Des aciers renforcés par dispersion de nano-particules d'oxide de titane et d'yttrium (Y-Ti-O ODS), irradiés et non irradiés, ont été éxaminés par microscopie électronique en transmission à balayage couplée à la spectroscopie de perte d'énergie des électrons (STEM-EELS) pour étudier leurs structures chimiques et les effets des radiations. Des méthodes analytiques telles que l'analyse statistique multivariée (MVA) et l'ajustement de courbes sur les spectres EELS sont utilisées afin de réaliser une quantification élémentaire ou d'étudier les structures fines des seuils (ELNES). Les traitements MVA permettent d'extraire les réponses spectrales indépendantes des spectre-images (SI) pour mieux comprendre la distribution spatiale des états de valence des différentes expèces. L'observation de poudres d'ODS après le broyage (MA) montre que les nano-particules (NPs) précipitent durant le traitement thermique qui suit, (consolidation). Pour les échantillons consolidés et non irradiés, les particules de taille moyenne (> 3-4 nm) adoptent une structure pyrochlore imparfaite (Y2Ti2O7-d) avec une structure coeur-coquille (Y-Ti-O)-Cr complétée par une couche de Ti réduit également dépourvue en Y. Une ségrégation de Cr est également observée aux joints de grains. Le ratio O/Ti de 3.2 et la non homogénéité de la distance entre plans (222) est due à des défauts dans la structure de la particule, confirmant ainsi qu'elles présentent de nombreux défauts et sont non stoechiométriques. L'ICA nous permet de générer des cartes d'état de valence mais aussi d'extraire une réponse interfaciale Ti-Cr; à l'interface, les atomes Ti et Cr diffusent sur une distance de quelques Å. Pour les plus petites particules, nos résultats montrent qu'elles peuvent consister soit en une structure pyrochlore hautement déficiente en oxygène (Y2Ti2O6+d) soit en une structure chimique inconnue YaTibOc. Le ratio O/Ti diminue de 3-3.5 vers des valeurs inférieures à 1 pour des tailles allant de 4 à 1.8 nm. Les plus grandes particules (de quelques dizaines à quelques centaines de nm), des oxides et/ou nitrures Ti-O, N-Ti, Y-Ti-O ne représentent qu'une faible proportion du nombre total des NPs (< 1%). Pour étudier les effects des irradiations aux neutrons, un certain nombre d'échantillons ODS furent implantés avec des ions He+ et irradiés avec des ions Fe+. Après l'irradiation et l'implantation, une distribution homogène de bulles d'He à haute pression est observée ainsi que des déplétions, ségrégations et précipitations de Cr induites par irradiation (RID, RIS et RIP). Les bulles sont fréquemment observées piégées à l'interface NP-matrice, cependant elles sont aussi observées piégées par des dislocations, libres dans la matrice et aux joints de grains. Le seuil He-K (21.218 eV pour les atomes libres) se déplace vers des énergies plus hautes (ΔE = 0.5 à 4 eV); nous montrons que ce déplacement est corrélé avec la densité d'He. La quantification de l'He est réalisée à l'aide de trois méthodes différentes: différence spatiale, ajustement de courbes, MVA. Les valeurs de la densité et de la pression atteignent 100 nm-3 et 8 GPa respectivement. Cependant, avec des barres d'erreur pouvant atteindre 30%, les mesures de la pression sont plutôt semi-quantitatives. La méthode d'ajustement de courbes permet une cartographie de la position et de l'intensité du pic He-K et donc une cartographie de la densité pour des bulles individuelles. Les réponses spectrales de bulles individuelles peuvent être extraites d'un SI contenant plusieurs bulles à différentes densités en utilisant l'ICA ou l'analyse de la composante vertex (VCA). Nos mesures montrent que les bulles plus grandes que 4 nm sont sous préssurisées ou à l'équilibre avec la matrice Fe-Cr. En dessous de 3.5 nm, la pression de l'He augmente rapidement, correspondant à un état surpressurisé. / Irradiated and non-irradiated (Y-Ti-O) oxide-dispersion-strengthened (ODS) steels are investigated by scanning transmission electron microscopy coupled with electron energy-loss spectroscopy (STEM-EELS) to study their chemical structure and the effects of radiation. Analytical methods such as multivariate statistical analysis (MVA) and EELS curve-fitting are carried out to achieve elemental quantification or study the edge fine structures (ELNES). Using MVA, the spectrum-images (SI) can be separated into independent spectral responses to gain insights into the valence state of various elements such as Ti or Cr. Investigations on post-mechanical-alloyed (MA) powders show that the nanoparticle (NP) precipitation occurs only after a further high-temperature treatment (consolidation). In non-irradiated consolidated samples, medium-sized NPs (> 3-4 nm) are found to adopt a Y2Ti2O7-d defective pyrochlore structure with a (Y-Ti-O)-Cr core-shell structure with a reduced-Ti layer also depleted in Y. Cr is also shown to segregate to the grain boundaries in non-irradiated samples. The measured O/Ti ratio of 3.2 found for medium-sized NPs and the observed non-homogeneity of the inter-reticular distance d222 through the particle is interpreted as being due to defects in the particles’ structure; it is indeed confirmed that Y2Ti2O7 medium-sized NPs in ODS steels present numerous defects and are non-stoichiometric. The Ti oxidation state is shown to vary from the centre of the NPs to their periphery from Ti4+ in distorted Oh symmetry to a valency often lower than 3+. Independent component analysis (ICA) allows us to generate bonding maps and extract a Ti-Cr interfacial response. An inter-diffusion of Ti and Cr atoms is observed at this interface. The smallest NPs present a different and ill-defined structure and interface with the Fe-Cr matrix. They either consist of a highly oxygen-deficient pyrochlore structure (Y2Ti2O6+d) or an unknown YaTibOc chemical structure. The O/Ti ratio decreases from 3-3.5 to below 1 for an NP size going from 4 to 1.8 nm. A few large particles (sized from tens to hundreds of nm) present a N-Ti-O or Ti-O chemistry but represent only a small percentage of all the NPs (< 1%). To study the neutron irradiation-induced changes, a number of ODS samples were implanted with He+ ions and irradiated with Fe+ ions. After irradiation, they display a homogeneous distribution of high-pressure He bubbles and radiation-induced Cr depletion, segregation and precipitation (RID, RIS and RIP). The He bubbles are frequently trapped at the NP-matrix interface, although bubbles can exist freely in the matrix, trapped by dislocations and at grain boundaries. The He-K line (21.218 eV for free atoms) shifts to higher energy in the bubbles (ΔE = 0.5 to 4 eV); this is shown to be correlated with the He density. He quantification is carried out with three different methods: spatial difference, curve-fitting and MVA. The density and pressure values are found to reach 100 nm-3 and 8 GPa respectively, although the pressure measurement is only semi-quantitative given that the error bars can reach 30%. The curve-fitting method allows us to map the He-K energy position and intensity, yielding the density, in individual bubbles. The spectral response of individual bubbles can be separated in an SI containing many bubbles at different densities using ICA or vertex component analysis (VCA). Bubbles larger than 4 nm are shown to be under-pressurized or at equilibrium with the Fe-Cr matrix. Below 3.5 nm, the He pressure is shown to increase markedly, passing into the over-pressurised regime.

Cette thèse aborde la problématique de la restauration d’images 3D de noyaux cellulaires fluorescents issues de la microscopie 2-photons à balayage laser d’animaux observés in vivo et in toto au cours de leur développement embryonnaire. La dégradation originale de ces images provient des limitations des systèmes optiques, du bruit intrinsèque des systèmes de détection ansi que de l’absorption et la diffusion de la lumière dans la profondeur des tissus. A la différence des propositions de “débruitage” de l’état de l’art, nous proposons ici une méthode qui prend en compte les particularités des données biologiques. Cette méthode, adaptation à la troisième dimension d’un algorithme utilisé dans l’analyse d’image astronomique, tire parti de connaissances a priori sur les images étudiées. Les hypothèses émises portent à la fois sur la détérioration du signal par un bruit supposé Mixe Poisson Gaussien (MPG) et sur la nature des objets observés. Nous traitons ici le cas de noyaux de cellules embryonnaires que nous supposons quasi sphériques.L’implémentation en 3D doit prendre en compte les dimensions de la grille d’échantillonnage de l’image. En effet ces dimensions ne sont pas identiques dans les trois directions de l’espace et un objet sphérique échantillonné sur cette grille perd cette caractéristique. Pour adapter notre méthode à une telle grille, nous avons ré-interprété le processus de filtrage, au coeur de la théorie originale, comme un processus physique de diffusion. / In this this document, we present a method to denoise 3D images acquired by 2-photon microscopy and displaying cell nuclei of animal embryos. The specimens are observed in toto and in vivo during their early development. Image deterioration can be explained by the microscope optical flaws, the acquisition system limitations, and light absorption and diffusion through the tissue depth.The proposed method is a 3D adaptation of a 2D method so far applied to astronomical images and it also differs from state-of the of-the-art methods by the introduction of priors on the biological data. Our hypotheses include assuming that noise statistics are Mixed Poisson Gaussian (MPG) and that cell nuclei are quasi spherical.To implement our method in 3D, we had to take into account the sampling grid dimensions which are different in the x, y or z directions. A spherical object imaged on this grid loses this property. To deal with such a grid, we had to interpret the filtering process, which is a core element of the original theory, as a diffusion process.

Haloferax volcanii est une archée appartenant au phylum euryarchaeota et à la classe des Halobacteriales. Les mécanismes liés à la réplication et à la réparation chez les archées sont très similaires à ceux rencontrés chez les eucaryotes, faisant d’H. volcanii un des organismes modèle pour l’étude de la réplication et de la biologie des archées, notamment car de nombreux outils génétiques sont disponibles chez cet organisme. De plus, H. volcanii possède la particularité de pouvoir avoir toutes ses origines de réplication supprimées, soulevant beaucoup de questions sur les mécanismes impliqués. Plusieurs hypothèses ont été émises sur la façon dont cette souche initie sa réplication, basées soit sur la dérivation des mécanismes liés à la réparation de l’ADN, soit sur un mécanisme d’initiation de la réplication indépendant des origines. Afin d’étudier ces mécanismes liés à la réplication, j’ai construit une souche d’H. volcanii capable d’incorporer des analogues de la thymidine dans l’ADN lors de sa synthèse grâce à la délétion de gènes impliqués dans la voie de biosynthèse de la thymidine. Des temps de cultures courts de la souche en présence d’un analogue permet son incorporation au niveau des zones actives de réplication pour marquer spécifiquement l’ADN néosynthétisé. L’immunodétection de l’analogue incorporé à l’ADN, en travaillant en cellule entière avec un microscope à fluorescence, permet la localisation de l’ADN néosynthétisé, reflétant ainsi les régions où la réplication est active. Ces analyses révèlent majoritairement 2 à 3 régions de réplication actives dans des cellules en prolifération, sans localisation particulière. Ces régions ont déjà été observées en étudiant la localisation d’une protéine clé de la réplication (RPA2) fusionnée à la protéine verte fluorescente GFP, confirmant sa localisation aux zones actives de réplication. Une étonnante variabilité observée d’une cellule à l’autre et suggère une initiation probabiliste de la réplication. Il est également étonnant de n’observer qu’aussi peu de zones actives de réplication, comparé au fort taux de polyploïdie de cette souche. Se pose alors la question de ce à quoi correspondent ces zones de réplication. Pour cela, j’ai développé chez H. volcanii la technique de peignage moléculaire permettant d’isoler des molécules individuelles d’ADN et révéler spécifiquement les analogues incorporés pour pouvoir déterminer le nombre de copies du chromosome qui sont actives lors de la réplication, ainsi que le nombre d’origines actives sur chacune des copies. J’ai également développé une technique de Time-lapse dans le but de suivre ces régions au cours du temps en observant les divisions cellulaires directement sous le microscope. / Haloferax volcanii is an archaea belonging to the phylum euryarchaeota and the class Halobacteriales. The mechanisms related to replication and repair in archaea are very similar to those found in eukaryotes, making H. volcanii a relevant model organisms for the study of replication and archaeal biology, especially since many genetic tools are available. Interestingly, all replication origins can be removed from the chromosome of H. volcanii, raising many questions about the mechanisms involved. Several hypotheses have been proposed on how this strain initiates its replication, either relying on recombination-dependent replication initiation or an origin-independent mechanism. In order to study these replication-related mechanisms, I have constructed a strain of H. volcanii able to incorporate thymidine analogues into DNA during its synthesis by deleting genes involved in the thymidine biosynthesis pathway. A short-time cultures of the strain in the presence of an analogue allows its incorporation in nascent DNA. By immunodetection of the analog coupled to fluorescence microscopy observation of whole cells, it is possible to investigate the localization of neosynthesized DNA,which reflect the regions where replication is active. These analyses revealed mainly 2 to 3 active replication regions per cell, without any particular location. These regions had already been observed by studying the localization of a key replication protein (RPA2) fused to the fluorescent green protein GFP, confirming its location in active replication areas. A surprising variability in the number of replication foci from one cell to another was observed, suggesting a probabilistic initiation of replication. It is also surprising to observe so few active replication areas compared to the high polyploidy of this strain. This raises the question of what these replication areas correspond to. For further understanding, I developed for H. volcanii molecular combing, to isolate individual DNA molecules and specifically reveal incorporated analogues to determine the number of copies of the chromosome that are being replicated, as well as the number of active origins on each of the copies. I have also developed time-lapse approach to track these regions over time by monitoring cell proliferation directly under the microscope.

L’imagerie par résonnance magnétique (IRM) est devenue un outil incontournable en recherche biomédicale. Le développement d’outils de neuroimagerie pour le petit animal est primordial pour valider des hypothèses biologiques et tester l’efficacité de nouvelles thérapies. Dans le contexte de la maladie d’Alzheimer (MA), l’utilisation d’IRM à haut champ magnétique permet l’imagerie des plaques amyloïdes, signature moléculaire de cette pathologie. Cependant, seule une faible proportion de ces lésions sont détectées et aucune méthode de neuroimagerie ne permet actuellement d’imager les dégénérescences neurofibrillaires, deuxième signature microscopique de la MA. Dans cette thèse, deux méthodes complémentaires, utilisant différents agents de contraste à base de Gadolinium (Gd), ont été étudiées pour améliorer la détection des plaques amyloïdes par IRM. La première partie de cette thèse s’est intéressée à la méthode du « Gd- staining ». Une étude comparative réalisée sur différents modèles murins d’amyloïdose et sur des primates non-humains, a permis de mieux comprendre les mécanismes impliqués dans la détection des plaques amyloïdes grâce à cette technique. Également, nous avons montré pour la première fois qu’il est possible d’imager les lésions Aβ humaines, en post mortem, par Gadolinium-staining. La deuxième partie de cette thèse s’est intéressée au développement d’agents de contraste vectorisés, ciblant spécifiquement les lésions de la MA. Ces molécules seraient capables de traverser spontanément la barrière hémato-encéphalique, principale limite au développement de molécules à visée cérébrale, et permettraient de cibler spécifiquement les deux lésions caractéristiques de la MA. Ces propriétés font de ces molécules de outils potentiels intéressants pour l’imagerie cérébrale de la MA. / Magnetic resonance imaging (MRI) has become a key tool for both clinical and preclinical research. Developing innovative neuroimaging techniques specifically designed for small animal models is therefore crucial to validate biological hypotheses and screen new drugs. Amyloid plaques and neurofibrillary tangles are the major lesions characterizing Alzheimer’s disease (AD) and intensive research has been carried out in order to enable the accurate detection of amyloid plaques using high-field MRI. However, only a small portion of plaques are spontaneously detected by MRI and no method is so far available for neurofibrillary tangles imaging. Here, we develop two contrast-enhanced MRI techniques to improve amyloid plaques detection using high-field MRI. The first part of this work focuses on Gadolinium-Staining for amyloid plaques detection by MRI. We performed a comparative study between mice model of amyloi-dosis and non-human primate models, which al-lowed us to gain a better understanding of the origin of the contrast induced by amyloid plaques when performing contrast-enhanced MRI. We also showed for the first time that Gd-stained MRI is able to detect amyloid plaques in human-AD brain tis-sues. The second part of this manuscript describes two novel single-domain antibodies (VHHs or nano-bodies) that are able to specifically recognize and bind amyloid plaques or neurofibrillary tangles. The detection of intracerebral targets with imaging probes is challenging due to the non-permissive nature of the blood-brain barrier. Interestingly, VHH exhibiting a basic isoelectric point are able to transmigrate across the blood-brain barrier, thus making them promising tools for in vivo imaging of AD’s lesion at high-field MR.

Ce travail s’inscrit dans le contexte des microscopies optiques à très haute résolution. Nous proposons un nouveau concept de sonde active pour la microscopie optique en champ proche (SNOM), exploitant les effets de génération de second harmonique (SHG) de molécules. L’idée développée vise à s'affranchir de l’une des principales limitations des sondes actives fluorescentes réalisées jusqu'à présent : l'accrochage des sondes à l'extrémité de la pointe SNOM, étape toujours délicate et souvent peu fiable. Pour ce faire, nous avons mis en œuvre une technique qui consiste à utiliser la localisation du champ électrique au sein d’une jonction pointe métallique-substrat conducteur immergée dans une solution de molécules non-linéaires dipolaires. L’interaction champ-molécules entraine l’orientation locale un nano-volume de ces molécules dont l’excitation par un laser permet ensuite la génération d’un signal de second harmonique. Après avoir validé ce concept dit de « nano-EFISHG » (Electric Field Induced SHG) nous avons conçu un nouveau banc expérimental, dédié à l'imagerie de second harmonique haute résolution : celui-ci a permis d'obtenir les premières images présentant un contraste de second harmonique sur un échantillon structuré à l'échelle micronique.Nous avons ensuite travaillé à l’optimisation de la résolution de l’expérience mise en place : nous avons notamment démontré la possibilité de tirer parti d’effets d’exaltation locale du champ électromagnétique se produisant à l'extrémité de pointes ou de nano-objets métalliques. L’extrapolation des résultats obtenus montre que de telles exaltations devraient permettre d’atteindre des résolutions de l’ordre de 50 nm. / This work was achieved within the context of high resolution optical microscopy. We propose a new concept of active probe for near-field optical microscopy (SNOM), exploiting the effect of second harmonic generation (SHG) of molecules. The idea intends to avoid one of the main limitations of currently developed fluorescent active probes: the anchoring of the probes at the end of a SNOM tip which is a very delicate and often unreliable step. The technique implemented here consists in using the electric field localization in a metallic tip – conducting substrate junction immersed in a solution containing dipolar non-linear molecules. The interaction between the molecules and the electric field gives rise to the local orientation of a nano-volume of these molecules whose excitation by a laser allows generation of a second harmonic signal.After validation of this concept named as “nanoEFISHG” (Electric Field Induced SHG) we have designed a new experimental setup, dedicated to high resolution second harmonic imaging. Successful implementation of this setup has leaded to the recording of the first images presenting a second harmonic contrast on a sample structured at the micronic scale. Next step has consisted in working towards optimization of the experimental resolution: we have especially study the possibility of taking advantages of local field enhancement effects occurring at metallic nano-structures or sharp tip’s apex. The extrapolation of the obtained results shows that such effects should allow to reach resolutions about 50 nm.

La Recombinaison Homologue (RH) est une des voies majeures, hautement fidèle, de réparation des cassures double brin de l’ADN et du redémarrage des fourches de réplication arrêtées ou bloquées. La RH utilise une séquence homologue pour réparer avec précision l'ADN. Elle est essentielle pour le maintien de la stabilité des génomes dans tous les organismes et également pour assurer la transmission et l'échange de l'information génétique pendant la méiose. L'étude mécanistique de la RH est importante pour comprendre l'instabilité génétique, la perte d'hétérozygotie, les aberrations chromosomiques, la mort cellulaire et la cancérogenèse associée à une RH déficiente. Les étapes clés de la RH et les protéines impliquées sont très conservées dans toutes les espèces. Chez Saccharomyces cerevisiae, la recombinase Rad51 forme un filament présynaptique avec l’ADNsb qui est capable de rechercher les homologies de séquences dans tout le génome, en partenariat avec d'autres partenaires protéiques. Une fois l'homologie identifiée, une structure de D-loop (pour Displacement loop) est formée pour favoriser l'échange de brins. Le moteur moléculaire Rad54 assiste Rad51 dans la formation de la D-loop. Son rôle dans la recherche d'homologie et la formation des complexes synaptiques, avant mêle la formation de la D-loop reste un sujet de débat. Cette thèse porte sur mes travaux d’étude in vitro des mécanismes de formation de la D-Loop, en utilisant des protéines de la RH purifiées Rad51 et Rad54 avec d'autres partenaires protéiques et des substrats d'ADN synthétisés, mimant les structures de la RH. J'ai utilisé la microscopie électronique (ME) pour visualiser directement l'ADN et les complexes ADN-protéines intervenant au cours de la formation de D-loop in vitro avec Rad51, Rad54 et un mutant de Rad54. Ces approches d’imagerie, combinées à la biochimie suggèrent que Rad54 est crucial pour la recherche d'homologie et la formation du complexe synaptique, avant la formation de la D-loop, dans une coopération étroite avec Rad51. J'ai également montré que les paralogues de Rad51, Rad55-Rad57, stimulent la formation de la D-loop et que cet hétérodimère présente une activité ATPase dix fois plus forte que Rad51. Par ailleurs, j'ai également développé d'autres outils méthodologiques en ME et en microscopie à force atomique à haute vitesse (HS-AFM) pour mieux caractériser différents intermédiaires de la RH. / Homologous recombination (HR) is a major high-fidelity DNA repair pathway of double-stranded breaks and recovery of stalled and collapsed replication forks. HR uses a homologous template to accurately repair DNA that is essential for maintaining genomic stability in all organisms and to ensure the transmission and exchange of the genetic information during meiosis. The importance of HR study is highlighted by genetic instability, loss of heterozygosity, chromosomal aberrations, cell death and carcinogenesis associated with a defected HR. The key recombinational stages and proteins are well conserved throughout species. In Saccharomyces cerevisiae, the Rad51 recombinase forms a presynaptic filament with ssDNA that along with other protein partners is able to search for homology within the entire genome. Once homology is identified, a Displacement-loop (D-loop) is formed to promote strand-exchange. The Rad54 molecular motor assists Rad51 in the D-loop formation, and it is still a matter of debate whether it also plays a key role in homology search and synaptic complex formation, prior to D-loop. This dissertation covers my in vitro assays using purified key HR proteins Rad51 and Rad54, other protein partners and designed DNA substrates, mimicking HR structures.I used electron microscopy (EM) to directly visualize the HR DNA and DNA-protein complexes generated by D-loop in vitro assay with Rad51, Rad54 and a Rad54 mutant, and these studies combined with biochemistry suggest Rad54 is crucial to homology search and synaptic complex formation, prior to D-loop formation, in a tight intercooperation by Rad51 and Rad54. In a multiprotein system, I also showed the Rad51 paralogs Rad55-Rad57 stimulate the D-loop formation and that this heterodimer presents a ten times stronger ATPase activity than Rad51. I also developed other EM and high speed atomic force microscopy (HS-AFM) methodological tools to characterize other HR intermediates.

La synthèse de catalyseurs sans métaux nobles est une voie prometteuse pour rendre accessible à l’échelle mondiale les piles à combustible. L’analyse électrochimique de ces matériaux n’est pas aisée que ce soit pour comparer les propriétés électro catalytiques ou pour comprendre le fonctionnement de ces catalyseurs. Ceci provient du fait que la communauté scientifique évalue les performances catalytiques à l’échelle du matériau, donc sur un très grand nombre d’objets dont la réponse est moyennée. Les travaux présentés dans ce mémoire ont mis en place une méthode d’analyse de l’activité électrocatalytique de matériaux sans métaux nobles pour la réduction de l’oxygène en milieu acide par microscopie électrochimique à balayage. Cette approche permet d’étudier aussi bien macroscopiquement que microscopiquement les catalyseurs et d’étudier simultanément plusieurs catalyseurs, ce qui rend plus fiable la comparaison des résultats. Le dispositif présenté dans ce travail a permis de comparer différents catalyseurs avec des compositions proches ainsi que d’étudier l’influence de différentes paramètres sur un catalyseur : le chargement, la surface, la masse déposée et la quantité de Nafion ajoutée. Il a aussi été montré qu’il était possible d’étudier la stabilité des catalyseurs via ce dispositif. Ces différents résultats suggèrent que la méthode mise en place est polyvalente et permettra de nombreuses autres études. / The decrease of fuel cells cost is necessary to provide a worldwide access to the technology. Synthesis of noble metal-free catalysts is a promising way to achieve this goal. The electrochemical analysis of these materials is however not easy either to compare the electrocatalytic properties or to understand the performances of these catalysts. The scientific community generally studies catalysts at a macroscale, where the recorded response is averaged on a very large number of catalytic objects. The works presented here shows the setup of a method to analyze the electrocatalytic activity of noble metal-free catalyst for the oxygen reduction reaction in acidic media by scanning electrochemical microscopy. This method brings several advantages such as the possibility to study and compare multiple catalysts on the same sample at a macro- or a microscale. The comparison of several catalysts with this setup is then. A catalyst has been studied under various conditions of: loading, surface area, weight of catalyst and quantity of additives such as Nafion. The investigation of the material stability is also illustrated. These results suggest large range of application of the technique and many possibilities in the future are now open to investigated noble metal-free electrocatalytic materials.

La tomographie par cohérence optique plein champ (OCT plein champ) est une technique de microscopie interférométrique basée sur l’utilisation d’une source de lumière faiblement cohérente, telle qu’une lampe halogène. Elle permet de réaliser, de façon non invasive, des images tomographiques à plusieurs centaines de micromètres de profondeur dans les tissus biologiques et avec une résolution spatiale isotrope de l’ordre de 1 µm. Ces travaux de thèse concernent le développement de plusieurs systèmes d'OCT plein champ, dans le but de proposer de nouvelles performances et de nouveaux contrastes destinés à l’imagerie en trois dimensions de tissus biologiques. Nous avons dans un premier temps exploité la large bande spectrale d’émission d’une lampe halogène, afin d’apporter une information spectroscopique et d’être capable de distinguer et de caractériser des zones d’un échantillon qui seraient sinon indiscernables. Puis nous avons optimisé la résolution spatiale d’un montage d’OCT plein champ pour atteindre une valeur record de 0,5 µm (dans l’eau) dans les trois directions de l’espace, notamment grâce à l’utilisation d’une bande spectrale adaptée à l’imagerie de tissus, tels que la peau. Un montage dont le champ de vision est élargi à 18 mm x 18 mm a ensuite été développé et appliqué à l’imagerie du signal d’amplitude ainsi qu’à la mesure quantitative du signal de phase résolu en profondeur. Enfin un système utilisant un laser à balayage spectral comme source de lumière combiné à un traitement numérique de correction de la focalisation a été mis en œuvre. Nous avons ainsi démontré la possibilité de réaliser des images en trois dimensions avec une résolution latérale relativement élevée, sans utiliser le moindre déplacement mécanique durant l’acquisition. / Full-field optical coherence tomography (FF-OCT) is an optical technology based on low-coherence interference microscopy for tomographic imaging of semitransparent samples. Non-invasive three-dimensional imaging can be performed with an isotropic spatial resolution of the order of 1 µm. During the PhD thesis, several FF-OCT systems have been reported achieving extended performances or contrast enhanced images relevant for biological tissues imaging. Firstly, a three-band, 1.9-μm axial resolution FF-OCT system has been implemented to perform spectroscopic contrast enhanced imaging of biological tissues over a 530-1700 nm wavelength range. Then, a study of the FF-OCT axial response has been carried out for maximizing the axial resolution of the system. An isotropic spatial resolution of 0.5 µm (in water) has been obtained by combining 1.2-NA microscope objectives with an optimized broad spectral band adapted to biological tissues imaging, such as skin samples. A set-up with an extended field of view of 18 mm x 18 mm has been also designed and applied to amplitude signal detection as well as depth-resolved quantitative phase signal measurement. At last, we developed a technique based on the combination of full-field swept-source optical coherence tomography (FF-SSOCT) with low spatial coherence illumination and a special numerical processing that allows for numerically focused mechanical motion-free three-dimensional imaging.

La gonococcie est une infection sexuellement transmissible due au gonocoque. Elle est devenue un problème majeur de santé publique du fait de la multirésistance aux antibiotiques, mais surtout de la résistance au traitement de dernière intention actuellement en vigueur. Lactobacillus crispatus, une bactérie naturelle, commensale du vagin de la femme, s’est montré efficace pour inhiber le gonocoque. Les gels, une forme galénique bien acceptée, sont déjà utilisés pour le traitement des infections genitales de la femme. Disposer d’un gel contenant Lactobacillus crispatus, efficace, facile à administrer par la femme elle-même parait donc attractif pour la prévention de la gonococcie. Ainsi, nous avons conçu un gel à base d’un polymère thermogélifiant, le poloxamer 407 et d’un polymère biocompatible, l’alginate de sodium. Dans un premier temps, une étude physico-chimique du mélange de polymères a permis de retenir les concentrations optimisées. Dans un second temps, la souche de Lactobacillus choisie a été caractérisée et introduite dans le mélange de polymères. Les propriétés physicochimiques dont les caractéristiques rhéologiques, l’expulsion d’un dispositif d’administration, la stabilité, la microstructure ainsi que l’efficacité in vitro du gel obtenu ont été étudiés. Une répartition homogène de Lactobacillus crispatus a été observée dans le gel. Ce système est facilement administrable et possède des propriétés rhéologiques favorables à son étalement et son maintien dans la lumière vaginale. Ce gel a permis d’inhiber la croissance du gonocoque in vitro. / Gonorrhea is a sexually transmitted infection caused by Neisseria gonorrhoeae. It has become a major public health issue due to multidrug resistance, especially resistance to the current last-intention treatment.Lactobacillus crispatus, a natural bacterium, commensal to the woman's vagina, has been shown to inhibit Neisseria gonorrhoeae. Gels, a well-accepted dosage form, are already used for the treatment of woman's genital infections. Having a gel containing Lactobacillus crispatus, that is effective, easy to administer by the woman herself, would be ideal for the prevention of gonorrhea. Thus, we designed a gel based on a thermogelling polymer, poloxamer 407, and a biocompatible polymer, sodium alginate. First, a physicochemical study of the polymers mixtures allowed to select the optimized concentrations. Second, the selected Lactobacillus strain was characterized and introduced into the optimized polymer mixture. Physicochemical properties including rheological characteristics, expulsion from a device, stability, microstructure as well as in vitro gel efficacy were studied. A homogeneous distribution of Lactobacillus crispatus was observed in the gel. It was easily administered and its rheological properties were suitable for its spreading and its long reidence time in the vaginal lumen. This gel showed an inhibition of gonococcal growth in vitro.

Les dystrophies musculaires sont un groupe de pathologies génétiques qui cause une faiblesse et une perte progressive des muscles squelettiques. Parmi elles, la dystrophie des ceintures de type 2B (LGMD2B) est caractérisée par des mutations dans le gène de la dysferline, entrainant de sévères dysfonctionnements, dont un défaut de réparation membranaire. Les ruptures de la membrane plasmique sont des évènements physiologiques induits par des contraintes mécaniques, comme lors de la contraction des fibres musculaires. Les cellules eucaryotes possèdent donc une machinerie protéique assurant une réparation rapide de larges ruptures membranaires. La liste exhaustive des composants de la machinerie de réparation et leur mode d’action reste à établir.Les annexines (Anx) sont de petites protéines solubles, au nombre de 12 chez les mammifères, qui partagent la propriété de lier les membranes exposant des phospholipides chargés négativement en présence de Ca2+. De nombreuses études ont montré l’implication de certaines Anx (AnxA1, A2, A4, A5, A6 et A7) dans la réparation membranaire de différents types cellulaires (muscle, cancer, endothélium…) et dans différentes espèces (souris, poisson-zèbre, homme…). La présence des Anx dans le muscle squelettique, et la participation de plusieurs membres de cette famille dans la réparation membranaire, soulèvent la question d’un rôle collectif de ces protéines dans la protection et la réparation des ruptures du sarcolemme.Les objectifs de ce travail ont été 1) d’identifier les Anx impliquées dans la réparation membranaire des cellules musculaires squelettiques humaines, 2) développer une stratégie de microscopie corrélative pour étudier le site de rupture et la distribution subcellulaire des Anx à haute résolution, 3) élucider la fonction des Anx dans le mécanisme de réparation, et 4) analyser les Anx dans des cellules musculaires dystrophiques. Avec des approches en biologie cellulaire et moléculaire, et en microscopie de fluorescence et électronique, nous avons donc étudié le comportement des Anx lors d’un dommage du sarcolemme.Nous avons ainsi montré que les AnxA1, A2, A4, A5 et A6 sont exprimées dans les myoblastes et les myotubes humains, et sont recrutées au site de rupture quelques secondes après le dommage, en formant une structure dense à l’extérieur du myotube endommagé appelé domaine « cap ». De plus, nous avons pu déterminer l’ordre relatif de recrutement des Anx au site membranaire endommagé. Les premières Anx à être recrutées sont l’AnxA1, suivies des AnxA6 et A5, les moins sensibles au Ca2+. Les dernières Anx recrutées sont les plus sensibles au Ca2+, les AnxA4 puis A2, qui semblent se lier à des vésicules intracellulaires initialement éloignées du site de rupture. Nous avons également étudié l’ultrastructure du site de rupture à haute résolution. Nos résultats ont révélé que le domaine « cap » correspondait à une accumulation de matériel membranaire qui est associé au Anx. En s’appuyant sur nos résultats et la littérature, nous avons proposé un modèle de réparation membranaire, impliquant les AnxA1, A2, A4, A5 et A6, dans les cellules musculaires squelettiques humaines. Nous nous sommes également intéressés à l’expression des Anx dans des lignées de cellules musculaires dystrophiques issues de patients atteints de dystrophies musculaires des ceintures de type 2B (déficients en dysferline) et 1C (déficients en cavéoline-3). Nous avons ainsi montré que le contexte pathologique perturbait l’expression de certaines Anx, sans en modifier leur localisation subcellulaire.En conclusion, ce travail de thèse montre que plusieurs membres de la famille des Anx sont impliqués dans la réparation membranaire, et agissent de concert pour réparer un dommage de la membrane plasmique. L’implication des Anx dans d’autres pathologies, comme le cancer et la pré-éclampsie, renforce l’intérêt de leur étude dans les processus de réparation membranaire et en font une cible thérapeutique potentielle. / Muscular dystrophy encompasses a group of genetic disorders which cause progressive weakness and wasting of skeletal muscle. Among them, limb girdle muscular dystrophy type 2B (LGMD2B) is characterized by mutations in the dysferlin gene leading to several dysfunctions including a failure in cell membrane repair process. Cell membrane disruption is a physiological phenomenon induced by mechanical stress, such as contraction of muscle fibers. Thus, eukaryotic cells have a repair protein machinery ensuring a rapid resealing of large cell membrane ruptures. The exhaustive list of components of the repair machinery and their interplay remain to be established.The annexin (Anx) family consists of twelve soluble proteins in mammals and share the property of binding to membranes exposing negatively charged phospholipids in a Ca2+-dependent manner. Several studies have shown the involvement of Anx (AnxA1, A2, A4, A5, A6 and A7) in membrane repair of different cell types (muscle, cancer, endothelium…) in different species (mouse, zebrafish, human…). The presence of different Anx in skeletal muscle, together with the participation of several members of the Anx family in membrane repair processes, raise the question of a collective role of these proteins in the protection and repair of sarcolemma injuries.The PhD project aimed 1) at identifying Anx that are essential for membrane repair in human skeletal muscle cells, 2) developing a correlative light and electron microscopy to study the wounded site and the Anx distribution at high resolution, 3) elucidating the function of each Anx in this process and 4) analyzing Anx in dystrophic muscle cells. Using approaches including cellular and molecular biology, fluorescence microscopy and transmission electron microscopy, we studied the behavior of Anx during sarcolemma damage.We showed that AnxA1, A2, A4, A5 and A6 are expressed in human myoblasts and myotubes, and are recruited at the disruption site within seconds after the sarcolemmal damage, forming a dense structure outside the cell, named the “cap” domain. Furthermore, we determined the relative order of Anx recruitment at the disruption site. The first Anx recruited are AnxA1, followed by AnxA6 and A5, the less sensitive to Ca2+. The last Anx recruited are the most sensitive to Ca2+, AnxA4 and A2. AnxA2 and A4 are instead rapidly recruited to intracellular vesicles present deeper in the cytosol. We also studied the ultrastructure of the disruption site at high resolution. Our results revealed that the “cap” domain correspond to a disorganized membrane structure, associated with the Anx. Thanks to our results and the literature, we have proposed a model for membrane repair involving Anx in human skeletal muscle cells. We also looked at the expression of Anx in dystrophic muscle cell lines from patients with limb girdle muscular dystrophy type 2B (dysferline deficient) and 1C (deficient in cadaveoline-3). We have thus shown that the pathological context disrupts the expression of some Anx, without altering their subcellular location.In conclusion, this work shows that several members of the Anx family are involved in membrane repair and act together to repair plasma membrane damage. The implication of Anx in other pathologies, such as preeclampsia or cancer, reinforces the interest of their study in the process of membrane repair.