Le noyau est un organite caractéristique des cellules eucaryotes et les propriétés mécaniques de ce dernier jouent un rôle essentiel dans le comportement de la cellule, notamment sa motilité, sa polarité et sa survie. Le noyau est entouré par une enveloppe comprenant une membrane interne et une membrane externe, ainsi que de nombreuses protéines. Mes objectifs de thèse étaient de comprendre des mécanismes moléculaires déficients dans deux types de maladies génétiques causées par des mutations dans les lamines: la dystrophie musculaire d’Emery-Dreifuss et les syndromes de type progéroïde.Dans un premier temps, nous avons montré que l’émerine s’auto-associe in vitro et en cellules (Herrada et al. ACS Chem. Biol. 2015). J’ai ensuite étudié la structure des oligomères d’émerine, déterminé le fragment protéique minimal nécessaire à la formation de ces oligomères et décrit l’impact de mutations de l’émerine, causant une dystrophie musculaire d’Emery-Dreifuss, sur son auto-assemblage (Samson et al. Biomol NMR Assign. 2016 ; Samson et al. FEBS J. 2016). Puis, j’ai montré que seule cette forme auto-assemblée de l’émerine est capable d’interagir avec la lamine A et que la phosphorylation de l’émerine par la kinase Src, observée suite à un stress mécanique, régule cette interaction entre l’enveloppe nucléaire et le nucléosquelette.Pour finir, j’ai montré que la forme monomérique de l’émerine est capable de former un complexe ternaire avec BAF et la lamine A. Après avoir mesuré les affinités protéine-protéine au sein de ce complexe, identifié les fragments minimaux des différentes protéines permettant de former ce complexe et mis au point un protocole robuste de purification de ce complexe, j’ai pu obtenir des cristaux de ce complexe dans plusieurs conditions. Par la suite, nous avons pu résoudre la structure de ce complexe par remplacement moléculaire avec une résolution de 2 Å. Enfin, j'ai montré que les mutations dans les lamines de type A provoquant des syndromes de type progéroïde pouvaient altérer l'interaction avec BAF in vitro, et nos collaborateurs, l'équipe du Dr B. Buendia (Paris Diderot), ont montré que ces mêmes mutations induisaient une diminution significative de la proximité entre la lamine A et BAF dans les cellules HeLa. Un article, où je suis premier auteur, vient d’être soumis au journal NSMB. / The nucleus is an organelle characteristic of eukaryotic cells and its mechanical properties play an essential role in the behavior of the cell, in particular its motility, polarity and survival. It is surrounded by an envelope comprising an inner membrane and an outer membrane, as well as a large number of proteins. These proteins are either anchored at the nuclear membrane, as emerin, or form a filament meshwork lining the inner nuclear membrane, as lamins. My thesis objectives were to understand molecular mechanisms deficient in two types of genetic diseases caused by mutations in inner nuclear envelope proteins: Emery-Dreifuss muscular dystrophy, associated to mutations in emerin and A-type lamins, and progeroid syndromes caused by mutations in A-type lamins.First, we showed that the emerin protein self-assembles in vitro and in cells (Herrada, Samson et al., ACS Chem. Biol., 2015). I then studied the structure of emerin oligomers, determined the minimal protein fragment necessary for the formation of these oligomers, identify residues forming the structural core of these oligomers by solid-state NMR in collaboration with the group of Prof A. Lange (FMP Berlin), and described the impact of emerin mutations causing Emery-Dreifuss muscular dystrophy on emerin self-assembly (Samson et al., Biomol. NMR Assign. 2016, Samson et al., FEBS J. 2017). Then, I observed, mainly using solution-state NMR, that only the self-assembled form of emerin is able to interact with A-type lamin tail, and that mutants causing Emery-Dreifuss muscular dystrophy and unable to self-assemble are also defective in A-type lamin binding. I also obtained preliminary data showing that phosphorylation of emerin by the Src kinase, observed after a mechanical stress in purified nuclei, regulates the interaction between self-assembled emerin and A-type lamins.Finally, I showed that the monomeric form of emerin is able to form a ternary complex with A-type lamin tail through the chromatin-associated protein Barrier-to-Autointegration Factor (BAF). After having measured the protein-protein affinities within this complex, identified the minimal protein fragments involved in the complex and developed a robust protocol for purification of this complex, I was able to obtain crystals under several conditions. Subsequently, I solved the 3D structure of this complex by molecular replacement at a resolution of 2 Å. Finally, I showed that mutations in A-type lamins causing autosomal recessive progeroid syndromes impair interaction with BAF in vitro, and our collaborators at Univ. Paris Diderot, the team of Dr B. Buendia, showed that these same mutations induce a significant decrease in the proximity between lamin A and BAF in HeLa cells. An article with me as a first author is in preparation that reports all these new data.

Les propriétés des nanotubes de carbone monoparois (SWCNTs) dépendent fortement de leur structure atomique. La croissance sélective en structure des SWCNTs est donc un objectif clé à atteindre pour les applications potentielles de ces matériaux uniques. Dans le travail présenté dans ce manuscrit, nous proposons une nouvelle méthode originale alliant chimie de coordination et chimie des surfaces, pour la croissance de SWCNTs par décomposition chimique en phase vapeur, à partir de pré­ curseurs de catalyseurs variés synthétisés par voie chimique.L 'étude approfondie de ce procédé est présenté pour trois systèmes métalliques de précurseurs (Fe, NiFe, NiCr), issus de la famille du bleu de Prusse. Une caractérisation détaillée des précurseurs, catalyseurs, et des SWCNTs synthétisés a permis de mettre en évidence des effets de la composition du catalyseur sur les phénomènes de croissance.Une étude comparative de microscopie électronique en transmission et de spectroscopie Raman pour la détermination de la distribution de diamètre des échantillons de SWCNTs obtenus a été effectuée, mettant en lumière l 'importance primordiale du recours à des caractérisations croisées pour l 'évaluation de la sélectivité des croissances.Enfin, d'autres pistes de précurseurs de catalyseurs synthétisés par voie chimique sont explorées. Des résultats préliminaires sur deux systèmes bimétalliques de précurseurs issus de la famille des « cyanosols » (FePd) , et de celle des polyoxometallates (CoW) sont présentés, soulignant leur intérêt pour la compréhension des mécanismes complexes de croissance des SWCNTs. / The work presented in this manuscript is focused on the study of single-walled carbon nanotube (S WCNT) growth by chemical vapor deposition, through the tuning of catalyst nanoparticle composition. The properties of S WCNTs strongly depend on their atomic structure, making structurally selective growth essential for future applications. Here we present a new and original method combining surface chemistry and coordination chemistry, for S CNT growth using a wide range of mono- and bimetallic catalyst systems, formed by the reduction of chemically synthesized catalyst precursors.A thorough study of this process is presented for three metallic precursor systems (Fe, NiFe, NiC), derived from the Prussian blue compound family. An extensive characterization of the precursors, ca­ -talysts, and the resulting S CNTs has allowed to evidence effects of catalyst composition on growth phenomena.We also show the importance of cross-characterization of SWCNT growth samples, through a comparative study between TEM, and Raman spectroscopy for diameter distribution assessment of our growth samples, and on diameter-sorted SWCNT samples.Preliminary results on the use of cyanosols and polyoxomet alates for SWCNT growth with additional bimetallic catalyst systems (FePd , and CoW) are also presented , highlighting the rich potential of inorganic chemistry and coordination chemistry in the field of SWCNT growth .

Le caoutchouc naturel (NR pour Natural Rubber) est une matière première indispensable à la fabrication de milliers de produits !Le choix du latex naturel tient principalement à ses propriétés physico-chimiques intrinsèques bien supérieures à celles des latex synthétiques. Industriellement, le NR est cependant rarement utilisé seul mais associé à des particules de renfort, appelées charges, pour former un matériau composite aux propriétés mécaniques grandement améliorées en particulier la résistance à l’usure.Des études récentes ont mis en évidence que la méthode conventionnelle consistant à introduire les charges sous forme de poudres fines au sein d’un bloc de NR solide ou fondu n’est pas la plus efficace. Une nouvelle approche consistant à mélanger les deux entités, NR et charges, en phase liquide avant séchage s’annonce prometteuse industriellement, mais la littérature à ce sujet est encore très limitée. Ce travail de thèse a visé à parfaire la compréhension des processus gouvernant les interactions NR-charges renforçantes en phase liquide. Pour ce faire nous avons (i) décrit les propriétés physico-chimiques de surface des particules NR en phase liquide, (ii) étudier les effets de la charge renforçante (en termes de taille, composition, fonctionnalisation de surface, concentration) et de la solution (ions valence) sur l'interaction NR-charge et (iii) quantifier les propriétés mécaniques des particules NR.Nous avons été en mesure d’identifier les paramètres clés qui permettent en phase aqueuse diluée, non seulement d’influencer l’interaction particule de NR-charge mais aussi de réguler la dynamique d'interaction et de contrôler la structure des hétéro-agrégats formés.Cette approche originale de l’hétérocoagulation NR-charge en phase liquide ouvre de nombreuses perspectives en vue d’améliorer les propriétés des matériaux composites NR-particules de renfort. / Natural rubber (NR) is an indispensable raw material used in the manufacturing of more than 40,000 products primarily due to its excellent intrinsic physical properties. However, NR is seldom used in its raw state. Often, it needs to be reinforced with particulate fillers (nanoparticles) to further improve its physical strength required for most applications. The precise origin of this mechanical reinforcement effect remains unclear, however, optimal reinforcements appears to depend on the dispersion of filler in the NR matrix and the interaction of NR and filler.It was found that the conventional method of pouring fine powders in a solid block of rubber/melt is not the most efficient way to disperse the fillers. The new alternative approach in which the two components are first dispersed in liquid has shown promising results but available literature is still very limited. Furthermore, the microscopic mechanism involved in the interaction of NR and filler in liquid is still unknown. In this context, we (i) described the physico-chemical surface properties of NR particles in liquid, (ii) identified key filler (size, composition, surface activity, concentration) and solution (ion valence) related parameters to comprehend the structural, morphological, and dynamical evolution of the NR-filler interaction, and (iii) quantified the mechanical properties of the NR particles. With this approach we were able to provide the first reports on the physical processes involved in the interaction of NR and filler. More importantly, a recipe for the basic yet crucial parameters that controls and modulates NR-filler heteroaggregation was established. This could open the way to further understand the reinforcement effect.

Neisseria meningitidis, ou méningocoque, est une bactérie responsable de méningites et de septicémies, dont la forme la plus grave, purpura fulminans, est souvent fatale. Cette bactérie, qui réside naturellement dans le rhinopharynx de l’Homme, est pathogène lorsqu’elle atteint la circulation sanguine et entre en contact avec les cellules endothéliales. L’établissement d’une interaction étroite entre le méningocoque et les cellules endothéliales est essentiel à la résistance des bactéries au flux sanguin et à la colonisation vasculaire. Cette interaction peut conduire à une désorganisation massive des endothéliums périphériques et cérébraux permettant la dissémination de la bactérie. Ces processus dépendent de la primo-interaction des pili de type IV du méningocoque avec le récepteur endothélial CD147 et de l’activation du récepteur β2-adrénergique (β2AR). L’activation de voies de signalisation en aval du β2AR dans les cellules hôtes permet l’adhérence efficace et intime des bactéries à la surface des cellules endothéliales. Toutefois, comment les récepteurs CD147 et β2AR coopèrent pour promouvoir une interaction initiale efficace et rapide n’était pas connu. Au cours de ma thèse, j’ai donc analysé les éventuelles interactions et liens fonctionnels existants entre les récepteurs CD147 et β2AR et suivi, à l’aide de nouvelles approches d’imagerie à haute résolution, leur organisation moléculaire aux sites de contact bactéries/cellule. Mes travaux ont permis de révéler l’existence d’une interaction fonctionnelle entre les récepteurs CD147 et β2AR, et d’identifier un nouveau partenaire cytosolique interagissant directement avec ces récepteurs, l’α-actinine4 (Actn4). L’expression de l’Actn4 est requise pour l’assemblage organisé de ces récepteurs en complexes multimoléculaires aux sites de contact bactéries/cellule endothéliale. Cette organisation est déterminante pour générer une force suffisante à l’interaction initiale du méningocoque aux cellules endothéliales, et promouvoir l’activation rapide des voies de signalisation nécessaires à la consolidation de cette interaction. L’infection des cellules endothéliales par le méningocoque s’accompagne de la désorganisation des jonctions intercellulaires et l’ouverture d’une voie paracellulaire favorisant la dissémination tissulaire des bactéries. Ces évènements dépendent de l’activation de la petite GTPase Cdc42 et, en aval, de la relocalisation du complexe de polarité Par3/Par6/aPKC au site d’adhérence bactérien. Ce complexe moléculaire très conservé est impliqué dans la mise en place de la polarité baso-apicale des cellules endothéliales. La perte de la polarité cellulaire constituant un élément déterminant de la perte de l’intégrité vasculaire, dans une seconde partie de ma thèse, j’ai donc entrepris une analyse des événements de signalisation précoces conduisant au remodelage de l’organisation apico-basale des cellules endothéliales par N. meningitidis. Mes travaux montrent que rapidement après adhésion aux cellules endothéliales, le méningocoque induit la ré-orientation de l’axe de polarité noyau-centrosome des cellules en direction des bactéries et mettant en jeu un mécanisme original indépendant de l’activation de Cdc42 par le β2AR. Le recrutement des ERM (Ezrine et Moesin) et la polymérisation d’actine corticale au site d’infection semblent constituer des facteurs clé de cette étape précoce de modification de la polarité endothéliale induite par le méningocoque. Ainsi, ces études ont permis une avancée majeure dans notre compréhension du mécanisme d’adhésion du méningocoque aux cellules endothéliales et des événements moléculaires précoces conduisant à l’altération de l’intégrité vasculaire, deux étapes clés au cœur de la pathogénèse des infections invasives à méningocoque. / Neisseria meningitidis or meningococcus is a commensal bacterium of the human nasopharynx responsible for septicemia and meningitis. Establishment of a close interaction between meningococcus and endothelial cells is an important step in meningococcal pathogenesis as it promotes bacterial resistance to blood flow and vascular colonization, leading to major endothelial dysfunctions and bacterial dissemination into perivascular tissues. This process depends on the interaction of meningococcal type IV pili with the endothelial receptor CD147 and the activation of the β2 adrenergic receptor (β2AR). Activation of a cellular response downstream of β2AR activation is important to allow the efficient adhesion of meningococci at the endothelial cell surface. However, how CD147 and the β2AR cooperate to promote a rapid and efficient initial adhesion remained to be explored. During my thesis, I have analyzed the interaction and the functional link between these two receptors and, using super resolution microscopy, I have investigated their molecular organization at sites of bacterial adhesion. My work revealed a functional interaction in cis between CD147 and the β2AR and binding of these receptors complexes to the molecular scaffold protein α-actinin 4 (Actn4). Actn4 expression is required for the organized assembly of these receptors in highly-ordered complexes at bacterial adhesion sites. This specific organization is decisive to provide a sufficient binding strength of meningococcal type IV pili with endothelial receptors and to promote a rapid activation of downstream signaling events in a short time frame. Endothelial cell infection by N. meningitidis is associated with the disruption of intercellular junctions and the opening of a paracellular route favoring bacterial dissemination into tissues. These events are dependent on Cdc42 activation and on the relocalization of the Par3/Par6/aPKC polarity complex at bacterial adhesion sites. This molecular complex is conserved and involved in baso-apical polarity establishment in endothelial cells. Since endothelial polarity is essential in maintaining junction integrity, in a second part of my thesis work I have analyzed the early signaling events triggered by meningococcal infection with a particular emphasis on endothelial cell polarity modifications. I observed that bacterial adhesion rapidly induced a re-orientation of the nucleus-centrosome axis toward bacterial adhesion sites. Unexpectedly, this re-orientation was independent of Cdc42 activation downstream of the β2AR. In place, the ERM proteins (Ezrin and Moesin), along with cortical actin polymerization seem to be key factors in this process. This work contributes to the understanding of the meningococcal adhesion mechanism to endothelial cells and the early molecular events leading to the loss of vascular integrity. These two key steps are very important in the meningococcal pathogenesis.

L’originalité du sujet de thèse, initié lors du stage de M2R consiste à mesurer les propriétés de mobilité des molécules d’adhérence de cellules mécaniquement contrôlées. Le contrôle des propriétés géométriques et mécaniques du substrat seront fixées grace a l'utilisation d'une lamelle de verre comprenant des motifs de matrice extracellulaire. Nous utiliserons plusieurs techniques de mesures de mobilités, permettant d'accèder à des échelles temporelles d'étude différentes ; La FCS permettant d'accèder au dynamique rapide ; Le FRAP pour accèder au dynamique lente. / The originality of the project, initiated during the M2 internship, consist to measure the mobility of adhesive molecules of cells mechanically controlled.This control will be fixed thanks to a coverslip with adhesive protein pattern. We will next use different technics of mobility measurement to have information about different time scale : FCS for fast dynamics, FRAP for slow dynamics.

Le développement de dispositifs optiques intégrés dans des domaines tels que l'information quantique et la détection de molécules est actuellement dirigé vers l'intégration de nanosources (NS) sur des systèmes sur puce avec faible pertes de propagation. Cette thèse montre une contribution à la conception, à la fabrication et à la caractérisation de structures photonique-plasmoniques en vue de l'intégration d'une seule NS sur des puces optiques à travers le spectre visible. Nous recherchons à optimiser l’efficacité d’excitation et de collection de l'émission de la fluorescence d'une NS en combinant un nano-prisme en or et une structure formée par une couche de dioxyde de titane (TiO2) et un guide d'ondes à échange d'ions (IEW) sur verre. Le couplage entre les modes permet un transfert efficace de l'énergie entre un mode faiblement confiné dans l'IEW vers un mode plasmonique confiné dans un volume effectif de quelques nanomètres cubes. Ce mode confiné interagit avec une NS en améliorant son émission de fluorescence par l'effet de facteur Purcell. En utilisant le théorème de réciprocité de l'électromagnétisme, nous avons étudié le cas réciproque où la lumière émise par la NS peut être collectée dans les modes photoniques du IEW.La caractérisation a été réalisée en champ lointain et en champ proche avec en particulier l'utilisation d'un microscope optique de champ proche à sonde diffusante (SNOM). Nous avons proposé une configuration SNOM qui permet d'imiter l'interaction d'une NS et des systèmes guidés, cartographiant la densité locale des modes guidés (LDOM) / The development of integrated optical devices in areas such as quantum information and molecular sensing is currently directed towards the integration of nanosources (NS) into systems on a chip with low propagation losses. This thesis shows a contribution on the design, fabrication, and characterization of photonic-plasmonic structures towards the integration of a NS on optical chips across the visible spectrum. We pursue the efficient excitation and collection of the fluorescence emission of a NS by making use of the interaction between an electromagnetic field concentrator (gold nanoprism) and an integrated optics structure formed by a high-index layer of titanium dioxide (TiO2) and a low-contrast index ion exchanged waveguide on glass (IEW). The coupling mode allows an efficient transfer of the energy between a weakly confined mode in the IEW and a plasmonic mode confined in an effective volume of few cubic nanometers. This confined mode interacts with a NS enhancing its florescence emission through Purcell factor effect. Using the reciprocity theorem of electromagnetism, we studied the reciprocal case where the light emitted by the NS can be collected into the photonic modes of the IEW.The characterization was performed in the far and in the near field with the use of a scanning near-field optical microscopy (SNOM). We proposed a SNOM configuration that allows us to imitate the interaction of a NS and guided systems, mapping the local density of guided modes (LDOM)

Le travail de cette thèse a été consacré au développement d’un nouvelle technique SELFI (pour self-interferences, auto-interférences en anglais). Cette méthode permet d’obtenir une localisation tridimensionnelle d’émetteurs fluorescents individuels. Nous avons démontré que cela permet l'imagerie super-résolue en 3D et le suivie 3D de molécules uniques en profondeur dans des échantillons biologiques denses et complexes. La technique SELFI se base sur l'utilisation des interférences auto-référencées (également appelées « auto-interférences ») pour remonter à la localisation 3D d’un émetteur en une seule mesure. Ces interférences sont générées via l’utilisation d'un réseau de diffraction placé en sortie du microscope de fluorescence : le signal de fluorescence diffracte sur le réseau et les ordres interfèrent, après une courte propagation, sur le détecteur. Les interférences ainsi formées sont décodées numériquement pour remonter à la localisation 3D d'une molécule fluorescente au sein de l'échantillon. Une molécule unique peut ainsi être localisée avec une précision d'une dizaine de nanomètre, et cela jusqu'à une profondeur d'au moins 50µm au sein d'un échantillon biologique vivant épais (par exemple un tissu biologique).En combinant la méthode SELFI à différentes techniques de super-résolution (PALM, dSTORM et uPAINT), nous montrons que cette méthode de localisation tridimensionnelle permet de retrouver la hiérarchie et l'organisation de protéines dans des objets biologiques. En effectuant du SELFI-PALM, nous avons pu observer différentes protéines des points focaux d’adhésion (talin-C terminale et paxiline) et retrouver les différences de hauteur attendues, et ceux sur des échantillons de cellules vivantes. Ces résultats confirment la résolution accessible avec la technique SELFI (environ 25nm) même pour un faible nombre de photons collectés (environ 500 photons par molécule).Nous mettons en évidence la robustesse de la technique SELFI en reconstruisant des images de super-résolution 3D de structures denses en profondeur dans des échantillons tissulaires complexes. En effectuant du SELFI-dSTORM, nous avons observé le réseau d’actine sur des cellules cultivées en surface de la lamelle dans un premier temps, et à différentes profondeurs (25 et 50 microns) au sein de tissus artificiels dans un second temps.Du suivi 3D de particule unique a aussi été effectué sein de tissus biologiques vivants. Nous avons observé la diffusion libre de quantum dots à différentes profondeurs (jusqu’à 50 microns, limité par l’objectif utilisé) dans des tranches vivantes de cerveau.Nous avons appliqué la technique SELFI à la détection de récepteurs postsynaptiques NMDA. Cela nous a permis d'observer, sur des échantillons de neurones en culture primaire mais aussi au sein de tranches de cerveaux de rats, une différence d'organisation entre les deux sous-unités GluN2A et GluN2B de ce récepteur au glutamate.Enfin, nous avons démontré l'importance de suivre l'évolution de l'environnement des échantillons biologiques vivants lors des acquisitions permettant la détection de molécules individuelles. Grâce à l'utilisation additionnelle et simultanée de l'imagerie de phase quantitative, nous avons pu étudier la dynamique de la membrane cellulaire durant l’activation par un facteur de croissance. L'analyse corrélative entre les images de phase quantitative en lumière blanche et les détections de molécules fluorescentes uniques permet d'obtenir de nouvelles informations pertinentes sur l'échantillon étudié. / The work of this thesis was devoted to the development of a new technique SELFI (for self-interferences). This method unlocks the three-dimensional localization of individual fluorescent emitters. We have demonstrated that this allows 3D super-resolved imaging and 3D tracking of single molecules deep into dense and complex biological samples. The SELFI technique is based on the use of self-referenced interference to go back to the 3D location of a emitter in a single measurement. These interferences are generated using a diffraction grating placed at the exit of the fluorescence microscope: the fluorescence signal diffracts on the grating and, after a short propagation, the orders interfere on the detector. The formed interferences are digitally decoded to extract the 3D location of a fluorescent molecule within the sample. A single molecule can thus be localized with a precision of approximatively ten nanometers up to a depth of at least 50 µm in a thick living biological sample (for example a biological tissue).By combining the SELFI method with different super-resolution techniques (PALM, dSTORM and uPAINT), we show that this three-dimensional localization method grants the access to the hierarchy and organization of proteins in biological objects. By performing SELFI-PALM, we observed different proteins of the adhesion focal points (talin C-terminal and paxilin) and found the expected elevation differences, and those within living cell samples. These results confirm the resolution capability of the SELFI technique (about 25 nm) even for a small number of photons collected (about 500photons per molecule).We highlight the robustness of the SELFI technique by reconstructing 3D super-resolution images of dense structures at depth in complex tissue samples. By performing SELFI-dSTORM, we observed the actin network in cells grown on the surface of the coverslip at first, and at different depths (25 and 50 microns) within artificial tissues in a second time.3D single particle tracking has also been performed in living biological tissues. We observed the free diffusion of quantum dots at different depths (up to 50 microns) in living brain slices.We applied the SELFI technique to the detection of NMDA postsynaptic receptors. We observed, in primary culture of neurons but also within slices of rat brains, a difference in organization between the two subunits GluN2A and GluN2B of this glutamate receptor.Finally, we show the importance of following the evolution of the living biological sample environment during the acquisition of images leading to detections of single molecules. Thanks to the additional and simultaneous use of quantitative phase imaging, we were able to study cell membrane dynamics during the activation by a growth factor. The correlative analysis between white light quantitative phase images and single fluorescent molecule detections provides new relevant information on the sample under study.

La polarisation des cellules est essentielle à la division cellulaire asymétrique, la migration cellulaire, la fonction neuronale et le développement embryonnaire. Elle peut se faire par le mécanisme de localisation des ARNm dans des compartiments cellulaires spécifiques. Bien que le mécanisme de localisation des ARNm soit assez bien défini dans tous les types cellulaires, son implication dans le développement du cancer n'a pas été caractérisée. Une étude de séquençage direct de l'ARN, réalisée sur des cellules métastatiques (HCCLM3) du carcinome hépatocellulaire (CHC) a déterminé qu'au niveau de leurs protrusions, certains ARNm y sont enrichis, alors qu'aux protrusions des cellules CHC non-métastatiques SMMC7721, ces ARNm n’y sont pas enrichis. L'ARNm qui encode pour le facteur de transcription STAT3 figure parmi ceux identifiés comme étant enrichis. La technique du smiFISH a été utilisée pour valider l'enrichissement de l'ARNm STAT3 au niveau des protrusions des cellules CHC associées à un phénotype métastatique. Les résultats obtenus démontrent que l'essai de déplétion de sérum permet d'induire la migration des cellules SMMC7721, HCCLM3 et MHCC97H, qui forment des protrusions de type lamellipode. En parallèle, l'expression de l'α-actinine-GFP a permis de visualiser les régions protrusives et de les délimiter. Les expériences de smiFISH et les mesures d'expression relative par RT-qPCR ont révélé que les cellules métastatiques HCCLM3 et MHCC97H expriment peu d'ARNm STAT3, comparativement aux cellules non-métastatiques SMMC7721. De plus, les quantifications absolues de l'enrichissement démontrent que dans toutes les lignées CHC, les molécules d'ARNm STAT3 uniques localisent majoritairement au niveau des corps cellulaires, et très peu dans les protrusions. Le ratio du nombre de molécules d'ARNm STAT3 uniques localisées dans les protrusions sur le nombre de molécules uniques localisées dans les corps cellulaires est nettement plus petit pour les cellules HCCLM3 et MHCC97H que pour les cellules SMMC7721. La densité de l'ARNm STAT3 / unité de surface dans les protrusions des cellules HCCLM3 et MHCC97H est inférieure à celle des cellules SMMC7721. Ensemble, ces résultats confirment qu'il n'y a pas d'enrichissement de l'ARNm STAT3 aux protrusions des cellules CHC associées à un phénotype métastatique. / Subcellular mRNA localization regulates cell polarization. Asymmetric distribution of transcripts is important in cell division, cell migration, neuronal function and embryonic development. In all cell types, the mechanisms of mRNA localization are well defined, but their involvement in cancer development is still unknown. A recent study has identified protrusion-localized STAT3 mRNA in metastatic hepatocarcinoma cells (HCCLM3). In comparison, the STAT3 mRNA was not found to be enriched in the non-metastatic cells (SMMC7721) protrusions. The enrichment of the STAT3 mRNA at the protrusions of HCC cells associated with a metastatic phenotype was studied by smiFISH. Our results showed that the serum starvation assay induced lamellipodia-based migration in SMMC7721, HCCLM3 and MHCC97H cells. Also, expression of GFP-α-actinin allowed to mark the protrusive regions of migrating HCC cells. The smiFISH results and RT-qPCR quantification revealed that the metastatic cells (HCCLM3 and MHCC97H) express lower levels of STAT3 mRNA compared to the non-metastatic cells (SMMC7721). Absolute quantification of localization and enrichment revealed that STAT3 mRNA mainly localizes in the cell bodies of all HCC cell lines. The ratio of the number of single molecules of STAT3 mRNA localized in the protrusions on the number of single molecules localized in the cell bodies is smaller for the metastatic cells than the non-metastatic cells. In the metastatic cells protrusions, the density of STAT3 mRNA / unit of surface was found the be lower than the non-metastatic cells. Altogether, these results confirm that there is no enrichment of STAT3 mRNA at the protrusions of metastatic HCC cells.

La compréhension des mécanismes impliqués dans les cas sains, les maladies neurodégénératives ainsi que le développement de nouvelles approches thérapeutiques repose sur l’utilisation de modèles expérimentaux pertinents et de techniques d’imagerie adaptées. Dans ce contexte, la microscopie virtuelle offre la possibilité unique d’analyser ces modèles à l’échelle cellulaire avec une très grande variété de marquages histologiques. Mon projet de thèse consiste à mettre en place et à appliquer une méthode d’analyse d’images histologiques en couleur permettant de segmenter et de synthétiser l’information relative aux neurones à l’aide de l’anticorps NeuN sur des coupes de cerveau de macaque. Dans ce travail, nous appliquons d’abord la méthode de Random Forest (RF) pour segmenter les neurones ainsi que le tissu et le fond. Ensuite, nous proposons une méthode originale pour séparer les neurones qui sont accolés afin de les individualiser. Cette méthode s’adapte à l’ensemble des neurones présentant une taille variable (diamètre variant entre 5 et 30 μm). Elle est également efficace non seulement pour des régions dites « simples » caractérisées par une faible densité de neurones mais aussi pour des régions dites « complexes » caractérisées par une très forte densité de plusieurs milliers de neurones. Le travail suivant se concentre sur la création de cartes paramétriques synthétisant la morphologie et la distribution des neurones individualisés. Pour cela, un changement d’échelle est mis en œuvre afin de produire des cartographies présentant des résolutions spatiales plus faibles (résolution originale de 0,22 μm et cartographies créées proposant une résolution spatiale adaptative de quelques dizaines à quelques centaines de micromètres). Plusieurs dizaines de paramètres morphologiques (rayon moyen, surface, orientation, etc.) sont d’abord calculés pour chaque neurone ainsi que des paramètres colorimétriques. Ensuite, il est possible de synthétiser ces informations sous la forme de cartes paramétriques à plus basse résolution à l’échelle de régions anatomiques, de coupes voire, à terme, de cerveaux entiers. Cette étape transforme des images microscopiques qualitatives couleur en images mésoscopiques quantitatives, plus informatives et plus simples à analyser. Ce travail permet d’analyser statistiquement de très grands volumes de données, de synthétiser l’information sous la forme de cartographies quantitatives, d’analyser des problèmes extrêmement complexes tels que la mort neuronale et à terme de tester de nouveaux médicaments voire de confronter ces informations acquises post mortem avec des données acquises in vivo. / Understanding the mechanisms involved in healthy cases, neurodegenerative diseases and the development of new therapeutic approaches is based on the use of relevant experimental models and appropriate imaging techniques. In this context, virtual microscopy offers the unique possibility of analyzing these models at a cellular scale with a very wide variety of histological markers. My thesis project consists in carrying out and applying a method of analyzing colored histological images that can segment and synthesize information corresponding to neurons using the NeuN antibody on sections of the macaque brain. In this work, we first apply the Random Forest (RF) method to segment neurons as well as tissue and background. Then, we propose an original method to separate the touching or overlapping neurons in order to individualize them. This method is adapted to process neurons presenting a variable size (diameter varying between 5 and 30 μm). It is also effective not only for so-called "simple" regions characterized by a low density of neurons but also for so-called "complex" regions characterized by a very high density of several thousands of neurons. The next work focuses on the creation of parametric maps synthesizing the morphology and distribution of individualized neurons. For this purpose, a multiscale approach is implemented in order to produce maps with lower spatial resolutions (0.22 μm original resolution and created maps offering adaptive spatial resolution from a few dozens to a few hundred of micrometers). Several dozens of morphological parameters (mean radius, surface, orientation, etc.) are first computed as well as colorimetric parameters. Then, it is possible to synthesize this information in the form of lower-resolution parametric maps at the level of anatomical regions, sections and even, eventually, the entire brains. This step transforms qualitative color microscopic images to quantitative mesoscopic images, more informative and easier to analyze. This work makes it possible to statistically analyze very large volumes of data, to synthesize information in the form of quantitative maps, to analyze extremely complex problems such as neuronal death, to test new drugs and to compare this acquired information post mortem with data acquired in vivo.

Les études épidémiologiques sur les effets de la fraction ultrafine de la pollution particulaire et les études sur la toxicité in vitro et in vivo des nanoparticules manufacturées témoignent d’un danger potentiel pour l’homme en raison de nouvelles propriétés physico-chimiques de la matière à l’échelle nanométrique. L’évaluation du risque lié à des expositions professionnelles ou environnementales ou le diagnostic d’un lien causal entre ces expositions et d’éventuelles pathologies peuvent être limités par l’absence de méthode de référence pour caractériser et quantifier les particules nanométriques dans les tissus et fluides biologiques. Ce travail a permis de mettre au point une méthode remplissant ces objectifs, basée sur la préparation des échantillons par digestion alcaline et microfiltration et sur l’analyse en microscopie électronique analytique. L’application de cette méthode dans deux études a permis de confirmer qu’une translocation des particules nanométriques était possible d’une part au niveau pleural avec concentration dans les black spots et d’autre part à travers le placenta avec une possible exposition du foetus. Ce travail a également permis de caractériser des sources d’expositions professionnelles ou environnementales aux particules nanométriques. Sous réserve d’optimiser le coût et le temps nécessaire pour ce type d’analyse, cette méthode pourrait permettre de définir des valeurs de référence sur des échantillons plus larges et représentatifs de la population générale ou être utilisée dans le cadre de la surveillance de travailleurs exposés. / Epidemiologic studies on the health effects of ultrafine particles from atmospheric pollution and in vitro or in vivo studies on manufactured nanoparticles toxicity suggest that potential hazards may result from new physico-chemical properties of materials at nanometric scale. To assess human health risk after occupational or environmental exposure or to demonstrate a causal relationship between such exposures and diseases may be hindered by the lack of reference method to characterize and quantify nanometric particles in biological tissues and fluids. This work allowed us to develop such a method based on samples preparation by alkaline digestion and microfiltration followed by analytical electron microscopy analysis. This method applied in two studies allowed us to confirm that pleural translocation of nanometric particles and accumulation in black spots were possible in human and that they also may pass through the placental barrier with potential fetal exposure. This work also allowed us to characterize some sources of occupational and environmental exposures. After time-cost optimization of this method, it could be used to define reference values on larger population-representative samples or used for the medical follow-up of exposed workers.