Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Thèse doctorat : Optoélectronique : Ecully, Ecole centrale de Lyon : 2006. / 368 réf.

Thèse doctorat : Optoélectronique : Ecully, Ecole centrale de Lyon : 2006. / Titre provenant de l'écran-titre. 368 réf.

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.

La dystrophie myotonique de type 1 (DM1) est une maladie génétique caractérisée par une dégénérescence des muscles squelettiques accompagnée d’une myotonie. Cette maladie est due à une expansion instable de triplets CTG dans la région 3’ non traduite du gène DMPK. L’accumulation des ARNm DMPK mutés au sein de foci nucléaires conduit à la séquestration du facteur d’épissage MBNL1 et à des altérations de l’épissage alternatif de nombreux ARNm. En particulier, l’inclusion de l’exon 5 au sein du pré-ARNm de la troponine T cardiaque (hcTNT) est renforcée chez les patients DM1. Cette inclusion anormale participe aux anomalies cardiaques présentées par les patients. Les travaux de l’équipe, menés en collaboration avec l’équipe de Nicolas Sergeant à Lille, sur la régulation de l’épissage de l’ARNm hcTNT avaient établi l’existence de 8 sites MBNL1, dont 6 nouveaux, situés de part et d’autre de l’exon 5 et la présence de régions activatrices et inhibitrices de l’inclusion fixant des facteurs d’épissage dont l’identité n’était pas connue. L’un des objectifs de ma thèse était d’étudier l’importance fonctionnelle in cellulo de chacun des 8 sites MBNL1. J’ai ainsi pu montrer que chacun des 6 nouveaux sites participe à l’inhibition de l’inclusion de l’exon 5 par MBNL1. Les données obtenues nous ont amené à proposer un modèle dans lequel MBNL1 s’associe avec les triplets de sites MBNL1 situés de part et autre de l’exon 5 et entraine la formation d’une structure à longue distance via des interactions protéiques MBNL1-MBNL1. Cette structure isolerait l’exon 5 dans une boucle et limiterait la fixation du spliceosome. Par ailleurs, j’ai mis en œuvre une approche de purification de RNP formées en extrait nucléaire pour identifier d’autres facteurs régulant l’inclusion de l’exon 5. La protéine hnRNP H a ainsi pu être identifiée. Sa capacité à activer l’inclusion de l’exon 5 in cellulo et à entrer en compétition avec MBNL1 pour la régulation de l’inclusion de l’exon 5 via sa fixation sur des sites localisés dans l’exon 5 et en aval de cet exon a pu être confirmée. La seconde partie de ma thèse a porté sur l’étude de l’effet d’un stress oxydatif généré par 500 µM d’H2O2 sur le profil global d’épissage alternatif des pré-ARNm de cellules HeLa. Lors de ce travail, j’ai pu établir que la réponse des cellules HeLa au stress oxydatif implique deux phases de réponse : une phase précoce (1h-8h) caractérisée par un fort taux de mortalité associé à une forte augmentation du taux de d’entités oxygénées réactives (ROS) intracellulaire et une phase tardive (16h-24h) corrélée à une diminution du taux de ROS intracellulaires et une surexpression des ARN satellite III. Sur la base de ces données, une analyse globale du transcriptome par emploi de puces à exons (Affymetrix) a été réalisée à partir d’ARN totaux isolés 1h, 2h, 4h et 24h après le début du stress. Nous avons ainsi identifié des modulations d’expression et d’épissage spécifiques de chacune des deux phases. L’analyse des données par des outils bio-informatiques a permis de mettre en évidence des fonctions cellulaires bien définies qui sont plus particulièrement affectées lors d’un stress oxydant. Enfin, pour comprendre l’origine des variations d’épissage observées lors d’un stress oxydant, j’ai entrepris d’analyser les effets de ce stress sur le niveau d’expression et la localisation cellulaire des composants du spliceosome ou des facteurs qui s’associent pour réguler son activité / Myotonic distrophy of type 1 (DM1) is a genetic disease characterized by skeletal muscle degeneration associated to myotonia. DM1 results from the instable expansion of CTG repeats within the 3’ untranslated region of the DMPK gene. The accumulation of mutated DMPK mRNAs within nuclear foci leads to the sequestration of the MBNL1 splicing factor and causes splicing misregulation of numerous pre-mRNAs. Among altered events the increase of the inclusion of exon 5 in the human cardiac troponin T (hcTNT) mRNA is of particular importance, since it contributes to the cardiac symptoms presented by the patients. Through collaborative work with N. Sergeant’s team from Lille, the team has studied the molecular bases of hcTNT exon 5 inclusion regulation and mapped 8 MBNL1 binding sites, including 6 new ones, within intronic regions surrounding exon 5. They also identified positive and negative splicing regulatory elements of which protein partners remain unidentified. The first objective of my PhD thesis was to test the functional importance of each individual MBNL1 binding site. The obtained results established that the 6 newly identified MBNL1 binding sites are involved in splicing regulation by MBNL1 and lead us to propose a new regulation model in which MBNL1 binds on triplets of MBNL1 sites present on each side of exon 5 and form a long distance structure via MBNL1-MBNL1 protein interaction. The formation of this looping-structure is expected to isolate exon 5 and limit its recognition by the spliceosome. In addition I searched for protein partners of the identified regulatory elements by affinity chromatography. By this way, I identified hnRNP H as a positive regulator of exon 5 inclusion. Its capacity to compete with MBNL1 to regulate splicing in cellulo by binding on exonic and intronic binding sites was further confirmed. The second part of my PhD work corresponds to the study of the global impact of oxidative stress, generated by exposition of HeLa cells to 500 µM of H2O2, on alternative splicing. This allows us to establish that the response of HeLa cells to oxidative stress involve two distincts phases: an early one (1h-8h) characterized by poor survival rate and high intracellular ROS content and a late phase (16-24h), associated with a decrease of the intracellular ROS level and the overexpression of the long non coding sat III RNAs. Based on this observation, we performed a transcriptome global analysis by using exon arrays from Affymetrix on RNA samples isolated 1, 2, 4 or 24 hours after the induction of the oxidative stress. We identified changes of the gene expression level or mRNA splicing pattern specific of each of the response phases. Data computing by bio-informatic tools identified the most affected cellular processes and functions during the cell response to oxidative stress. In order to better understand the mechanisms underlying alternative splicing modulation during oxidative stress, I started to study the impact of oxidative stress on the expression level and the cellular localization of spliceosome components and most common splicing regulation factors

Le but de mon projet est de créer et d’appliquer des outils pour l’analyse de la biologie des systèmes musculaires en utilisant différentes données OMICS. Ce projet s’intéresse plus particulièrement à la dysferlinopathie due la déficience d’une protéine appelée dysferline qui est exprimée principalement dans les muscles squelettiques et cardiaque. La perte du dysferline due à la mutation (autosomique-récessive) du gène DYSF entraîne une dystrophie musculaire progressive (LGMD2B, MM, DMAT). Nous avons déjà développé des outils bio-informatiques qui peuvent être utilisés pour l’analyse fonctionnelle de données OMICS, relative à la dyspherlinopathie. Ces derniers incluent le test dit «gene set enrichment analysis», test comparant les profils OMICS d’intérêts aux données OMICS musculaires préalablement publiées ; et l’analyse des réseaux impliquant les diffèrent(e)s protéines et transcrits entre eux/elles. Ainsi, nous avons analysé des centaines de données omiques publiées provenant d’archives publiques. Les outils informatiques que nous avons développés sont CellWhere et MyoMiner. CellWhere est un outil facile à utiliser, permettant de visualiser sur un graphe interactif à la fois les interactions protéine-protéine et la localisation subcellulaire des protéines. Myominer est une base de données spécialisée dans le tissu et les cellules musculaires, et qui fournit une analyse de co-expression, aussi bien dans les tissus sains que pathologiques. Ces outils seront utilisés dans l'analyse et l'interprétation de données transcriptomiques pour les dyspherlinopathies mais également les autres pathologies neuromusculaires. / The aim of this project was to build and apply tools for the analysis of muscle omics data, with a focus on Dysferlin deficiency. This protein is expressed mainly in skeletal and cardiac muscles, and its loss due to mutation (autosomal-recessive) of the DYSF gene, results in a progressive muscular dystrophy (Limb Girdle Muscular Dystrophy type 2B (LGMD2B), Miyoshi myopathy and distal myopathy with tibialis anterior onset (DMAT)). We have developed various tools and pipelines that can be applied towards a bioinformatics functional analysis of omics data in muscular dystrophies and neuromuscular disorders. These include: tests for enrichment of gene sets derived from previously published muscle microarray data and networking analysis of functional associations between altered transcripts/proteins. To accomplish this, we analyzed hundreds of published omics data from public repositories. The tools we developed are called CellWhere and MyoMiner. CellWhere is a user-friendly tool that combines protein-protein interactions and protein subcellular localizations on an interactive graphical display (https://cellwhere-myo.rhcloud.com). MyoMiner is a muscle cell- and tissue-specific database that provides co-expression analyses in both normal and pathological tissues. Many gene co-expression databases already exist and are used broadly by researchers, but MyoMiner is the first muscle-specific tool of its kind (https://myominer-myo.rhcloud.com). These tools will be used in the analysis and interpretation of transcriptomics data from dysferlinopathic muscle and other neuromuscular conditions and will be important to understand the molecular mechanisms underlying these pathologies.

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal

La croissance de deux tiers des tumeurs mammaires dépend des œstrogènes. Le réseau de gènes responsable de propager les signaux prolifératifs des œstrogènes est encore mal connu. Des micropuces d’ADN de cellules de carcinome mammaire MCF7 traitées à l’œstradiol (E2) avec ou sans l’inhibiteur de synthèse protéique cycloheximide (CHX) ont permis d’identifier de nombreux gènes cibles primaires et secondaires. La séquence des promoteurs des gènes cibles a été criblée à l’aide d’une banque de 300 matrices modélisant les sites reconnus par divers facteurs de transcription. Les éléments de réponse aux œstrogènes (ERE) sont enrichis dans les promoteurs des gènes primaires. Les sites E2F sont enrichis dans les promoteurs des gènes cible secondaires. Un enrichissement similaire a été observé avec les régions liées par ERα et E2F1 en ChIP-on-chip pour chacune des catégories de gènes. La croissance des cellules de carcinome mammaire est inhibée par des traitements à l’acide rétinoïque (RA). L’analyse de micropuces d’ADN de MCF7 traitées avec RA a permis d’identifier de nombreux gènes cibles potentiels. Un enrichissement d’éléments de réponse à l’acide rétinoïque (RARE) est observable dans les promoteurs de ces gènes après avoir exclus les RARE se trouvant à l’intérieur d’éléments transposables. Des RARE présents dans des éléments transposables spécifiques aux primates sont aussi fixés in vivo dans les promoteurs de cibles connues de RA : BTG2, CASP9 et GPRC5A. Certains gènes cibles de RA dans les MCF7 sont aussi des cibles de E2, suggérant que le contrôle que ces molécules exercent sur la prolifération est en partie attribuable à des effets opposés sur un ensemble commun de gènes. / Two thirds of breast tumours depend on estrogens for their growth. The network of genes mediating the proliferative effect of estrogens is not fully characterized. Putative primary and secondary estrogen target genes were identified with microarray analysis of MCF7 breast cancer cells treated with estradiol (E2) in presence or absence of the protein synthesis inhibitor cycloheximide (CHX). The promoters of the target genes were screened for transcription factor binding sites with a collection of 300 matrix based DNA-binding profiles. Estrogen response elements (EREs) were enriched in the promoters of primary target genes. E2F binding sites were enriched in the promoters of secondary target genes. Similar enrichment was also observed in regions bounds by ERα and E2F1 in ChIP-on-chip experiments for each set of target genes. Retinoic acid (RA) treatment of mammary carcinoma cells inhibits their growth. Putative target genes were identified through microarray analysis of MCF7 cells treated with RA. Enrichment of retinoic acid response elements (RARE) was observed in their promoters after removing the elements found within transposable elements. Although transposable elements mask the enrichment, RARE within primate specific transposable elements are bound in vivo by retinoic acid receptors in the promoters of known target genes BTG2, CASP9 and GPRC5A. Some of the RA target genes in MCF7 cells are also target genes of E2 suggesting that these two molecules exert their effects on cell proliferation in part by opposite action on a common set of genes.

La croissance de deux tiers des tumeurs mammaires dépend des œstrogènes. Le réseau de gènes responsable de propager les signaux prolifératifs des œstrogènes est encore mal connu. Des micropuces d’ADN de cellules de carcinome mammaire MCF7 traitées à l’œstradiol (E2) avec ou sans l’inhibiteur de synthèse protéique cycloheximide (CHX) ont permis d’identifier de nombreux gènes cibles primaires et secondaires. La séquence des promoteurs des gènes cibles a été criblée à l’aide d’une banque de 300 matrices modélisant les sites reconnus par divers facteurs de transcription. Les éléments de réponse aux œstrogènes (ERE) sont enrichis dans les promoteurs des gènes primaires. Les sites E2F sont enrichis dans les promoteurs des gènes cible secondaires. Un enrichissement similaire a été observé avec les régions liées par ERα et E2F1 en ChIP-on-chip pour chacune des catégories de gènes. La croissance des cellules de carcinome mammaire est inhibée par des traitements à l’acide rétinoïque (RA). L’analyse de micropuces d’ADN de MCF7 traitées avec RA a permis d’identifier de nombreux gènes cibles potentiels. Un enrichissement d’éléments de réponse à l’acide rétinoïque (RARE) est observable dans les promoteurs de ces gènes après avoir exclus les RARE se trouvant à l’intérieur d’éléments transposables. Des RARE présents dans des éléments transposables spécifiques aux primates sont aussi fixés in vivo dans les promoteurs de cibles connues de RA : BTG2, CASP9 et GPRC5A. Certains gènes cibles de RA dans les MCF7 sont aussi des cibles de E2, suggérant que le contrôle que ces molécules exercent sur la prolifération est en partie attribuable à des effets opposés sur un ensemble commun de gènes. / Two thirds of breast tumours depend on estrogens for their growth. The network of genes mediating the proliferative effect of estrogens is not fully characterized. Putative primary and secondary estrogen target genes were identified with microarray analysis of MCF7 breast cancer cells treated with estradiol (E2) in presence or absence of the protein synthesis inhibitor cycloheximide (CHX). The promoters of the target genes were screened for transcription factor binding sites with a collection of 300 matrix based DNA-binding profiles. Estrogen response elements (EREs) were enriched in the promoters of primary target genes. E2F binding sites were enriched in the promoters of secondary target genes. Similar enrichment was also observed in regions bounds by ERα and E2F1 in ChIP-on-chip experiments for each set of target genes. Retinoic acid (RA) treatment of mammary carcinoma cells inhibits their growth. Putative target genes were identified through microarray analysis of MCF7 cells treated with RA. Enrichment of retinoic acid response elements (RARE) was observed in their promoters after removing the elements found within transposable elements. Although transposable elements mask the enrichment, RARE within primate specific transposable elements are bound in vivo by retinoic acid receptors in the promoters of known target genes BTG2, CASP9 and GPRC5A. Some of the RA target genes in MCF7 cells are also target genes of E2 suggesting that these two molecules exert their effects on cell proliferation in part by opposite action on a common set of genes.

Dans cette thèse, nous nous intéressons à la problématique de l’intégration de capteurs plasmoniques performants et bas coût sur des dispositifs de type smartphone, en vue d’applications de diagnostic biomédical. A cette fin, nous proposons deux biocapteurs « smart ». Premièrement, un système de détection colorimétrique à base de nanoparticules d’or est mis en œuvre pour détecter de l’ADN. Le système intègre une détection synchrone logicielle mise en œuvre au sein du smartphone, où les signaux physiques transitent par la voie audio. Le processus de diagnostic prend moins de 15 minutes pour une limite de détection de 0.77 nM, approximativement 6 fois meilleure que la sensibilité usuelle d’un spectromètre UV-Vis conventionnel, à temps de mesure identique. Dans une seconde partie, un capteur à résonance plasmon de surface en configuration de Kretschmann, se distinguant par une sensibilité à la phase optique, est développé. Le design monolithique et compact repose sur un interféromètre à dédoublement latéral et une modulation de phase. Le contrôle et la lecture du prototype s’effectue également par smartphone. La modulation de phase est de type sinusoïdale et une sensibilité importante est obtenue, autour de 2,3 10-6 RIU avec une dynamique de 7 10-3 RIU, chiffres obtenus pour une puce optique standard et un temps d’intégration de 100 ms. Ce second dispositif est ensuite testé pour la détection de protéines (Troponine I cardiaque), en fonctionnalisant la surface par ADN Tro4 / In this thesis, we investigate the possibility and potential for integration of portable optical biosensor for diagnostic purposes. To this end, we propose two “smart” biosensor systems. In the first part of this thesis, a DNA biosensor combining single-wavelength colorimetry and digital Lock-in Amplifier within a smartphone is proposed. Utilizing full advantage of audio channel and digital signal processing capacity of a smartphone, we have built a handheld DNA AuNp colorimetry biosensor. Based on the results, the diagnostic process takes only 15 minutes of reaction time while offering a limit of detection around 0.77 nM which is 6 times better than a desktop UV-Vis spectrometer.In second part of the thesis, a Shearing interferometer based Surface Plasmon Resonance (SiSPR) biosensor is proposed. SiSPR allows for phase sensitive detection on conventional Kretschmann configuration. Its monolithic design reduces optical parts, costs and allows portable application. The essence of SiSPR is a reflective layer in addition to plasmonic layer. To extract phase information from SiSPR, a sinusoidal phase modulation is achieved by modulation of the laser injection current. For a 100 ms measurement and a standard optical chip, the sensitivity of the SiSPR is around 2.3x10-6 RIU with a dynamic range of 7.0x10-3 RIU, which is better than amplitude SPR devices. Finally, Tro4 DNA surface modification on the SiSPR chip is demonstrated for future cardiac Troponin I diagnostic