highly controlled morphonogenetic processes are crucial at every stage of development including gastrulation, organogensis, wound healing and tissue maintenance. The necessary harmony between cells for these processes is achieved by integration of internal and external polarity cues. This thesis work is focused on understanding how cells integrate polarity cues to drive morphogenetic event such as of Epithelial to mesenchymal transition (EMT) and cancer metastasis. We used centrosome position as an indicator of internal cell polarity due to its active role in organization of microtubules and orientation of internal traffic of endocytosed and secreted proteins; while cortical polarity was inferred by polarized distribution of cell-cell adhesions (CCA) and cell-matrix adhesions (CMA). In the first part, we studied effect of centrosome amplification, which is very common in human cancer; on CCA. Inducible centrosome amplification in mammary gland cells led to destabilization of CCA alongwith generation of invasive cell protrusions. Using a minimal model of tissue; confined on micropatterns, we demonstrated that cells with amplified centrosome correctly oriented their internal polarity axis like normal cells although increased centrosomal protein and peri-centriolar material emanated higher centrosomal microtubules. Use of in vitro models of cell lines and controlled culture conditions revealed that mere amplification of centrosome was sufficient to drive cell fate for cancer-like events in the absence of any additional external growth signals capable of affecting cortical polarity. This study revealed that internal polarity cues interact with cortical polarity signals and the crosstalk between the two governs the physiological state of the cell during transformation events like cancer metastasis. The second part of the study focused on exploring how internal polarity during EMT is modulated to drive precise spatial movements during development. Cell adhesion remodelling being central to EMT, we hypothesized that it was coupled to internal polarity changes. We monitored centrosome position in epithelial and in cells induced for EMT by TGFb and found that nucleus-centrosome axis was reversed. This phenomenon of polarity reversal strongly suggested that internal polarity cues and positioning of organelles is coupled to signals that polarize CCA and CMA distribution. A shift in the force balance between CCA and CMA was observed upon EMT and suggested that CMA forces dominated in mesenchymal cells and release of cells from confinement clearly revealed that ability of cell separation was dependent upon their internal polarity. These results demonstrated that scattering events observed during mesoderm formation during gastrulation or metastasis events in cancer involve active and tightly controlled reversal of internal polarity axis coupled to cortical polarity of cells. From the understanding of above two projects involving cancer-like scattering phenomenon, we developed a product to allow robust drug screening against cancer drugs. We once again used simplified two-cell model on micropattern geometries to develop an assay to detect scattering ability of cells after events like EMT. The assay was validated by EMT transformation of 4 different epithelial cells lines and detection of their scattering ability by single time point picture assay. We used internuclear distance between the cell-pair as the main parameter for scoring the scattering index of cells with possibility of automated image processing. The final product was manufactured in 96-well plate format by industrial collaborator Cytoo for high content screening. Preliminary validation using drugs against EMT constituted proof of principle for the product.

Les maladies cardiovasculaires sont l’une des principale causes de mortalité dans le monde, engendrant le décès de plus de 17 millions de personnes par an. Ce chiffre éloquent augmentera jusqu’à atteindre selon l’OMS 23,4 millions de décès en 2030. Ces maladies sont associées à un rétrécissement de la lumière des vaisseaux sanguins qui peut entrainer une occlusion partielle ou complète du vaisseau. Le traitement le plus souvent utilisé est un traitement chirurgical visant à créer un pont qui va contourner la section obstruée, ou une section lésée.Actuellement, les conduits les plus utilisés pour les greffes sont les vaisseaux autologues, à savoir la veine saphène ou l’artère thoracique interne. Seulement, ces substituts ne peuvent être utilisés en remplacement que s’ils sont sains. L’alternative aux vaisseaux autologue est l’utilisation de substituts synthétiques. Due à un certain manque de biocompatibilité de ces greffons synthétiques, après quelques années seulement, un phénomène de thrombose s’installe, en cause ; l’absence de cellules endothéliales (CEs) qui recouvrent l’intérieur du substitut.Le point clé réside ici dans la fabrication d’un matériau capable de fournir au CEs un environnement favorable à leur adhésion et leur prolifération pour permettre la génération d’un endothélium à l’intérieur d’un substitut synthétique. In vivo, les cellules capables de coloniser de tels matériaux sont les cellules progénitrices endothéliales, ces cellules sont capables de se différencier en cellules endothéliales matures et possèdent une capacité de prolifération supérieure aux cellules matures. Elles sont capables de réparer les vaisseaux et pourront donc être ciblées afin d’être recrutées in situ et ainsi endothélialiser le biomatériau.C’est dans ce contexte que nous avons choisi de modifier de façon chimique la surface d’un matériau model, un film de PET avec quatre principes actifs innovants sélectionnés pour leur capacité à induire l’adhésion des cellules ou leur différentiation pour permettre la régénération d’un endothélium à la surface du matériau.Ce projet a permis dans un premier temps de mettre au point un protocole pour greffer des principes actifs de façon covalente avec une densité reproductible et de façon microstructurée en utilisant la photolithographie. Ici, les peptides GRGDS et GHM ont été greffés pour améliorer l’adhésion des cellules, le dernier étant spécifique aux cellules endothéliales progénitrices. Le peptide SFLLRN et la sitagliptine ont été greffés pour induire ou accélérer la différenciation des EPCs en CEs matures. Toutes les surfaces ont été caractérisées pour valider le greffage covalent et connaitre la densité de molécules bioactives greffée.D’autre part avec une caractérisation approfondie des EPCs issues du sang de cordon ombilical, certains gènes caractéristiques des cellules souches et endothéliales ont été suivis par immunofluorescence et RT-qPCR pour déterminer leur état de différenciation. Ce travail n’aura été possible qu’après avoir déterminé quels gènes de références nous pouvions utiliser pour étudier le phénotype de trois types cellulaires à savoir, les cellules mononuclées CD34+, les EPCs et des CEs matures (extraites de la veine saphène). [...] En conclusion générale, ce projet prouve que la modification de surfaces des substituts avec des molécules bioactives est indispensable pour rendre le matériau attractif et pour régénérer un endothélium à la surface de celui-ci. Ce travail nous a aidé souligner l’importance de comprendre le comportement des EPCs et leur cinétique de différenciation pour leur utilisation en ingénierie vasculaire. / Cardiovascular disease is one of the leading causes of death in the world, killing more than 17 million people a year. This eloquent figure will increase to 23.4 million deaths in 2030, according to the WHO. These diseases are associated with a narrowing of the lumen of the blood vessels that may cause partial or complete occlusion of the vessel. The treatment most often used is a surgical treatment designed to create a bridge that will bypass the obstructed section or an injured section.Currently, the most used conduits for transplants are autologous vessels, namely the saphenous vein or the internal thoracic artery. Only these substitutes can only be used as a replacement if they are healthy. The alternative to autologous vessels is the use of synthetic substitutes. Due to a certain lack of biocompatibility of these synthetic grafts, after only a few years, a phenomenon of thrombosis sets in; the absence of endothelial cells (ECs) that cover the interior of the substitute.The key point here lies in the manufacture of a material capable of providing the ECs with a favorable environment for their adhesion and proliferation to allow the generation of an endothelium within a synthetic substitute. In vivo, cells capable of colonizing such materials are endothelial progenitor cells, these cells are capable of differentiating into mature endothelial cells and possess a higher proliferation capacity than mature cells. They are able to repair the vessels and can, therefore, be targeted to be recruited in situ and thus endothelialize the biomaterial.It is in this context that we have chosen to chemically modify the surface of a model material, a PET film with four innovative active ingredients selected for their ability to induce cell adhesion or differentiation to allow regeneration. an endothelium on the surface of the material.This project has initially made it possible to develop a protocol for grafting active ingredients covalently with a reproducible density and in a microstructured manner using photolithography. Here, the GRGDS and GHM peptides were grafted to enhance cell adhesion, the latter being specific to endothelial progenitor cells. The SFLLRN peptide and sitagliptin have been grafted to induce or accelerate the differentiation of EPCs into mature ECs. All surfaces have been characterized to validate covalent grafting and to know the density of grafted bioactive molecules.On the other hand, with a thorough characterization of EPCs from umbilical cord blood, some characteristic genes of stem and endothelial cells were followed by immunofluorescence and RT-qPCR to determine their state of differentiation. This work will have been possible only after determining which reference genes we could use to study the phenotype of three cell types namely, CD34 + mononuclear cells, EPCs and mature ECs (saphenous vein extract). [...] As a general conclusion, this project proves that surface modification of substitutes with bioactive molecules is essential to make the material attractive and to regenerate an endothelium on the surface of it. This work has helped us emphasize the importance of understanding the behavior of EPCs and their kinetics of differentiation for their use in vascular engineering.

Une réponse immunitaire efficace repose sur un recrutement rapide de leucocytes du sang au tissu enflammé ou endommagé. Pendant ce processus, les leucocytes sont capturés par l'endothélium et migrent le long de la paroi pour atteindre les sites de transmigration. Ces processus sont médiés par des signaux externes parmi lesquels le rôle des molécules d’adhésion reste flou. L’haptotaxie adhésive a été décrite pour les cellules mésenchymateuses qui s’orientent via un mécanisme de tir à la corde - une compétition entre les bords adhérents des cellules. Pour les cellules amiboïdes, l'existence d'une haptotaxie adhésif n'a jamais été observée. Ici, nous avons étudié la migration des lymphocytes T humains sur des substrats dont l’adhérence est spatialement modulée et avons observé une haptotaxie robuste. Mécanistiquement, nous montrons que l'haptotaxie adhésive diffère à la fois de la chimiotaxie, car aucune mécanotransduction n'a été détectée, et du mécanisme de tir à la corde passif, car différentes intégrines induisent des phénotypes opposés. Les cellules ont favorisé des zones plus adhérentes avec VLA-4 et, contre-intuitivement, des zones moins adhérentes avec LFA-1. Ces résultats révèlent que les intégrines contrôlent les comportements différentiels d'haptotaxie adhésive sans mécanotransduction. Nous avons également étudié le mécanisme à l'origine de ce phénotype induit par LFA-1 et avons découvert que la dynamique du lamellipode plutôt que le niveau d'expression de l'intégrine, était impliquée. Les résultats préliminaires avec des lymphocytes T déficients en VASP indiquent également que la protéine VASP pourrait jouer un rôle important dans l'haptotaxie adhésive. / An efficient immune response relies on a rapid recruitment of leukocytes from blood to the inflamed or damaged tissue. During this process, leukocytes are captured by the endothelium and migrate along the vessel wall to reach permissive transmigration sites. These processes are mediated by multiple external cues among which the role of adhesion molecules remains unclear. Adhesive haptotaxis has been described for mesenchymal cells that develop strong pulling forces with their substrates and orient via a tug of war mechanism – a competition between cells’ adherent pulling edges. In the case of amoeboid cells that migrate with minimal interaction with their substrate, the existence of adhesive haptotaxis has yet to be evidenced. Here, we studied the crawling of human T lymphocytes on substrates with spatially modulated adhesion. and observed robust adhesive haptotaxis. Mechanistically, we show that integrin-mediated adhesive haptotaxis of lymphocytes differs both from active chemotaxis, because no mechanotransduction was detected, and from the passive tug of war mechanism, because different integrins support opposite phenotypes. Cells favored more adherent zones with VLA-4 and, counterintuitively, less adherent zones with LFA-1. These results reveal that integrins control differential adhesive haptotaxis behaviors without mechanotransduction. We further investigated the mechanism behind this specific haptotactic phenotype mediated by LFA-1 and find that the lamellipodial dynamics, rather than the integrin expression level, is involved. Preliminary findings with VASP deficient T cells indicate also that VASP protein may play an important role in T cell adhesive haptotaxis.

In vivo, les cellules souches résident au sein de niches, des microenvironnements extrêmement spécialisés qui leur permettent de réguler leur prolifération ainsi que leur différentiation en cellules matures et fonctionnelles. Ces microenvironnements sont caractérisés par des interactions cellules-cellules, la présence de facteurs de croissance et de cytokines, et une matrice extracellulaire, qui fournissent des signaux qui permettent de contrôler le comportement des cellules souches.Bone morphogenetic protein 2 (BMP-2) est un facteur de croissance ostéoinductif qui est impliqué dans toutes les étapes de la différentiation ostéoblastique, ainsi que dans la transdifférentiation de myoblastes vers une lignée ostéogénique. In vivo, ce facteur existe à la fois en solution et lié à la matrice extracellulaire. Bien que ces deux modes de présentation influencent les comportements cellulaires de façon distincte, leur rôle dans le microenvironnement de la niche et leur pertinence fonctionnelle dans la genèse de la réponse biologique n’a presque pas été étudié à l’échelle cellulaire. Ici nous avons utilisé l’affinité naturelle de la BMP-2 pour la fibronectine afin de créer des micromotifs de BMP-2 de taille cellulaire sur des biomatériaux mous.Cette technique nous a permis de contrôler simultanément la présentation spatiale de la BMP-2 liée à la fibronectine, ainsi que l’étalement cellulaire. Ces micromotifs ont induit une organisation d’actine et d’adhésions focales autour du noyau, et a déclenché la phosphorylation et la translocation nucléaire de SMAD1/5/8 dans des myoblastes murins C2C12 et des cellules souches mésenchymateuses. Ceci est un indicateur précoce de leur transdifférentiation ostéoblastique. Nous avons trouvé que l’étalement cellulaire lui-même facilitait la phosphorylation de SMAD1/5/8 dépendante de la BMP-2, et avons démontré que la signalisation SMAD médiée par la fibronectine et la BMP-2 dépendait de LIM kinase 2 et de ROCK, plutôt que d’une activation de la myosine II.Nous avons également pu utiliser cet outil pour étudier les cinétiques d’adhésion et d’étalement, les changements d’organisation du cytosquelette dépendants du mode de présentation de la BMP-2, et la signalisation entre la matrice et la cellule, médiée par les intégrines. Nous avons obtenu des résultats préliminaires suggérant un effet du mode de présentation de la BMP-2 sur les forces cellulaires, suggérant que le mode de présentation des facteurs de croissance pourrait être pertinent à d’autres mécanismes cellulaires tels que la mécanotransduction.Dans l’ensemble, nous résultats montrent que les patterns de BMP-2 liée à la fibronectine sont un outil utile à l’étude de mécanismes cellulaires. De façon plus large, notre approche pourrait être adaptée à d’autres combinaisons de protéines de la matrice et de facteurs de croissance, ouvrant ainsi une avenue fascinante pour recréer in vitro des niches spécifiques aux tissus. / In vivo, stem cells reside within niches, highly specialized microenvironments which allow them to regulate their self-renewal and differentiation into mature and functional cells. These microenvironments are characterized by cell-cell interactions, the presence of growth factors and cytokines, and an extracellular matrix, all of which provide cues that control stem cell behavior.Bone morphogenetic protein 2 (BMP-2) is an osteoinductive growth factor which is involved in all stages of osteoblastic differentiation, as well as the transdifferentiation of myoblasts toward an osteogenic lineage. In vivo, it exists both in solution and bound to the ECM. While these two modes of presentation are known to influence cell behavior distinctly, their role in the niche microenvironment and their functional relevance in the genesis of a biological response has sparsely been investigated at a cellular level. Here we used the natural affinity of BMP-2 for fibronectin (FN) to engineer cell-sized micropatterns of BMP-2 on soft biomaterials.This technique allowed the simultaneous control of the spatial presentation of fibronectin-bound BMP-2 and cell spreading. These micropatterns induced a specific actin and adhesion organization around the nucleus, and triggered the phosphorylation and nuclear translocation of SMAD1/5/8 in C2C12 myoblasts and mesenchymal stem cells, an early indicator of their osteoblastic transdifferentiation. We found that cell spreading itself potentiated a BMP-2-dependent phosphorylation of SMAD1/5/8, and demonstrated that FN/BMP-2-mediated early SMAD signaling depended on LIM kinase 2 and ROCK, rather than myosin II activation.We were also able to use this tool to investigate adhesion and spreading kinetics, changes in cytoskeletal organization depending on BMP-2 presentation mode, and reciprocal integrin-mediated signaling between the ECM and the cell. We were able to show preliminary results suggesting an effect of BMP-2 presentation mode on cellular forces, suggesting that growth factor presentation may be relevant to other cellular mechanisms like mechanotransduction.Altogether, our results show that FN/BMP-2 micropatterns are a useful tool to study the mechanisms underlying BMP-2-mediated mechanotransduction. More broadly, our approach could be adapted to other combinations of ECM proteins and growth factors, opening an exciting avenue to recreate tissue-specific niches in vitro.