Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Au cours de ce travail de thèse, nous avons étudié la formation de nanogaps par électromigration dans des nanofils d'or. Cette technique consiste à provoquer la rupture d'un nanofil en lui appliquant de fortes densités de courant et peut être utilisée pour la caractérisation électrique de nano-objets. Néanmoins, les mécanismes de formation des nanogaps ne sont, à ce jour, pas encore totalement compris. L'étude en temps réel du processus d'électromigration par microscopie à force atomique a permis d'apporter un éclairage nouveau de la dynamique du processus. En effet, il apparaît que la structure globale du dispositif est définie dans les premiers temps de l'électromigration et nous avons montré que cette structure est directement liée à la microstructure du film métallique. Pour la première fois, des nanogaps ont été élaborés par électromigration dans des films monocristallins. Malgré l'absence de joints de grain, il est possible de former des nanogaps dans un matériau épitaxié. L'utilisation de ces matériaux permet d'obtenir des nanogaps avec une morphologie plus reproductible. Les propriétés de transports des nanogaps obtenus à partir de films polycristallins ont été caractérisées. Les caractéristiques obtenues présentent toutes des signatures particulières, attribuées à la présence d'agrégats d'or provenant de la procédure d'électromigration et/ou de polymères issus du procédé de nanofabrication. Ces résultats montrent la difficulté à réaliser des mesures à l'échelle de la molécule unique / We have studied the formation of nanogaps by électromigration of gold nanowires. Electromigration relies on large current densities to break a thin and narrow metallic wire and can be used for the electrical characterization of nanometer scale objects. Nevertheless, a complete description of the electromigration process is lacking. Real time atomic force microscopy during the electromigration process gave a new view the dynamic of the process. Indeed, this study reveals that the major structural changes appear at the early stage of the process and that the final global structure of the device is directly linked to the pre-existing microstructure. For the first time, we make nanogaps by électromigration of monocrystalline nanowires. We show that despite the lacking of grain boundaries, it is possible to form nanogaps in epitaxial materials. The morphology of those nanogaps is more reproducible. The electrical transport properties of the polycristalline nanogaps have been measured. The entire obtained characteristics show particular signature that can be attributed to the presence of gold cluster formed during the électromigration process and / or to polymer from the nanowire fabrication. These results show the difficulty to measure at the molecular scale

Lors d'un tremblement de terre, les transformations physiques et chimiques qui surviennent le long d'une zone de glissement vont conduire à l'altération et à la formation de minéraux. La gouge contient des minéraux magnétiques, qui peuvent être formés sous l'action combinée de la chaleur frictionnelle et par l'action chimique en relation avec les fluides. Ainsi, la gouge a la capacité de se comporter comme un enregistreur magnétique pendant un tremblement de terre. Il s'agit là d'une nouvelle méthode pour identifier les zones de tremblements de terre de glissement. En outre,les minéraux magnétiques initiaux, altérés, et néoformés peuvent être utilisés comme traceurs de certains processus physico chimique.Dans cette étude, nous étudions le magnétisme des roches et l'enregistrement paléomagnétique de la gouge de faille active de Chelungpu qui héberge, entre autres,la zone de glissement principale du tremblement de terre de Chi-Chi (Mw 7.6, 1999,Taiwan). Nous avons bénéficié pour cette étude d'échantillons non altérés provenant des carottes du forage B Taiwan Chelungpu-fault Drilling Project (TCDP). Nous avons également échantillonné la faille de Chelungpu à l'affleurement pour une caractérisation des nanoparticules. Cette caractérisation vise à estimer l'énergie de fracture dans la gouge de faille. / During an earthquake, the physical and the chemical transformations along a slip zone lead to alteration and formation of minerals within the gouge layer of a mature fault zone. The gouge contains magnetic minerals, which could be formed under the combined action of friction heat and fluid. Thus, gouge has the capacity to behave as a magnetic recorder during an earthquake. This constitutes a conceivable way to identify earthquakes slip zones. Besides, altered and neoformed magnetic minerals can be used as tracers of some earthquake processes. In this study, we investigate the rock magnetism and paleomagnetism of the Chelungpu fault gouge that hosts the principal slip zone of the Chi-Chi earthquake (Mw 7.6, 1999, Taiwan) using Taiwan Chelungpu-fault Drilling Project (TCDP) hole-B core samples. We also took a Chelungpu fault outcrop sample for identification of nanoparticle, which associated with fracture energy estimation in fault gouge.

La génération de second harmonique (SHG) est un processus non-linéaire qui se produit dans des structures non-centrosymétriques, comme c'est le cas de certains matériaux cristallins ou biologiques. Il consiste à coupler deux champs à la même fréquence pour générer un photon à la fréquence double. La manipulation de la polarisation des champs incidents donne accès à des informations microscopiques et structurales de l'échantillon. De plus, l'utilisation d'une détection polarisée permet de mettre à jour des effets physiques dans les assemblages moléculaires biologiques.Dans ces travaux de thèse, nous nous intéressons principalement à l'étude des fibres de collagène I en SHG polarisée dans des échantillons modèles et des tissus. Nous étendons cette étude à la compréhension de l'interaction des fibres avec leur environnement cellulaire pour ensuite, aborder la problématique des tissus cancéreux. Enfin, nous proposons différents modèles microscopiques de la structure du collagène, évalués par une méthode basée sur la décomposition en série de Fourier du signal polarisé, pour apporter un diagnostic quantitatif sur des échantillons biologiques. / Second harmonic generation (SHG) is a non-linear process which consists in coupling two photons at the same frequency to generate one photon at the twice frequency. It generally occurs in non-centrosymmetric samples such as crystals or molecular assemblies. The manipulation of the optical field polarization gives access to structural and microscopic informations. Moreover, using polarized detection allows to determine physical effects in molecular assemblies.In this Phd thesis, we are particulary interested in studying polarized SHG signals from collagen type I fibers in model samples and tissues. We extend our work to the investigation of the interaction of the fibers with their cellular environment. We also address the problematic of cancerous tissues.Finally, we propose several models for the microscopic structure of collagen, evaluated by a method based on the Fourier decomposition of the polarized SHG signal, to provide a quantitative diagnosis of biological samples.

Le phloème est un tissu complexe composé de plusieurs types cellulaires, dont les cellules compagnes et les tubes criblés. Il permet le transport et l’allocation à longue distance de nombreux métabolites et de macromolécules. Il existe dans les tubes criblés des structures très spécifiques dont la fonction est inconnue. Par exemple le rôle des protéines phloémiennes PP2 (Phloem Protein 2) qui ont été de longue date décrite dans les tubes criblés, reste à définir. Les protéines PP2 présentent une activité de lectine et d’interaction avec des protéines de sève phloémienne, suggérant un rôle dans le transport de macromolécules dans le phloème.Nous avons étudié la fonction de deux membres de la famille, PP2-A1 et PP2-A2, chez l’espèce modèle Arabidopsis thaliana. Plusieurs approches ont été mises en œuvre pour étudier ces protéines ; une approche cytologique, la recherche de partenaire protéiques et la création de lignées dérégulées pour l’expression des gènes PP2. L’étude de la localisation de PP2-A1 avec des étiquettes fluorescentes dérivées de la GFP a été réalisée par microscopie confocale, dans les cellules compagnes et dans les tubes criblés ; elle a montré que cette protéine présente une localisation nucléo- cytoplasmique dans les cellules compagnes tandis qu’elle forme des agrégats fixés dans les tubes criblés. Ceci suggère que PP2-A1 est ancrée dans les tubes criblés, à la membrane plasmique ou à certains organites. Des résultats similaires ont été obtenus pour PP2-A2. Sur la base de cette première étude, nous permettant d’identifier in vivo avec précision les cellules compagnes et les tubes criblés, et en utilisant plusieurs marqueurs subcellulaires fluorescents de référence, nous avons réalisé une cartographie subcellulaire fine des cellules compagnes et des tubes criblés in vivo. Cette approche a permis de décrire in vivo l’organisation subcellulaire de ces cellules. Elle a révélé la présence de nombreux organites présents à la périphérie des tubes criblés et de nature énigmatique, suggérant une activité importante dans ces cellules, en accord avec des données récentes de protéome des tubes criblés. L’étude de lignées surexprimant des versions étiquetées de PP2-A1 et PP2-A2 nous a permis de mettre en évidence un phénotype altéré avec des plantes qui présentent un retard de floraison et une biomasse plus importante. Ces observations suggèrent que PP2-A1 et PP2-A2 pourraient avoir un rôle dans la signalisation à longue distance. Ces travaux, qui illustrent la complexité des cellules du phloème, apportent ainsi des éléments nouveaux sur les voies de signalisation à longue distance utilisées par les végétaux pour coordonner leur croissance et leur développement. / The phloem is a complex tissue, made of several cell types, including companion cells and sieve elements. It plays an important role in long-distance transport and allocation of a number of metabolites and macromolecules. The sieve elements display specific structures yet uncharacterized and of unknown function. For instance the function of the phloem specific PP2 proteins (Phloem Protein 2) that have been described for long in the sieve elements is still unclear. PP2 proteins present lectin activity and bind to phloem sap proteins, suggesting a role in the transport of macromolecules in the phloem. We have investigated the function of two members of this family, PP2-A1 and PP2-A2 in the model species Arabidopsis thaliana. Different approaches have been undertaken to study these proteins: a cytological approach, the research of partners, and the study of downregulated and upregulated lines for the PP2-A1 and PP2-A2 genes. Localization studies of PP2-A1 fused to GFP-derived fluorescent tags have been realized by confocal laser scanning microscopy in the companion cells and the sieve elements; they showed that PP2-A1 presents a nucleocytoplasmic localization in the companion cells, whereas it forms fixed aggregates in the sieve elements. It suggested that PP2-A1 is anchored to the plasma membrane or to organelles inside the sieve elements. Similar results were obtained for PP2-A2. Making use of this study to accurately identify companion cells and sieve elements in vivo, and using additional subcellular fluorescent markers, we realized a fine mapping of companion cells and sieve elements in vivo. This study revealed the presence of numerous organelles of unknown identity at the periphery of the sieve elements, suggesting an important activity in those cells consistent with recent proteomics analysis of the sieve tubes. The study of plants overexpressing tagged versions of PP2-A1 and PP2-A2 enabled to observe an altered phenotype with delayed flowering and increased biomass, suggesting that PP2-A1 and PP2-A2 may play a role in long distance signalling. This work illustrates the complexity of phloem cell organization and functions, bringing new elements on long distance signalling pathway used by the plants to coordinate their growth and development.

"L'étude des cellules vivantes et la dentine humaine par microscopie confocale Raman" La microscopie confocale Raman est utilisée pour suivre des médicaments et des nanoparticules dans les cellules et dans les tissus durs. La microscopie Raman est non-invasive, ne nécessite aucun marqueur et permet une imagerie à haute résolution. Dans la première partie de l'étude cette méthode est utilisée pour suivre un médicament anticancéreux, le paclitaxel, au sein d'une lignée de cellules cancéreuses vivantes Michigan Cancer Foundation-7 (MCF-7). Les images Raman ont été traitées par un algorithme de partitionnement des données par k-moyennes pour détecter le paclitaxel dans les cellules. La distribution du paclitaxel dans les cellules est vérifiée par le calcul du coefficient de corrélation de Pearson entre le spectre de référence du traitement et les spectres de l'image entière. Le temps progressif de diffusion du paclitaxel dans toute la cellule est observé. Cette observation demande une étude complémentaire sur l'action pharmaceutique du produit, basé sur la liaison rapide de la tubuline libre au paclitaxel cristallisé. L'apoptose dans les cellules a été suivies par partitionnement de données et par corrélation. Le partitionnement de données a été utilisé pour déterminer la position de mitochondries dans les cellules ; le cytochrome C de distribution à l'intérieur des cellules est basé sur l'analyse de corrélation. L'apoptose des cellules est défini par le cytochrome C dans le cytoplasme de diffusion. Le cytochrome C agit comme un déclencheur pour l'activation en cascade des caspases, et sa libération par les mitochondries est un signe d'apoptose. La Co-localisation de cytochrome C est effectuée après incubation de cellules avec une concentration différente de paclitaxel. L'autre produit étudié est le dioxyde de titane. Le titane est largement utilisé pour les matériaux orthopédiques et dentaires implantés dans le corps humain. Il est inévitable que le sang prenne contact avec la surface de l'implant et des nanoparticules. Les nanoparticules de dioxyde de titane ont été suivies en intracellulaire dans les cellules MCF-7 et TERT épithéliales humaines (lignée orale cellulaire de kératinocytes OKF6/TERT-2). La détection des nanoparticules et leur toxicité ont été étudiées en utilisant deux méthodes d'analyse. La microscopie confocale Raman a également été utilisée pour réaliser l'analyse structurale et chimique de la jonction émail-dentine-résine et de la carie dentaire, grâce à une analyse précise des constituants minéraux et organiques. La microscopie Raman associée à des méthodes d'analyse de données ouvre de nouvelles portes pour la recherche en biologie-santé et en particulier en odontologie. / "The Study of living cells and human dentin by confocal Raman microscopy"Confocal Raman microscopy is employed to trace drugs and nanoparticles intracellular and in hard tissues. Raman spectroscopy a non-invasive, label-free and high spatial resolution imaging technique in first part of the study is being used to trace the anticancer drug paclitaxel in living Michigan Cancer Foundation-7 (MCF-7) cells. An analytical method was developed and applied to Raman data acquired. The Raman images were treated by K-mean cluster analysis to detect the drug in cells. Distribution of paclitaxel in cells is verified by calculating the Pearson correlation coefficient between the reference spectrum of the drug and the whole Raman image spectra. A time dependent gradual diffusion of paclitaxel all over the cell is observed suggesting a complementary picture of the pharmaceutical action of this drug based on rapid binding of free tubulin to crystallized paclitaxel. The apoptosis in the cells were followed by post-measurement analysis including K-mean clustering and Pearson correlation coefficient. K-mean clustering was used to determine mitochondria position in cells and cytochrome c distribution inside the cells was based on correlation analysis. Cell apoptosis is defined as cytochrome c diffusion in cytoplasm. Cytochrome c acts as a trigger for the activation of the caspase cascade, and its release from mitochondria is a sign of apoptosis. Co-localization of cytochrome c is done after cell incubation with different concentration of paclitaxel. The other product used was titanium dioxide. Titanium has been widely used for orthopedic and dental implant materials. When biomaterial is implanted into the human body, it is unavoidable that blood will contact the implant surface and nanoparticles. The question is: do these nanoparticles cause toxicity? Titanium dioxide nanoparticles were followed intracellular in MCF-7 cells and TERT epithelial human oral keratinocyte cell line (OKF6/TERT-2). Detection of nanoparticles and their toxicity were studied using two analytical methods. Confocal Raman microscopy were also used to obtain Structural analysis and chemical profile of Enamel – Dentine- Resin and Raman map of decay and sound dentin samples, through accurate analysis of the mineral and organic components. The Raman spectroscopy combined with this novel method developed in this study, will provide accurate finger prints of chemical composition and by post-measurement analysis of the data acquired more information would be obtained, which might open new gates in pharmaceutical and dentistry researches.

Dans cette thèse, nous nous intéressons à la restauration d'image tridimensionnelle de microscopie de fluorescence. Deux difficultés majeures dans ce système d'imagerie sont traitées. La première est le flou variable en profondeur qui est dû aux aberrations induites par la variation des indices de réfraction dans le système optique et le spécimen imagé. La deuxième est le bruit qui est principalement dû au processus de comptage de photons. L'objectif de cette thèse est de réduire ces distorsions afin de fournir aux biologistes une image de meilleure qualité possible. Dans la première partie de cette thèse, nous étudions les modèles d'approximation du flou variable en profondeur et nous choisissons un modèle adéquat au problème d'inversion. Dans ce modèle, la réponse impulsionnelle (RI) variable en profondeur est approchée par une combinaison convexe d'un ensemble de RIs invariables spatialement. Nous développons pour ce modèle deux méthodes rapides de restauration non-aveugle par minimisation d'un critère régularisé, chacune d'elles est adaptée au type de bruit présent dans les images de microscopie confocale ou à champ large. Dans la deuxième partie, nous abordons le problème de restauration aveugle et proposons deux méthodes dans lesquelles le flou variable en profondeur et l'image sont conjointement estimés. Dans la première méthode, la RI est estimée en chaque voxel du volume considéré afin de laisser une grande liberté sur la forme de la RI, tandis que dans la deuxième méthode, la forme de la RI est contrainte par une fonction gaussienne afin de réduire le nombre de variables inconnues et l'espace des solutions possibles. Dans ces deux méthodes d'estimation aveugle, l'effet des aberrations optiques n'est pas efficacement estimé en raison du manque d'information. Nous améliorons ces méthodes d'estimation en alternant des contraintes dans les domaines fréquentiel et spatial. Des résultats sont montrés en simulation et sur des données réelles. / In this thesis, we focus on the restoration of three-dimensional image of fluorescence microscopy. Two major difficulties in this imaging system are considered. The first one is the depth-variant blur due to aberrations induced by the refractive index variation in the optical system and the imaged specimen. The second difficulty is the noise due to the photon counting process. The goal of this thesis is to reduce these distortions in order to provide biologists with a better image quality. In the first part of this thesis, we study the approximation models of the depth-variant blur and choose an appropriate model for the inversion problem. In that model, the depth-variant point spread function (PSF) is approximated by a convex combination of a set of space-invariant PSFs. We then develop for that model two fast non-blind restoration methods by minimizing a regularized criterion, each of these methods is adapted to the type of noise present in images of confocal or wide field microscopy. In the second part, we address the problem of blind restoration and propose two methods where the depth-variant blur and the image are jointly estimated. In the first method, the PSF is estimated at each voxel in the considered volume in order to allow high degree of freedom on the PSF shape while in the second method, the shape of the PSF is constrained by a Gaussian function in order to reduce the number of unknown variables and the space of possible solutions. In both blind estimation methods, the effect of optical aberrations is not effectively estimated due to the lack of information. We thus improve these estimation methods by alternating some constraints in the frequency and spatial domains. Results on simulated and real data are shown.

La fonction de cytolyse est un mécanisme majeur des effecteurs du système immunitaire pour éliminer les cellules infectées ou tumorales. Cette fonction associe l'activité de la perforine, qui forme des pores dans la membrane d'une cellule cible, à la sécrétion de protéases: les granzymes. Ces dernières sont des molécules pro-apoptotiques qui induisent la mort de la cellule cible. Les granzymes et en particulier granzyme B ciblent plusieurs voies intracellulaires complémentaires pour assurer l'efficacité de la cytolyse. Or il est difficile d'observer directement la fonction de cytolyse au cours de réponse immunitaire in vivo dans des conditions physiologiques. Dans les travaux présentés dans cette thèse, nous avons développé un nouveau modèle qui permet de suivre la fonction de cytolyse en temps réel par l'expression d'une protéine de fusion fluorescente GZMB-tdTomato. Les résultats obtenus par expression rétrovirale ont montré que la protéine de fusion est correctement exprimée dans les vésicules cytolytiques qui deviennent fluorescentes. Dans un second temps, nous avons réalisé un nouveau modèle murin qui exprime GZMB-tdTomato de manière substituée au GZMB natif par recombinaison homologue (Knock In). Nous avons mis en évidence que la protéine de fusion conserve l'activité catalytique de la protéine native et ses caractéristiques (conditions d'expression, de maturation, de sécrétion et demeure active après le passage dans la cellule cible lors de la cytolyse). En utilisant un modèle murin exprimant un TCR transgénique nous avons pu suivre le déroulement de la fonction de cytolyse de lymphocytes cytotoxiques en temps réel par video microscopies. / Cytolysis is a major function used by the immune system's effectors to kill infected or tumor cells. Cytolysis depends on the pore forming protein perforin and the secretion of proteases of the granzyme family. Granzymes, including granzyme B (GZMB) have pro-apoptotic features and induce target cell death. Several complementary pathways are triggered by granzymes to ensure efficient cytolysis. It remains difficult to directly observe cytolysis during in vivo immune responses under physiological conditions. In this PhD we developed a new model to visualize cytolytic function in real time by expression of a fusion protein: GZMB-tdTomato. Results obtained from retroviral transduction showed that the fusion protein is correctly expressed in cytolytic vesicles, which became fluorescent. We then constructed a new mouse model by homologous recombination (Knock In) that express GZMB-tdTomato substituted for the native GZMB. The fusion protein conserves the catalytic activity of GZMB and its features (expression, maturation, secretion conditions) and remains active after its passage into target cells. Using TCR transgenic OTI cells, we followed the sequence of events of cytolysis from lymphocytes in real time by videomicroscopy. We also observed the cytolytic vesicles relocalization towards the cell contact zone and the death of target cell by cytolysis. Finally, we studied in vivo differentiation of naïve lymphocyte to cytolytic effector cells (the acquisition of cytolysis) and target cell death after bacterial infection.

Ce travail de recherche s’inscrit dans un axe de diagnostic du cancer via le développement d’une méthode optique pour la caractérisation fonctionnelle de tissus. La technique de gap-FRAP (Fluorescence Recovery After Photobleaching) permet l’étude quantitative de la fonctionnalité des jonctions gap. La majorité des cellules néoplasiques se caractérisent par une modification du niveau d’expression et/ou de la fonctionnalité des jonctions gap par comparaison à leurs homologues saines. Particulièrement utilisée in vitro, la technique de gap-FRAP restait cependant anecdotique ex vivo. Nous avons validé la faisabilité du transfert de cette méthode sur tissus et organes ex vivo. A partir de cellules de statuts différents en expression et en distribution des connexines, nous avons caractérisé la calcéine-AM comme étant une sonde fluorescente adaptée pour des mesures sur tissus. Puis nous avons développé un modèle d’ingénierie systéme pour l’analyse comparative des données de recouvrement de fluorescence sur des modèles bi et tridimensionnels. Nous avons transposé ces conditions préalablement définies sur organe entier ex vivo : la vessie de rat. Un marquage multiple a été optimisé avec une sonde fluorescente pour le tracking des cellules cancéreuses dans la vessie ex vivo, un marqueur pour l’identification histologique de l’urothélium et la calcéine-AM pour mesurer la CIGJ. Le gap-FRAP a été utilisé pour la première fois pour différencier le degré de communication intercellulaire gap jonctionnelle entre le tissu sain et néoplasique sur un organe entier ex vivo, ouvrant des perspectives pour le diagnostic du cancer de la vessie corrélé à la modification de la CIGJ. / Optical methods to characterize tissues for tumor detection are an area of diagnosis research. Gap-FRAP (Fluorescence recovery after photobleaching) technique is used to estimate gap junctions functionality. The majority of malignant cells are characterized by a modification of the number and functionality of gap junctions, compared to their healthy counterparts. Particularly used in vitro, we optimized the use of gap-FRAP technique for a potential transfer on tissues and organs ex vivo. We resolved using cell lines with a different connexin expression and distribution pattern, the choice of a fluorescent dye for further in vivo measurements: calcein-AM. The following stage consisted in developing a system engineering model for the comparative analysis of the fluorescence recovery data for bi-dimensional and three-dimensional (spheroid) models. The conditions previously defined have been transposed in entire organ, bladder rat. Multi-color staining was applied using a fluorescent dye to track to tumors cells in bladder ex vivo, a fluorescent marker to distinguish cellular details of the entire urothelium, and calcein-AM to assess GJIC. Gap-FRAP was used for the first time to differentiate intercellular communication degree between healthy and tumor tissue in entire organ ex vivo opening perspectives for the diagnosis of the bladder cancer correlated to feature modifications of GJIC.

L'étude porte sur la réalisation d'un support plan fonctionnalisé et structuré pour l’immobilisation d’un nombre limité de biomolécules sondes telles que des carbohydrates, des protéines, des anticorps. Les supports sont des lames commerciales silanisées avec un amino-silane sur les deux faces. Des composés fluorescents porteurs de fonctions aldéhyde ou acide ont été utilisés comme modèles pour valider les greffages covalents sur ces supports via une liaison imine ou amide respectivement. Pour localiser les greffages, des puits en polymère de géométrie contrôlée à base de résine SU-8 ont été directement fabriqués sur la surface par un procédé de stéréolithographie. Le greffage de deux fluorophores acides a été réalisé simultanément dans différents puits sur un même support. La localisation des réactions a été caractérisée par spectroscopie et/ou microscopie de fluorescence. Pour permettre la fixation de composés porteurs d’une ou plusieurs fonctions aldéhyde, tels que des anticorps après oxydation des carbohydrates présents sur leur fragment Fc, un bras espaceur de type polyoxyéthylène terminé par une fonction aminooxy ou hydrazide a été synthétisé directement sur la surface des supports. / This work deals with manufacturing functionalized and patterned plane substrates to immobilize a few biological components like carbohydrates, proteins or antibodies. The substrates are commercial glass microscope slides silanized with an amino linker on the two sides. Covalent binding on such substrates has been successfully tested using fluorophores as models with carboxylic acid or aldehydic function to afford respectively amide or imine bond with the amino functions of the support. To localize chemical graftings, polymeric regular and geometrically controlled wells were manufactured from SU-8 photoresist directly on the glass support, applying stereolithography process. Grafting of two fluorophores with carboxylic functions activated by N-hydroxysuccinimide was led simultaneously inside polymeric wells on a same substrate. Localized bindings were characterized by fluorescence spectroscopy and/or microscopy. In order to enable covalent attachment through a stable chemical linkage of aldehydic components, like antibodies after oxidation of their Fc fragment, aminooxy and hydrazide terminated polyoxyethylene spacers were directly synthesized on substrates surface