La peau joue le rôle de barrière, participe à l'homéostasie générale de l'organisme et à la régulation de la perte d'eau trans-épidermique grâce à un échafaudage de couches de cellules. Avec le temps et l'exposition à des agressions extérieures chroniques telles que le tabac, la pollution et les UV, la peau se détériore. On parle de vieillissement cutané chronologique, extrinsèque et de photovieillissement. Le photovieillissement contribue à l'accélération du vieillissement chronologique et à l'induction de cancers cutanés. Les UVA et les UVB sont responsables de la production d'espèces réactives de l'oxygène qui sont impliquées dans la création de dommages à l'ADN et de modifications morphologiques de la peau. Afin de protéger l'organisme de ces altérations, les industriels cherchent à créer de nouveaux produits protecteurs. Pour répondre à cette problématique, il est nécessaire de développer de nouveaux outils et des modèles cutanés d'évaluation avant de tester sur volontaires ou pour éviter les tests sur animaux. Dans cet objectif, ces travaux de thèse se proposent dans un premier temps de caractériser un modèle cutané, l'explant de peau humaine, grâce à une nouvelle méthodologie d'imagerie couplant transparisation et microscopie à feuille de lumière (LSFM). Nos résultats montrent qu'il est possible d'imager des biopsies entières en 3D par sectionnement optique, rapidement et avec une bonne résolution. Il est également possible d'observer les composants majeurs de la peau et de ses annexes, pour étudier des pathologies ou les effets d'agressions extérieures comme les UV. Dans un second temps, nous avons choisi de mettre en place un modèle cutané permettant d'étudier les effets des UVA dans le photovieillissement et de tester l'effet de nouvelles molécules protectrices. Nos résultats montrent qu'une irradiation répétée d'UVA sur un explant de peau provoque l'apparition de cellules apoptotiques et des cassures de l'ADN. L'épaisseur de l'épiderme est diminuée et des immunomarquages in situ observés par LSFM montrent une modification de la localisation de deux protéines impliquées dans la différenciation tardive de l'épiderme. L'analyse de l'ultrastructure du derme montre une altération des principales fibres de la matrice extracellulaire. L'utilisation d'une protection solaire SPF30 a permis de valider la réponse du modèle à un traitement et de tester ainsi une librairie de molécules protectrices. En conclusion, Nos travaux ont permis d'observer pour la première fois la peau par LSFM et démontrer les multiples applications de cette méthodologie en dermatologie. Le modèle " explant UVA ", mimant le photovieillissement, permet d'identifier de nouveaux protecteurs solaires et actifs anti-UVA. / Skin plays the role of a barrier, contributing to the general homeostasis of the body and regulating transepidermal water loss thanks to many cell layers. Over time and with chronic external aggressions such as the tobacco, the pollution and the UV, skin deteriorates. The terms chronological, extrinsic skin aging and photoaging are used. Photoaging is involved in particular in the acceleration of chronological aging and in the induction of skin cancer. UVA and UVB are responsible for producing reactive oxygen species that are involved in DNA damages and morphological modifications of skin. To protect the body against these changes, industrials are working to create new protective products. To further this pursuit, it is necessary to develop new tools and cutaneous models before testing on volunteers or animals. To this end, this thesis first aim to characterize a cutaneous model, the human skin explant, thanks to new imaging methodology coupling clearing and light sheet fluorescence microscopy (LSFM). These results show that it was possible to observe, by optical section, entire 3D biopsies, quickly and with a good resolution. It is thus possible to visualize the major components of skin and these appendages, to study pathologies and external aggressions effect such as UV. Subsequently, we choose to create a cutaneous model making it possible to study the effects of UVA in photoaging and to test the protective effect of new molecules. These results show that repeated UVA irradiation of a skin explant cause apoptotic cells and DNA strand breaks. The thickness of the epidermis decreased and LSFM In situ immunolabeling reveal the modified location of two proteins involved in late differentiation of the epidermis. Analysis of dermis ultrastructure shows a change in the main fibers of the extracellular matrix. The use of SPF30 sunscreen allowed us to validate the model's response to treatment and to test protective molecules. In conclusion, own research has made it possible, for the first, to observe skin by LSFM and to demonstrate the many applications of this methodology in dermatology. The "UVA explant" model, miming photoaging, allows researchers to identify new sunscreens and anti-UVA actives.

Les principales maladies neurodégénératives humaines, qui reposent toutes sur des mécanismes de type prion (auto-propagation d’agrégats protéiques pathogéniques), représentent un risque sociétal majeur avec une augmentation de leur prévalence directement corrélée avec l’augmentation de la longévité de la population mondiale. Il n’existe à ce jour aucun traitement curatif ni aucun modèle expérimental suffisamment pertinent pour ces maladies.L'objectif de ce travail a été d'utiliser le potentiel des mini-cerveaux humains comme modèle in vitro auto-assemblé en trois dimensions (3D) capable de restituer la complexité du cortex cérébral et d’étudier les mécanismes de type prion en développant une méthodologie de validation basée sur la microscopie 3D. Ces nouvelles structures 3D qui peuvent être obtenues à partir de cellules adultes reprogrammées de patients en cellules souches pluripotentes induites (iPSC), offrent des possibilités uniques pour accéder, observer et perturber les processus biologiques dans le cerveau humain sans les biais ni les complications des modèles animaux ou des échantillons de cerveau humain ex vivo. Ce modèle permet notamment d’observer l’apparition d’agrégats d’Aß et de Tau phosphorylée, deux protéines qui s’accumulent et se propagent de cellule en cellule dans la maladie d’Alzheimer.Nous avons été en mesure de rendre le modèle des mini-cerveaux compatible avec une future approche de criblage de molécules thérapeutiques en modifiant la méthodologie de différenciation pour augmenter leur rendement de production. D’autre part, nous avons pu tester différentes modalités de modélisation pour la Maladie d’Alzheimer, la maladie de Parkinson, la Démence Fronto-Temporale et la maladie de Creutzfeldt-Jakob : à l’aide de molécules d’induction chimique, à l’aide de cellules issues de patients, par modification génétique et par mise en contact de matériel infectieux. Ces différentes approches nous ont permis d’établir que le modèle d’organoïde cérébral permet de reproduire des aspects-clés retrouvés dans l’apparition de la pathologie chez les patients. Pour compenser l’hétérogénéité de notre modèle, nous avons réalisé une analyse in toto par imagerie, c’est-à-dire dans sa totalité sans coupes préalables. La modalité retenue pour cette acquisition est la microscopie à feuillet de lumière utilisée après marquage et clarification des mini-cerveaux. Pour ce faire, nous avons évalué et développé différentes stratégies en vue d’obtenir une plateforme d’analyse à haut contenu pour nos organoïdes cérébraux.Cette plateforme centrée autour de l’organoïde cérébral, sous-tendue par l’analyse en microscopie 3D, a été développée dans le cadre du projet « Investissements d’Avenir » 3DNeuroSecure. Ce projet a pour ambition d’apporter des solutions de calcul haute performance au domaine de la biologie, notamment avec la possibilité de traiter des informations de très grand volume, dit « exascale », telles que celles que nous obtenons avec la microscopie 3D. Le développement de cet aspect nous permettrait à terme de pouvoir établir les bases d’un outil de criblage thérapeutique par les organoïdes cérébraux pour les maladies neurodégénératives. Nous avons démontré que les mécanismes de type prion pouvaient être étudiés dans ce modèle de mini-cerveaux humains et de multiples voies de recherche fondamentale et appliquée sont désormais possibles. A plus long terme, une telle plateforme pourrait accueillir tout type d’organoïdes pour modéliser l’ensemble du corps humain et s’inscrire comme un compagnon biologique dans le cadre des futurs développements de la médecine personnalisée. / Human neurodegenerative diseases, which are all based on prion-like mechanisms (self-propagation of pathogenic protein aggregates), represent a major societal risk with the increase of their prevalence directly correlated to the increasing longevity of the world population. There is to date neither any cure nor any pertinent experimental model for their study.The objective of this work was to use the potential of human mini-brains, a self-assembled three-dimensional in vitro model able to restitute the complexity of the cerebral cortex. This model will allow us to study prion-like mechanism by developing a validation methodology based on 3D microscopy. These novel 3D structures can be obtained from reprogrammed adult cells into induced pluripotent stem cells (iPSCs) and offer unique possibilities to access, observe and disrupt biological processes in the human brain without bias nor complications as in animal models and ex vivo human brain samples. This model makes it possible to observe the development of aggregates of Aβ and hyper-phosphorylated Tau, two proteins that accumulate and propagate from cell to cell during Alzheimer’s disease.We have been to able to adapt the cerebral organoid model for a future screening approach by modifying the differentiation methodology to enhance its production ratio. We also have been able to test different modalities for disease modeling for Alzheimer’s disease, Parkinson’s disease, Fronto-Temporal Dementia and Creutzfeldt-Jakob disease: with chemical induction, with patient specific cells, through genetic modification and through contact with infectious material. These different approaches allowed us to validate that the cerebral organoid can indeed reproduce key aspects found during pathological development within patients. To compensate for the heterogeneity of the cerebral organoid, we performed an in toto analysis through microscopy, meaning in its totality without prior slicing. The chosen method of acquisition is fluorescence light-sheet microscopy used after staining and optical clearing of cerebral organoids. To do so, we have evaluated and established different strategies in order to obtain a high content screening platform for our cerebral organoid model.This platform centered around the cerebral organoid model, underpinned by 3D microscopy analysis, was developed during the “Investissements d’Avenir” project 3DNeuroSecure. This project has for ambition to bring high performance computing to the biological sciences, notably with the possibility to deal with large scale data, also called “exascale”, like the ones obtained with 3D microscopy. The development of this aspect would allow us to establish the basis for a therapeutic screening tool based on cerebral organoids for neurodegenerative diseases. We have demonstrated that prion-like mechanisms can be studied in a human mini-brain model and multiple research avenues are now opened for both fundamental and applied research. This platform could in turn become the basis for any kind of organoids derived from patients to model the whole human body and become a biological companion for personalized medicine.

Cette thèse aborde la problématique de la restauration d’images 3D de noyaux cellulaires fluorescents issues de la microscopie 2-photons à balayage laser d’animaux observés in vivo et in toto au cours de leur développement embryonnaire. La dégradation originale de ces images provient des limitations des systèmes optiques, du bruit intrinsèque des systèmes de détection ansi que de l’absorption et la diffusion de la lumière dans la profondeur des tissus. A la différence des propositions de “débruitage” de l’état de l’art, nous proposons ici une méthode qui prend en compte les particularités des données biologiques. Cette méthode, adaptation à la troisième dimension d’un algorithme utilisé dans l’analyse d’image astronomique, tire parti de connaissances a priori sur les images étudiées. Les hypothèses émises portent à la fois sur la détérioration du signal par un bruit supposé Mixe Poisson Gaussien (MPG) et sur la nature des objets observés. Nous traitons ici le cas de noyaux de cellules embryonnaires que nous supposons quasi sphériques.L’implémentation en 3D doit prendre en compte les dimensions de la grille d’échantillonnage de l’image. En effet ces dimensions ne sont pas identiques dans les trois directions de l’espace et un objet sphérique échantillonné sur cette grille perd cette caractéristique. Pour adapter notre méthode à une telle grille, nous avons ré-interprété le processus de filtrage, au coeur de la théorie originale, comme un processus physique de diffusion. / In this this document, we present a method to denoise 3D images acquired by 2-photon microscopy and displaying cell nuclei of animal embryos. The specimens are observed in toto and in vivo during their early development. Image deterioration can be explained by the microscope optical flaws, the acquisition system limitations, and light absorption and diffusion through the tissue depth.The proposed method is a 3D adaptation of a 2D method so far applied to astronomical images and it also differs from state-of the of-the-art methods by the introduction of priors on the biological data. Our hypotheses include assuming that noise statistics are Mixed Poisson Gaussian (MPG) and that cell nuclei are quasi spherical.To implement our method in 3D, we had to take into account the sampling grid dimensions which are different in the x, y or z directions. A spherical object imaged on this grid loses this property. To deal with such a grid, we had to interpret the filtering process, which is a core element of the original theory, as a diffusion process.

L'imagerie de la rétine, in vivo et à haute résolution, est rendue difficile à cause des aberrations de l'œil, qui limitent la résolution. La mesure et la correction de ces aberrations sont possibles grâce à l'utilisation de l'optique adaptative (OA). Un banc d'imagerie rétinienne avec OA a été développé par l'Observatoire de Paris et est actuellement utilisé sur un panel de patients à l'Hôpital des XV-XX à Paris. <br />En imagerie plein champ, le caractère tridimensionnel de l'objet d'intérêt (la rétine) rend l'interprétation des images difficile puisque tous les plans qui constituent l'objet contribuent à la formation de chaque plan image. De plus, la correction par OA est toujours partielle. Il est donc nécessaire de déconvoluer les images enregistrées afin d'une part de séparer numériquement les plans de l'objet et d'autre part, d'améliorer la résolution latérale. Une méthode de déconvolution nécessite généralement, pour donner des résultats satisfaisants, d'une part une bonne connaissance de la réponse impulsionnelle (RI) du système complet, et d'autre part un ajustement de paramètres de réglage appelés hyper-paramètres. <br />Nous avons développé deux méthodes de déconvolution 3D. La première méthode suppose la RI du système connu. La deuxième est une extension tridimensionnelle de la méthode de diversité de phase et permet d'estimer la RI du système conjointement à l'objet d'intérêt. <br />Par ailleurs, nous avons développé une technique d'estimation non supervisée (« automatique ») des <br />hyper-paramètres, qui permet d'envisager une utilisation efficace de la déconvolution 3D même par des <br />utilisateurs peu familiers du traitement des images tels que médecins ou biologistes. <br />Ces méthodes ont été validées d'abord sur des données simulées réalistes. Ensuite nous avons déve- <br />loppé à l'ONERA un banc d'imagerie 3D pour effectuer une validation expérimentale. Nous présenterons <br />les résultats préliminaires obtenus sur des images acquises sur ce banc.

Cette thèse, consacrée à la mesure endoscopique de formes tridimensionnelle, se place dans un double contexte applicatif : tout d'abord industriel, avec l'inspection endoscopique de pièces mécaniques en milieu contraint (notamment tubulaire) à des résolutions micrométriques. Le second contexte est médical avec la détection de formes tridimensionnelle lors de coloscopies pour l'aide au diagnostic. L'endoscopie souple est obtenue par l'utilisation de guides optiques, la méthode de mesure tridimensionnelle est basée sur la stéréovision active avec la génération de lumière structurée par une matrice de micro-miroirs. Après avoir établi l'état de l'art, une méthode de conception et d'évaluation optique appliquée à la stéréovision en endoscopie souple est décrite. C'est ensuite la réalisation instrumentale, son évaluation métrologique, et une méthode innovante de basculement de modes dynamique entre stéréovision active et passive qui sont détaillées. Des méthodes algorithmiques de reconstruction tridimensionnelle adaptées à ce type d'instrument sont enfin proposées. Les contributions scientifiques de cette étude sont multiples. Une méthode d'analyse optique basée sur l'utilisation de fonctions de transfert de modulation pour la conception d'un endoscope mesurant par stéréovision est proposée. Des méthodes de traitement d'image pour un étalonnage robuste malgré une défocalisation optique ainsi qu'un nouvel algorithme à décalage de phase constituent également des contributions de l'étude. L'association de ces méthodes a permis d'extraire un principe de réalisation permettant la mesure tridimensionnelle par endoscopie souple. / This thesis aims at developing a tri-dimensional measurement endoscopic device in a double context: the first one is industrial with endoscopic inspection of mechanical pieces (tubular inspection, for example) at micrometric resolution. The second context is medical with tri-dimensional shape detection during colonoscopy to help the surgeon diagnosis. In this study, flexible endoscopy is made possible by using image guides and the tri-dimensional reconstruction method is based on active stereovision where a digital micro-mirror device is used to spatially structure the incoming light. After developing the state of the art, an optical conception and evaluation method, applied to stereovision for flexible endoscopic devices is described. The instrumental realization is then detailed and metrologically evaluated. An innovative method that allows to switch dynamically between active and passive stereovision is then detailed. Finally, 3D reconstruction algorithms adapted to this endoscopic instrument are proposed. The scientific contributions of this study are multiple. Firstly, an optical analysis method based on the modulation transfer function to design an endoscopic stereovision system is proposed. An image processing method for robust calibration in a defocused optical environment and a new phase-shifting algorithm for 3D reconstruction are proposed. Finally, a realization principle for 3D measurement in flexible endoscopy was extracted from the combination of all these methods.