No description available.

Plant breeding is focused on selection of new genotypes with improved traits. Conventional methods based on hybridization and those based on biotechnology (somatic hybridization, genetic transformation, ploidy manipulation, etc.) are used to create novel genetic variations. Biotechnology provides powerful tools for plant breeding, for instance, haploid technology allows achievement of homozygous lines from heterozygous parents in one step, which reduces significantly the time required by conventional methods. Concerning woody species, characterized by self-incompatibility, long juvenile period and high degree of heterozygosity, this technique is the only way to get homozygous lines. Haploid plants are of great interest for breeding and genomic studies, being used in mutation research, genetic analysis, genome mapping and gene transfer. Gametic embryogenesis, based on cellular totipotency, produces an embryo from an immature gamete, by switching its developmental pathway from gametophytic to sporophytic. This research is focused on inducing gametic embryogenesis in two important Mediterranean fruit crops: almond (Prunus dulcis Mill.) via in vitro anther culture and mandarin (Citrus reticulata Blanco) via isolation and microspore culture. Also ploidy manipulation was applied to loquat (Eriobotrya japonica (Thunb.) Lindl.) for getting genotypes whit different ploidy levels. The experiments were carried out through years 2014, 2015 and 2016 at the 'Università degli Studi di Palermo' (UNIPA) as well as at the 'Instituto Valenciano de Investigaciones Agrarias' (IVIA). Regarding the almond anther culture, formation of calli and production of embryos was achieved through the direct embryogenesis route. On then other hand, early embryo regeneration is reported, for the first time, from isolated microspore culture of mandarin, 'Mandarino Tardivo di Ciaculli'. Our results report the evidence of gametic embryogenesis and the production of homozygous regenerants in almond and mandarin, two species extremely recalcitrant to microspore embryogenesis. However, the results are affected by many factors that need further studies to better understand the embryogenic development and to increase the rate of embryo achievement. Moreover, another biotechnological tool (ploidy manipulation) was also applied for implementing the IVIA loquat breeding program. Polyploid plants are of great interest in this species, due to its potential for producing seedless genotypes via direct use of triploids or crosses between tetra and diploids. Aimed at obtaining new loquat genotypes, with different ploidy levels (polyploids), colchicine was applied to seeds before germination, to induce chromosome duplication. A total of three triploids (3x) and one tetraploid (4x) were obtained. / La mejora genética tiene como objetivo la selección de nuevos genotipos con mejores características. Los métodos de mejora convencional basados en hibridaciones y aquellos basados en Biotecnología (hibridación somática, transformación genética, manipulación de la ploidía, etc.) se utilizan para obtener nueva variación genética. La Biotecnología proporciona herramientas poderosas en mejora genética, por ejemplo, la obtención de haploides permite obtener líneas homocigotas en un solo paso, disminuyendo significativamente el tiempo requerido usando métodos convencionales. Respecto a especies leñosas, caracterizadas por autoincompatibilidad floral, largo período juvenil y alto grado de heterocigosidad, esta técnica es el único método de obtención de líneas homocigotas. Los genotipos haploides tienen un alto interés en estudios genómicos, siendo utilizados en estudios de mutaciones, análisis genéticos, mapeo genético y transferencia genética. Este estudio tiene como objetivo la inducción de embriogénesis gamética en dos especies mediterráneas muy importantes: el almendro (Prunus dulcis Mill.) por medio de cultivo in vitro de anteras y el mandarino (Citrus reticulata Blanco) por medio de aislamiento de microesporas. Además, se ha estudiado la obtención de poliploides en níspero (Eriobotrya japonica (Thunb.) Lindl.) con el objetivo de obtener genotipos con diversos niveles de ploidía. Los experimentos se llevaron a cabo en los años 2014, 2015 y 2016 en la 'Università degli Studi di Palermo' (UNIPA) y en el 'Instituto Valenciano de Investigaciones Agrarias' (IVIA). Respecto al cultivo de anteras en almendro, la formación de callos y producción de embriones se obtuvo mediante embriogénesis directa. Por otro lado, se ha conseguido regenerar por primera vez embriones a partir de microesporas aisladas en el cultivar de mandarino 'Mandarino Tardivo di Ciaculli'. Los resultados obtenidos muestran que la embriogénesis gamética y la regeneración de embriones homocigótos en almendro y mandarino, dos especies extremadamente recalcitrantes para la embriogenésis a partir de microesporas, es posible. Sin embargo, los resultados se ven afectados por muchos factores que necesitan estudios adicionales para comprender mejor el desarrollo embriogénico y para aumentar la tasa de obtención del embriones. Además, otra herramienta biotecnológica (manipulación de la ploidía) se aplicó con el objetivo de implementar el programa de mejora de níspero del IVIA. Las plantas poliploides en esta especie tienen un alto interés, pues podrían permitir la obtención de frutos sin semilla, por medio de la obtención directa de triploides o mediante cruzamiento entre tetraploides y diploides. Con el objetivo de obtener nuevos genotipos de níspero con diferentes niveles de ploidía (poliploides), se aplicó colchicina a semillas sin germinar con el fin de inducir la duplicación cromosómica y se obtuvieron 3 triploides (3x) y un tetraploide (4x). / La millora genètica té com objectiu la selecció de nous genotips amb millors característiques. Els mètodes de millora convencional basats en hibridacions i aquells basats en Biotecnologia (hibridació somàtica, transformació genètica, manipulació de la ploïdia, etc.) s'utilitzen per aconseguir nova variació genètica. La Biotecnologia proporciona eines poderoses en millora genètica, per exemple, l'obtenció d'haploides permet obtenir línies homozigòtiques en un sol pas, disminuint significativament el temps requerit usant mètodes convencionals. Pel que fa a espècies llenyoses, caracteritzades per autoincompatibilitat floral, llarg període juvenil i alt grau d'heterozigosi, aquesta tècnica és l'únic mètode d'obtenció de línies homozigòtiques. Els genotips haploides tenen un alt interès en estudis genòmics, sent utilitzats en estudis de mutacions, anàlisis genètics, mapatge genètic i transferència genètica. Aquest estudi té com objectiu la inducció d'embriogènesi gamètica en dos espècies mediterrànies molt importants: l'ametller (Prunus dulcis Mill.) a través del cultiu in vitro d'anteres i el mandariner (Citrus reticulata Blanco) per mitjà d'aïllament de micròspores. A més a més, s'ha estudiat l'obtenció de poliploides en nespra (Eriobotrya japonica (Thunb.) Lindl.) Amb l'objectiu d'aconseguir genotips amb diversos nivells de ploïdia. Els experiments es van dur a terme en els anys 2014, 2015 i 2016 a la 'Università degli Studi di Palermo' (UNIPA) i a 'l'Institut Valencià d'Investigacions Agràries' (IVIA). Respecte al cultiu d'anteres en ametller, la formació de calls i producció d'embrions es va obtenir mitjançant embriogènesi directa. D'altra banda, s'ha aconseguit per primera vegada la regeneració d'embrions a partir de micròspores aïllades en el conrear de mandariner 'Mandarino Tardivo di Ciaculli'. Els resultats obtinguts mostren que l'embriogènesi gamètica i la regeneració d'embrions homozigotics en ametller i mandariner, dues espècies extremadament recalcitrants per l'embriogènesi a partir de micròspores, és possible. No obstant això, els resultats es veuen afectats per molts factors que necessiten estudis addicionals per entendre millor el desenvolupament embriogènic i per augmentar la taxa d'obtenció dels embrions. A més, una altra eina biotecnològica (manipulació de la ploïdia) es va aplicar amb l'objectiu d'implementar el programa de millora de nespra de l'IVIA. Les plantes poliploides en aquesta espècie tenen un alt interès, ja que podrien permetre l'obtenció de fruits sense llavor, per mitjà de l'obtenció directa de triploides o mitjançant encreuament entre tetraploides i diploides. Amb l'objectiu d'aconseguir nous genotips de nespra amb diferents nivells de ploïdia (poliploides), es va aplicar colquicina a llavors sense germinar per tal d'induir la duplicació cromosòmica i es van obtenir 3 triploides (3x) i un tetraploide (4x). / Cimò, G. (2017). Ploidy manipulation for genetic improvement in some Mediterranean fruit crops [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/79874

Bei der routinemäßigen Anwendung der Mikrosporenkultur zur Herstellung doppelt-haploider Linien kommt es bis heute zu Engpässen in der praktischen Rapszüchtung. Die Hauptprobleme stellen eine unzureichende Colchizin-induzierte Diploidisierungsrate und eine niedrige direkte Regeneration von Pflanzen aus Mikrosporen-Embryonen dar. Ein hoher Prozentsatz an Rapsembryonen aus Mikrosporenkultur durchläuft den Prozess der sekundären Embryogenese, der eine zeitintensive Subkultivierung erfordert. Hierbei werden die direkten Sprossansätze wiederholt von undifferenziertem Gewebe freigeschnitten bis eine Überführung in Erde und die letztendliche Regeneration zu doppelt-haploiden Pflanzen möglich ist. Die vorliegende Doktorarbeit besteht aus zwei Studien, die sich mit dem Thema: „Methodische Verbesserungen der Mikrosporenkultur in Brassica napus L.“ auseinandersetzen. Ziel der ersten Studie war die Erhöhung der Colchizin-induzierten Diploidisierungsrate von Mikrosporen ohne die Regeneration von Pflanzen aus den Mikrosporen-Embryonen zu verringern und damit die Entwicklung zu doppelt-haploiden Pflanzen zu verzögern. Aufgrund der hohen Toxizität von Colchizin wurden die weniger toxischen Mitosehemmstoffe Amiprophos-methyl (APM) und Pronamid, die eine höhere Affinität zu Pflanzentubulin als Colchizin besitzen, allein und in Kombination mit Colchizin untersucht. Eine Kombination dieser Mitosehemmstoffe führte zu keiner effizienten Diploidisierungsrate; demnach konnte ein synergistischer Effekt ausgeschlossen werden. Die acht untersuchten Winterrapsgenotypen erzielten eine Diploidisierungsrate von 40% bis 64%. Die Mitosehemmstoff-Behandlungen der isolierten Mikrosporen variierten hierbei zwischen 33% (3 µM APM, 72 Stunden) und 70% (25 µM Colchizin, 72 Stunden). Ein signifikanter Einfluss der Mitosehemmstoffe auf die Konversionsrate der Mikrosporen-Embryonen konnte nicht nachgewiesen werden. In Abhängigkeit der Genotypen konvertierten 14% bis 23% direkt. Unterschiedliche getestete Colchizinkonzentrationen (250, 150, 125, 25 µM) zeigten für 4 untersuchte Genotypen eine Colchizin-induzierte Diploidisierungsrate von 58% bis 66%, wobei die Behandlung 250 µM Colchizin für 48h die höchste Rate aufwies. Ein signifikanter Einfluss von Dimethylsulfoxid (DMSO), das oftmals als Lösungsmittel der angewendeten Mitosehemmstoffe verwendet wird, konnte jedoch nicht in den untersuchten Konzentrationen (0,3% und 3%) in Kombination mit der Colchizin-Behandlung (250 µM, 72 Stunden) auf die Diploidisierungsrate und die direkte Konversionsrate nachgewiesen werden. Weiterhin wurden 17 Winterrapsgenotypen bezüglich ihrer spontanen und ihrer Colchizin-induzierten Diploidisierungsrate untersucht und deren Konversionsrate der Mikrosporen-Embryonen zu Regeneraten mit direkten Sprossansätzen bestimmt. Die ausgewählten Genotypen enthielten sowohl Sorten als auch F1–Hybriden. Die spontan-induzierte Diploidisierungsrate zeigte eine große Variation von 15% bis 69%. Im Vergleich dazu erreichte die Colchizin-induzierte Diploidisierungsrate Werte von 40% bis 83%. Die Mikrosporen-Embryonen der getesteten Genotypen wiesen ebenfalls eine große Spannbreite bezüglich ihrer direkten Konversionsrate auf. Die Ergebnisse zeigten keinen signifikanten Einfluss der Mitosehemmstoff-Behandlung auf den Regenerationserfolg der Mikrosporen-Embryonen zu Pflanzen. Sowohl die beobachtete spontane und die Mitosehemmstoff-induzierte Diploidisierung als auch die Konversionsrate der Mikrosporen-Embryonen zu Regeneraten mit direkten Sprossansätzen waren stark Genotyp-abhängig. Ziel der zweiten Studie war die Erhöhung der direkten Regeneration der Mikrosporen-Embryonen zu Pflanzen trotz der starken Abhängigkeit der Genotypen. Zunächst wurde der Einfluss von zehn unterschiedlichen Sprossregenerationsmedien mit und ohne Phytohormone (Gibberellinsäure, 6-Benzylaminopurin, 3-Indolylbuttersäure) und eine 14-tägige Kältebehandlung bei 4 °C (Lichtthermostat) auf die direkte Konversionsrate der Mikrosporen-Embryonen von 5 Winterrapsgenotypen untersucht. Die 14-tägige Kältebehandlung erfolgte sowohl unter acht Stunden Licht als auch in Dunkelheit. Die Standardkultivierung der Mikrosporen-Embryonen erfolgte im Kulturraum bei 26 °C und 12 Stunden Licht. 13% bis 39% der Mikrosporen-Embryonen konvertierten direkt, wobei die höchste Rate von 43% nach Kultivierung der Embryonen auf Gamborg B5-Medium mit 0.1 mg/L Gibberellinsäure resultierte. Die Mittelwerte der Konversionsrate der Mikrosporen-Embryonen zu Regeneraten mit direkten Sprossansätzen aller untersuchten Genotypen und Kulturmedien wurden durch die 14-tägige Kältebehandlung (28%) gegenüber der Standardkultivierung (14%) signifikant erhöht. Nachfolgend wurde der Einfluss der vier effizientesten Sprossregenerationsmedien und eine 14-tägige Kältebehandlung bei 1.5 °C und bei 4 °C (Lichtthermostat) auf die Konversionsrate von Mikrosporen-Embryonen von 13 Winterrapsgenotypen untersucht. Die Kältebehandlung bei 1.5 °C erfolgte unter Lichtabwesenheit als auch unter acht Stunden Licht. Die Kältebehandlung bei 4 °C erfolgte dagegen in Dauerlicht und Dauerdunkel. Zwischen 29% und 76% der Mikrosporen-Embryonen konvertierten direkt. Im Vergleich zur Kultivierung unter Standardbedingungen konnte mit der Kältebehandlung eine signifikante Erhöhung erzielt werden (von 21% auf bis zu 71%). Nach vorheriger Kultivierung der Mikrosporen-Embryonen auf den unterschiedlichen Kulturmedien variierte die Konversionsrate zwischen 50% (MS) und 60% (B5 mit 0.1 mg/L Gibberellinsäure). Die Ergebnisse der Untersuchungen zeigten, dass trotz einer vorherrschenden starken Abhängigkeit vom Genotyp, die direkte Konversionsrate der Mikrosporen-Embryonen mit Kältebehandlung (1.5 °C im Dauerdunkel) signifikant erhöht werden konnte. Fast alle Genotypen zeigten Konversionsraten der Mikrosporen-Embryonen von über 70%. Es ist demnach möglich die sekundäre Embryogenese und die damit verbundene zeitintensive in vitro-Subkultivierung erheblich zu reduzieren, und dadurch den Entwicklungsprozess von doppelt-haploiden Linien zur Verwendung in der praktischen Rapszüchtung zu beschleunigen.

No description available.

Due to the immense utilization in food and industry, there is enormous commercial and scientific interest to manipulate canola (Brassica napus L.) seed oil. Seed oil accretions are influenced by genes involved in embryo and seed development. FUSCA3 (FUS3) and LEAFY COTYLEDON1 (LEC1) are well-known transcription factors involved during seed and embryo development. The main objective of this project was to evaluate the role of these genes during seed storage deposition and microspore-derived embryogenesis in B. napus. For this purpose, six BnLEC1 transgenic lines and three BnFUS3 TILLING mutant lines were generated. The over expression of BnLEC1 significantly increased the seed oil content, while the down regulation of BnLEC1 or mutation of BnFUS3 reduced the level of seed oil. Experimental alterations of BnLEC1 and BnFUS3 triggered transcriptional modifications in enzymes taking part in sucrose transport and metabolism, glycolysis, and fatty acid (FA) biosynthesis. These changes are suggestive of a greater carbon pool to FA biosynthesis in tissues over-expressing BnLEC1, and a reduced carbon flux available for the synthesis of FA in BnLEC1 down regulators and BnFUS3 tilling mutants. While the elevated oil content induced by BnLEC1 was not accompanied by alterations in FA composition, oil nutritional value, or glucosinolate (GLS) levels, suppression of BnLEC1 reduced seed oil accumulation and raised levels of GLS, possibly through the transcriptional regulation of BnST5a (Sulphotransferase5a), the last GLS biosynthetic enzyme. BnFUS3 tilling mutant seeds had increased levels of linoleic acid, possibly due to the reduced expression of ω-3 FA DESATURASE (FAD3). The effects of altered expression of BnLEC1 and BnFUS3 were also assessed during microspore-derived embryogenesis. Substantial structural abnormalities, accompanied by changes in transcript levels of several embryo marker genes were observed in embryos in which the expression of BnLEC1 or BnFUS3 was altered. The changes in oil level and FA profiles observed in the transformed microspore-derived embryos followed a similar trend to that described in seeds. Collectively, these observations suggest that manipulation of BnLEC1 and BnFUS3 can be employed as a tool to enhance seed oil production and quality in B. napus. / February 2017

Submitted by Gabriela Lopes (gmachadolopesufpel@gmail.com) on 2016-09-27T14:35:10Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Dissertação_Francieli_Cima.pdf: 1564850 bytes, checksum: 1875a0cdb8f46c6a1880c860e06bdbe3 (MD5) / Approved for entry into archive by Aline Batista (alinehb.ufpel@gmail.com) on 2016-09-28T17:12:22Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissertação_Francieli_Cima.pdf: 1564850 bytes, checksum: 1875a0cdb8f46c6a1880c860e06bdbe3 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2016-09-28T17:12:22Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertação_Francieli_Cima.pdf: 1564850 bytes, checksum: 1875a0cdb8f46c6a1880c860e06bdbe3 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Previous issue date: 2014-03-31 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / No Brasil, a cultura do trigo ocupa lugar de destaque nos sistemas de produção da Região Sul, representando uma opção muito importante como um cereal de inverno. O melhoramento genético das culturas autógamas tem contado com vários métodos para produzir cultivares mais recentes e superiores com características melhoradas. Um exemplo muito bem sucedido tem sido o método de produção de plantas duplohaploides usado para acelerar o desenvolvimento de uma nova cultivar. Em trigo, a cultura de micrósporos isolados tem sido usada para a obtenção de plantas duplohaploides. No entanto, esta técnica tem sido caracterizada como altamente genótipo-dependente e de produzir altas taxas de plantas albinas. Assim, o objetivo deste trabalho foi otimizar um protocolo através da cultura in vitro de micrósporos isolados utilizando-se genótipo de trigo com alta produção de plantas albinas. Para este estudo, plantas F1 oriundas do cruzamento de trigo entre Toropi x BRS 194 foram usadas como doadoras de micrósporos. Foram realizados três experimentos. No primeiro experimento, anteras foram removidas das espiguetas e tratadas em três soluções de pré-tratamentos à 4°C: a) manitol (62 g L-1) + 15 µM de sulfato de cobre (CuSO4.5H20); b) manitol (62 g L-1) e c) 15 µM de sulfato de cobre. No segundo experimento, foram testadas as mesmas soluções de pré-tratamento do experimento anterior, com a diferença de que neste experimento, espiguetas inteiras foram usadas para o pré-tratamento. No terceiro experimento, somente o pré- tratamento a frio foi aplicado nas espigas e houve uma modificação no meio de indução, quando foram testados nove tratamentos: controle (meio de indução padrão); sulfato de cobre (2,0 µM); prolina (10 mM); glutationa (2,0 µM); cefotaxima (100 mg L-1); sulfato de cobre (4,0 µM); sulfato de cobre (2,0 µM) + prolina (10 mM); sulfato de cobre (2,0 µM) + glutationa (2,0 µM); sulfato de cobre (2,0 µM) + cefotaxima (100 mg L-1). Os resultados obtidos nos experimentos 1 e 2 mostrou que a solução de pré-tratamento contendo 15 µM de sulfato de cobre foi mais eficiente para desencadear a embriogênese dos micrósporos e regenerar plantas verdes em trigo. No terceiro experimento, o meio de indução suplementado com 100 mg L-1 de cefotaxima mostrou um aumento na formação de embriões e também na regeneração de plantas verdes. / In Brazil, the wheat crop occupies an outstanding place in the production systems of the Southern Region, representing a very important option as a winter cereal. Genetic improvement of self-fertilizing crops has relied on several methods to produce newer and superior cultivars with enhanced traits. A very successful example has been the use as double haploids as a method to accelerate the development of a new cultivar. In wheat, isolated microspore culture has been used to obtain doubled haploid plants. However, this technique has been characterized as highly genotype dependent and producing high rates of albino plants. Thus, the objective of this work was to optimize a protocol through the in vitro culture of isolated microspores utilizing a wheat genotype with high production of albino plants. For this study, F1 plants originated from the wheat cross between Toropi x BRS 194 were used as microspore donor plants. Three experiments were carried out. In the first experiment, anthers were treated in three pre-treatment solutions, at 4°C: a) mannitol (62 g L-1) + 15 µM copper sulphate (CuSO4.5H20); b) mannitol (62 g L-1) and c) 15 µM copper sulphate. In the second experiment, the same pre-treatment solutions of the previous experiment were tested, with the difference that in this experiment, whole spikelets were used for the pre-treatment. In the third experiment, only cold pre-treatment was applied to the spikes, and there was a modification in the induction medium, when nine treatments were tested: control (standard induction medium); copper sulphate (2,0 µM); proline (10 mM); glutathione (2,0 µM); cefotaxime (100 mg L-1); copper sulphate (4,0 µM); copper sulphate (2,0 µM) + proline (10 mM); copper sulphate (2,0 µM) + glutathione (2,0 µM); copper sulphate (2,0 µM) + cefotaxime (100 mg L-1). Results obtained in experiments 1 and 2 showed that the pre-treatment solution containing 15 µM of copper sulphate was more efficient to trigger the embryogenesis of microspores and regenerate green plants in wheat. In the third experiment, the induction medium, supplemented with 100 mg L-1 of cefotaxime showed an increase in the formation of embryos and also in the regeneration of green plants.

- Ph.D. thesis - Milan Urban, 2017 In some years, the agricultural production of oilseed rape, an important crop in the Czech Republic, is - besides biotic stress - facing the problem of damage caused by frost or drought. Together with special attention paid to proteins revealing responses between crop genotypes with differential abiotic stress tolerance levels we reviewed possible applications of proteomic results in crop breeding programs aimed at an improvement of crop stress tolerance (paper 1). For first original result, cold temperature was imposed upon non-vernalized plants in the stage of leaf rosette. The article (paper 2) shows a significant correlation between frost tolerance (FT), dehydrin (DHN) accumulation, and photosynthetic acclimation in five cultivars (cvs). Newly, the specific DHN D97 was shown to accumulate and other DHNs were shown to have qualitative differences in accumulation. These results imply that proper FT assessment is based on rapid photosynthetic acclimation together with higher accumulation of protective compounds. Drought stress (paper 3) was imposed in the water- demanding stem prolongation phase before flowering, because late-spring drought before and during flowering decreases the yield and seed quality significantly. This paper newly describes two water-uptake...

[ES] Los dobles haploides son una gran herramienta para la mejora genética de híbridos debido a que se puede alcanzar la homocigosis completa en una sola generación. Entre las técnicas usadas para obtener estas plantas, la inducción de la embriogénesis de microsporas, mediante el cultivo de anteras o de microsporas, es la más eficiente y la más usada. La embriogénesis de microsporas es también un ejemplo de totipotencia de las células vegetales gracias a su habilidad de reprogramar su desarrollo gametofítico hacia una ruta esporofítica, donde las células proliferan de forma organizada para crear un nuevo organismo. Como en muchos otros procesos in vitro, las condiciones de cultivo deben ser optimizadas para incrementar la eficiencia. En la presente Tesis Doctoral, hemos usado dos especies como sistemas experimentales para estudiar y optimizar el cultivo de microsporas. Por un lado, usamos berenjena (Solanum melongena) como un ejemplo de cultivo de importancia económica en el que los protocolos todavía tienen mucho margen de mejora. La optimización de la densidad celular y los reguladores de crecimiento han demostrado ser útiles para modificar la eficiencia del cultivo de microsporas de berenjena. Por otra parte, hemos utilizado el cultivo de microsporas de Brassica napus para estudios básicos puesto que ha sido ampliamente usado como modelo para entender procesos celulares que ocurren durante este cambio en el desarrollo. Se detalla un protocolo estandarizado para el cultivo de microsporas de B. napus, el cual ha sido utilizado en todos los cultivos en esta Tesis para explorar una serie de procesos y estructuras celulares potencialmente implicados en el cambio de desarrollo hacia embriogénesis. Estos procesos incluyen estrés del retículo endoplásmico, muerte celular programada, autofagia y estructura y composición de la pared celular. Estudiamos en paralelo el cultivo de microsporas de dos genotipos de B. napus con diferente respuesta androgénica en condiciones estándar y añadiendo Tricostatina A, un modulador epigenético que ha mostrado ser beneficioso para la respuesta androgénica en algunos casos. En conjunto, esta Tesis representa un avance en la optimización del cultivo de microsporas en estas especies y arroja luz sobre el papel de algunos procesos en el contexto de embriogénesis de microsporas. / [CA] Els dobles haploides són una gran eina en millora vegetal per a la producció d'híbrids, a causa de la seua total homozigosi, que es pot aconseguir en només una generació in vitro. Entre les diverses tècniques que s'utilitzen per tal d'obtenir aquestes plantes, la inducció de l'embriogènesi de microspores, mitjançant cultiu d'anteres o microspores, és la més comuna i eficient. L'embriogènesi de microspores també és un exemple de la totipotència de les cèl·lules vegetals, capaços de reprogramar-se d'una via gametofítica a una via esporofítica, on proliferen de manera organitzada per crear un nou organisme. Com en moltes altres tecniques in vitro, s'han d'optimitzar les condicions del cultiu per tal d'augmentar l'eficiència. En la present Tesi Doctoral, hem utilitzat dues espècies de plantes com a sistemes experimentals per estudiar i optimitzar el cultiu de microspores. Per una banda, hem utilitzat l'albergínia (Solanum melongena) com a exemple de cultiu d'importància econòmica on els protocols encara tenen marge per a l'optimització. La optimització de la densitat de cèl·lules en cultiu i la concentració de reguladors de creixement van demostrar ser útils per modificar l'eficiència de la resposta dels cultius de microspores d'albergínia. D'altra banda, hem utilitzat cultius de microspores de Brassica napus principalment per a estudis bàsics, ja que s'utilitza àmpliament com a model per entendre els processos cel·lulars que es produeixen durant aquest canvi de desenvolupament. Es detalla un protocol estandarditzat per al cultiu de microspores de B. napus, que s'ha utilitzat en tots els cultius inclosos en aquesta Tesi per explorar una sèrie de processos i estructures cel·lulars potencialment implicades en el canvi de desenvolupament cap a l'embriogènesi. Aquests inclouen l'estrès del reticle endoplasmàtic, la mort cel·lular programada, l'autofàgia i l'estructura i composició de la paret cel·lular. Vam estudiar en paral·lel cultius de microspores de dos genotips de B. napus amb diferent resposta androgènica, cultivats en condicions estàndard i afegint-hi Tricostatina A, un modulador epigenètic que s¿ha demostrat beneficiós per a la resposta androgènica en alguns casos. En conjunt, aquesta Tesi representa un avanç en l'optimització dels cultius de microsporas en aquestes espècies i aporta llum sobre el paper d'alguns processos en el context de l'embriogènesi de microspores. / [EN] Doubled haploids are a great tool for hybrid breeding due to their complete homozygosity achievable in only one in vitro generation. Among the several techniques used to obtain these plants, induction of microspore embryogenesis, via anther or microspore culture, is the most common and efficient approach. Microspore embryogenesis is also an example of totipotency of plant cells due to their ability to reprogram themselves from a gametophytic to a sporophytic pathway, where cells proliferate in an organized way to create a new organism. As in many other in vitro procedures, culture conditions must be optimized in order to increase efficiency. In the present Doctoral Thesis, we used two plant species as experimental systems to study and optimize microspore culture. On one hand, we used eggplant (Solanum melongena) as an example of economically important crop where protocols have still room for optimization. Optimization of cell density and growth regulators demonstrated to be useful to modify the efficiency of eggplant microspore cultures. On the other hand, we used B. napus microspore cultures principally for basic studies since it is widely used as a model to understand cellular processes occurring during this developmental switch. A standardized protocol for Brassica napus microspore culture is detailed, which was used in all the cultures included in this Thesis to explore a series of processes and cellular structures potentially involved in the developmental switch towards embryogenesis. These included endoplasmic reticulum stress, programmed cell death, autophagy, and cell wall structure and composition. We studied in parallel microspore cultures from two B. napus genotypes with different androgenic response cultured in standard conditions and adding Trichostatin A, a epigenetic modulator shown to be beneficial for the androgenic response in some cases. Together, this Thesis represents an advance in the optimization of microspore cultures in these species, and sheds light on the role of some processes within the context of microspore embryogenesis. / Thanks are due to the Electron Microscopy Service of Universitat Politècnica de València, Marisol Gascón (IBMCP Microscopy Service). This work was supported by grant AGL2017-88135-R to JMSS from MICINN jointly funded by FEDER and by a Marie Skłodowska-Curie Individual Fellowship (656579) to PC-M This work was supported by grant AGL2017-88135-R to JMSS from MINECO jointly funded by FEDER. / Camacho Fernández, C. (2021). Microspore embryogenesis: cell wall dynamics and reprogramming of cell fate [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/163698

Genotypes of rapeseeds producing yellow seeds were not found in nature. Breeders yellow-seeded rapeseeds have been developed applying different combinations of interspecific crosses. In the Laboratory of Genetics-Biotechnology at the Lithuanian Agricultural University, yellow-seeded spring rapeseeds were developed for the first time without interspecific crosses (Burbulis, 2001). All cultivars of yellow-seeded rapeseed have one essential drawback – unblocking of pigmentation takes place in other generations and seeds of different colours (yellowish brown, brown or black) are formed. Breeders, working with the cultivars of yellow-seeded rapeseed, admit that environmental temperature is one of the factors limiting the manifestation of the trait.

Tesis por compendio / Androgenesis induction is an experimental procedure by which microspores are diverted from their original gametophytic pathway towards embryogenesis by applying specific stresses in vitro. It allows for the production of doubled haploid (DH) pure lines through anther culture or isolated microspore culture followed by chromosome doubling. DH technology is interesting for both basic research and plant breeding. In this Thesis, we studied microspore embryogenesis with two parallel approaches: (I) an applied study directed to the development of the first eggplant (Solanum melongena) highly embryogenic line and the improvement of the efficiency of eggplant microspore cultures; and (II) a fundamental research study focused on the relationship between microspore embryogenesis ability, intracellular Ca2+ levels and the dynamics of callose and cellulose deposition for cell wall formation in microspore-derived structures, using rapeseed (Brassica napus) as a model species. As an applied research, we developed and evaluated an eggplant DH population from a commercial hybrid, and identified and characterized the first eggplant highly androgenic DH line (DH36), which may be used to facilitate the study of eggplant androgenesis and for both basic and applied research. In addition, we evaluated different factors involved in microspore embryogenesis induction efficiency in eggplant and optimized the regeneration protocol for DH production via microspore culture. Together, the applied research on eggplant microspore embryogenesis made in this Thesis resulted in the most efficient protocol existing to date for DH production in eggplant. As a fundamental research, we studied the dynamics of Ca2+ during in vivo microsporogenesis and microgametogenesis, as well as during the first stages of in vitro-induced microspore embryogenesis, establishing a link between microspore embryogenesis and changes in Ca2+ levels and subcellular distribution. In addition, we studied the deposition of callose and cellulose during the first stages of microspore embryogenesis and demonstrated that the abnormally increased callose deposition and the inhibition of cellulose deposition observed in embryogenic microspores is most likely caused by a transient increase in the intracellular Ca2+ levels that occurs right after microspore induction. We also found that this particular dynamics of callose and cellulose deposition is related to microspore embryogenesis ability, and is essential for proper progression and success of microspore embryogenesis. In summary, the research made in this Thesis helps to further understand the basis underlying microspore embryogenesis and cell totipotency, and to apply the powerful DH technology to an economically important crop such as eggplant. / La inducción de androgénesis es un procedimiento experimental en el cual las microsporas se desvían de su vía gametofítica original hacia embriogénesis, mediante la aplicación de estreses específicos in vitro. Este fenómeno permite la producción de líneas puras dobles haploides (DH) mediante cultivo de anteras o cultivo de microsporas aisladas seguidos de duplicación cromosómica. La tecnología DH es interesante tanto para la investigación básica como para su aplicación a la mejora genética vegetal. En esta Tesis se estudia la embriogénesis de microsporas y la obtención de DHs con dos enfoques paralelos: (I) un estudio aplicado dirigido al desarrollo de la primera línea de berenjena (Solanum melongena) con alta respuesta androgénica y a la mejora de la eficiencia de los cultivos de microsporas de berenjena; y (II) un estudio de investigación básica centrado en la relación entre la habilidad para la embriogénesis de microsporas, los niveles intracelulares de Ca2+ y la dinámica de la deposición de calosa y celulosa para la formación de paredes celulares en estructuras derivadas de microsporas, utilizando como especie modelo la colza (Brassica napus). Como investigación aplicada, se desarrolló y evaluó una población DH de berenjena a partir de un híbrido comercial, y se identificó y caracterizó la primera línea DH altamente androgénica de berenjena (DH36), que puede usarse para facilitar el estudio de la androgénesis en berenjena y para otros estudios aplicados o básicos. Además, se evaluaron diferentes factores implicados en la eficiencia de la inducción de embriogénesis de microsporas en berenjena, y se optimizó el protocolo de regeneración para la producción de DH mediante cultivo de microsporas. En conjunto, la investigación aplicada sobre la embriogénesis de microsporas realizada en esta Tesis proporciona el protocolo más eficiente existente hasta la fecha para la producción de DH en berenjena. Como investigación fundamental, se estudió la dinámica del Ca2+ durante la microsporogénesis y la microgametogénesis in vivo, así como durante las primeras etapas de la embriogénesis de microsporas inducida in vitro, y se estableció un vínculo entre la embriogénesis de microsporas y los cambios en el nivel y distribución intracelular de Ca2+. Además, se estudió la deposición de calosa y celulosa durante las primeras etapas de la embriogénesis de microsporas y se demostró que la excesiva deposición de calosa y la inhibición de la deposición de celulosa, exclusivas de las microsporas embriogénicas, están causadas por el aumento transitorio de Ca2+ intracelular que se produce justo tras la inducción. Hemos demostrado que esta particular dinámica de la deposición de calosa y celulosa está relacionada con la capacidad androgénica, y que es fundamental para la correcta progresión y éxito de la embriogénesis de microsporas. En resumen, la investigación realizada en esta Tesis ayuda a comprender mejor la base de la embriogénesis de microsporas y de la totipotencia celular, y a aplicar la potente tecnología DH a un cultivo económicamente importante como es la berenjena. / La inducció d'androgènesi és un procediment experimental en el qual les microspores es desvien de la seua via gametofítica original cap a un nou destí embriogènic, mitjançant l'aplicació d'estressos específics in vitro. Aquest fenomen permet la producció de línies pures dobles haploides (DH) mitjançant cultiu d'anteres o cultiu de microsporas aïllades seguits de duplicació cromosòmica. La tecnologia DH és interessant tant per a la recerca bàsica com per a la seua aplicació a la millora genètica vegetal. En aquesta Tesi s'estudia l'embriogènesi de microspores i l'obtenció de DHs amb dos enfocaments paral·lels: (I) un estudi aplicat dirigit al desenvolupament de la primera línia d'albergina (Solanum melongena) amb alta resposta androgènica i a la millora de l'eficiència dels cultius de microspores d'albergina; i (II) un estudi de recerca bàsica centrat en la relació entre la capacitat per a l'embriogènesi de microspores, els nivells intracel·lulars de Ca2+ i la dinàmica de la deposició de cal·losa i cel·lulosa per a la formació de parets cel·lulars en estructures derivades de microsporas, utilitzant com a espècie model la colza (Brassica napus). Com a recerca aplicada, es va desenvolupar i avaluar una població DH d'albergina a partir d'un híbrid comercial, i es va identificar i caracteritzar la primera línia DH altament androgènica d'albergina (DH36), que pot usar-se per a facilitar l'estudi de l'androgènesi en albergina i per a altres estudis aplicats o bàsics. A més, es van avaluar diferents factors implicats en l'eficiència de la inducció d'embriogènesi de microspores en albergina, i es va optimitzar el protocol de regeneració per a la producció de DH mitjançant cultiu de microspores. En conjunt, la recerca aplicada sobre l'embriogènesi de microspores realitzada en aquesta Tesi proporciona el protocol més eficient existent fins avui per a la producció de DH en albergina. Com a recerca fonamental, es va estudiar la dinàmica del Ca2+ durant la microsporogènesi i la microgametogènesi in vivo, així com durant les primeres etapes de l'embriogènesi de microspores induïda in vitro, i es va establir un vincle entre l'embriogènesi de microspores i els canvis en el nivell i distribució intracel·lular de Ca2+. A més, es va estudiar la deposició de cal·losa i cel·lulosa durant les primeres etapes de l'embriogènesi de microspores i es va demostrar que l'excessiva deposició de cal·losa i la inhibició de la deposició de cel·lulosa, exclusives de les microspores embriogèniques, estan causades per l'increment transitori del Ca2+ intracel·lular que es produeix just després de la inducció. Hem demostrat que aquesta particular dinàmica de la deposició de cal·losa i cel·lulosa està relacionada amb la capacitat androgènica, i que és fonamental per a la correcta progressió i èxit de l'embriogènesi de microspores. En resum, la recerca realitzada en aquesta Tesi ajuda a comprendre millor la base de l'embriogènesi de microspores i de la totipotència cel·lular, i a aplicar la potent tecnologia DH a un cultiu econòmicament important com és l'albergina. / Rivas Sendra, A. (2017). Calcium and cell wall dynamics during microspore embryogenesis and double haploid production in rapeseed and eggplant [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/85548 / Compendio