Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Dans l’arsenal thérapeutique anticancéreux, les agents anti-microtubules (MTA) occupent une place essentielle dans le traitement de tumeurs solides et d’hémopathies malignes. Néanmoins, leur utilisation est limitée par l’induction d’une toxicité neurologique qui affecte la qualité de vie des patients et dont les mécanismes d’action demeurent peu compris. L’absence de solutions préventives ou curatives réellement efficaces, reflète la complexité des mécanismes d’action des MTA. Dans le cadre du projet « Mitotarget » (7ème PCRD) porté par le partenaire industriel Trophos, notre objectif était de préciser le mécanisme à l’origine de la neurotoxicité des MTA et d’évaluer le potentiel neuroprotecteur de l’olesoxime, composé ayant fait la preuve de son efficacité neuroprotectrice dans différents modèles de pathologies neurodégénératives. Nous montrons ici que les réseaux microtubulaire (dynamique des microtubules, localisation de la protéine EB1) et mitochondrial (motilité des mitochondries), cibles des MTA dans les cellules cancéreuses, sont aussi affectés dans les cellules de type neuronal. Leur préservation par l’olesoxime est nécessaire à l’établissement d’une neuroprotection. Ce travail met en évidence l’originalité du mécanisme d’action de l’olesoxime, premier neuroprotecteur capable d’agir tout à la fois sur les microtubules et les mitochondries, et souligne l’importance des liens étroits existant entre ces deux compartiments. Deux axes d’étude ont été initiés à la suite de ce projet afin de (i) déchiffrer les interconnexions microtubules-mitochondries dans la réponse des cellules cancéreuses aux MTA; (ii) préciser l’importance et la régulation post-traductionnelle de la protéine EB1 dans l’efficacité anti-migratoire des MTA. L’ensemble des données obtenues appelle à poursuivre la caractérisation des mécanismes de réponse aux agents anti-microtubules afin d’optimiser les stratégies thérapeutiques existantes. / Nowadays, the so-called Microtubule Targeting Agents (MTAs) remain benchmark clinical treatments displaying high efficiency and are still widely used against a broad spectrum of tumors and hemopathies. The new compounds in clinical development and the discovery of their anti-angiogenic properties make them a family booming. However, MTAs treatment is limited by the occurrence of neurological toxicities that greatly impair patients quality of life and which mechanisms of action are still poorly understood. The current absence of really efficient curative of preventive strategies underline the complexity of MTA mechanisms of action. In the framework of the “MitoTarget” project from the 7th PCRD,lead by the industrial partner Trophos, we aimed to precise MTA neurotoxic mechanisms and to evaluate neuroprotective potential of olesoxime, a compound that already showed to be efficient in various models of neurodegenerative diseases. Our data show that microtubular (microtubule dynamics parameters, EB1 protein localization) and mitochondria (mitochondria) networks, MTA targeted compartments in cancer cells, are damaged in neuronal-like cells. Interestingly, olesoxime neuroprotective activity implies preservation of both microtubule and mitochondria from MTA-induced damages. This work highlights the original mechanism of action of olesoxime as the first neuroprotective agent able to act on both microtubule and mitochondria and underlines the strengthened link existing between these compartments. It thus gave rise to two side projects with the aim to (i) decipher microtubule-mitochondria interconnections in response to MTA treatment; (ii) precise the importance and regulation of EB1 in the anti-migratory efficacy of MTA by looking at EB1 post-translational modifications. Altogether, the data obtained incite to keep on characterizing mechanisms involved in response to MTA in order to optimize the existing therapeutic strategies.

Les modifications post-traductionnelles des microtubules sont accumulées sur la queue carboxy-terminale des tubulines α et β, situées à l'extérieur des microtubules. Ces modifications peuvent réguler sélectivement les interactions avec les moteurs moléculaires et les protéines associées aux microtubules (MAPs). Ces interactions sont essentiels pour les fonctions cellulaires et demandent une régulation stricte. La glycylation est une modification que génère des chaînes latérales glycine sur les protéines. Jusqu'à présent, la glycylation a été à peine étudiée, et la plupart des travaux se sont concentrés sur son rôle potentiel dans les cils et les flagelles. Peu est connu sur le rôle de la glycylation des microtubules dans les cils primaires. Les cils primaires sont des organelles sensorielles, impliquées dans la transduction des signaux et dans la progression du cycle cellulaire. Récemment, une étude approfondie de 13 023 gènes dans le cancer colorectal a révélé que les tumeurs individuelles accumulent une moyenne d'environ 90 gènes mutés. Un de ces gènes potentiels de cancer est la glycylase TTLL3. Notre équipe a testé les deux mutations décrites pour TTLL3 et a pu constaté que chacun d'entre eux conduit à une perte complète de l'activité de cette glycylase in vivo et in vitro. Mon travail vise donc à élucider le rôle de glycylation de protéines dans la signalisation cellulaire et ses conséquences pour la formation du cancer du côlon. J'ai analysé des échantillons provenant de patients par RT-PCR quantitative et j'ai trouvé une diminution des niveaux d'expression de TTLL3 dans les cancers. Les souris TTLL3-knockout ont été soumises à un modèle murin de carcinome du côlon, induit chimiquement à la base de l'azoxyméthane (AOM) et du sulfate de dextran de sodium (DSS). Mes données montrent une formation tumorale élevée dans le groupe TTLL3-KO, ce qui suggère que la perte de la glycylation est liée au développement du cancer du côlon. La glycylation se trouve dans les cils primaires, et les défauts ciliaires ont été décrits dans différents types de tumeurs solides. La présence de cils primaires et l'importance de la glycylation dans le côlon n'étaient pas encore connues au début de mes travaux. Collectivement, mes résultats indiquent que la glycylation est nécessaire, mais pas indispensable pour les cils primaires. Remarquablement, j'ai pu démontrer la présence de cils primaires sur les cellules épithéliales du côlon pour la première fois, et j'ai mis en évidence un défet de ces cils dans les souris TTLL3-KO in vitro et in vivo. Par ailleurs, j'ai démontré que le dysfonctionnement des cils coliques dans les souris KO TTLL3 est associé à une augmentation de l'activité proliférative des cellules épithéliales. Par conséquent, la glycylation pourrait être importante pour la genèse et le fonctionnement des cils primaires. Dans le côlon, l'absence de la glycylase TTLL3 peut entraîner un manque de la glycylation qui favorise la formation de tumeurs. / Tubulin posttranslational modifications are involved in the regulation of many microtubule functions. Glycylation has been related to the stability and maintenance of motile cilia in different organisms including mammals. We had previously shown that some colon-cancer related mutations in the glycylating enzyme TTLL3 lead to a complete loss of enzymatic activity, which brought up a surprising link between this rather cilia-specific tubulin modification and cancer. To evaluate potential role of glycylation in colon carcinoma formation we first confirmed the link between TTLL3 and colon cancer in a greater cohort of patients. We next studied TTLL3-knockout mice, which strikingly did not show any obvious phenotypic alterations or spontaneous cancer development. However, when submitted to a murine model of chemically induced colon carcinoma, TTLL3-knockout mice show a higher level of tumor formation, pointing towards an acceleration of colon cancer development. Because glycylation of microtubules has been specifically detected on ciliary tubulin, we next analysed the presence of primary cilia in colon epithelium. While in most organs and tissues a second glycylating enzyme, TTLL8, is expressed, TTLL3 is the unique enzyme in colon. We found a significantly reduced number of primary cilia in TTLL3-KO colon epithelium, suggesting that similar to motile cilia, primary cilia are maintained by glycylation of the axonemal tubulin. Moreover, we measured a strongly increased mitotic index in colon epithelial cells isolated from TTLL3-KO mice, indicating that his loss of cilia is accompanied by decreased level of cell cycle control. Thus we have demonstrated for the first time a tight link between the posttranslational glycylation of the microtubule cytoskeleton, the control of cell cycle and the acceleration of cancer development.

A combretastatina A4 é um promissor agente anticâncer. Na célula, inibe a polimerização dos microtúbulos, os quais são fundamentais nos processos de motilidade, manutenção estrutural e mitose. Essa inibição se dá a partir do sítio de interação da αβ-tubulina bloqueando o fluxo do sangue que alimenta os tumores, o que resulta na morte dos mesmos. Com estrutura semelhante às combretastatinas, as chalconas constituem uma classe de compostos que atuam no mesmo sítio de interação na tubulina. Baseando-se nos trabalhos experimentais de Ducki e colaboradores, estudou-se a estrutura molecular de 87 chalconas análogas à combretastatina A4 por meio do método quântico DFT com o propósito de desenvolver modelos de Relações Quantitativas Estrutura-Atividade (QSAR) aplicados a tais antagonistas. A partir dos métodos dos Mínimos Quadrados Parciais (PLS) e de Redes Neurais Artificiais (ANN), foram gerados modelos que conduzem à elucidação da relação dos compostos estudados com suas respectivas atividades biológicas. Os descritores eletrônicos e moleculares selecionados apresentam alta concordância com as características das moléculas, havendo predominância de comportamento linear com a atividade biológica, podendo, eventualmente, apresentar comportamento não-linear, o que torna o modelo gerado altamente consistente. / Combretastatin A4 is a promising anticancer agent. It inhibits the polymerization of microtubules in the cell, which are essential in the process of motility, structural maintenance and mitosis. This inhibition is given from the interaction site of αβ-tubulin blocking the blood flow that feeds the tumor, what results in its death. The chalcones, sharing a similar structure of the combretastatin, are also a class of compounds that act in the same site of interaction in the tubulin. Based on the experimental work of Ducki and co-workers, we proposed a molecular structure study of 87 chalcones similar to combretastatin A4 using the DFT method in order to develop Quantitative Structure-Activity Relationships (QSAR) applied to the given antagonists. Through Partial Least Squares (PLS) and Artificial Neural Network (ANN) methods, some models has been generated to lead the understanding on the relationship between the compounds studied and their respective biological activities. The electronic and molecular descriptors selected have high correlation with the molecule features, being linear most of the time, although with eventual non-linear behavior, which makes the generated model highly consistent.

Alzheimer’s disease is the most common form of dementia among older adults, and directly contributes to the third leading cause of death in the United States. Although amyloid plaques and tau-loaded neurofibrillary tangles have been identified as the main pathological features of Alzheimer’s disease for more than one hundred years, the molecular mechanism is still poorly understood and treatments are limited to palliative care. Oligomeric Amyloid beta plays a crucial synaptotoxic role in Alzheimer’s disease, and hyperphosphorylated tau facilitates Amyloid beta toxicity, but the link between the two remains controversial. Since tau is a microtubule associated protein and microtubules are critical for neuronal functions, regulation of dynamic microtubules may serve as the link between Amyloid beta and tau. Here I propose a model in which Amyloid beta can induce changes in MT dynamics in dendrites and axons that are primary to tau hyperphosphorylation, while these MT changes are sufficient to cause tau hyperphosphorylation and necessary for Amyloid beta synaptotoxicity through tau. My thesis work further characterizes mammalian excitatory presynaptic boutons as hotspots for activity-dependent dynamic microtubule nucleation that is required for synaptic transmission during neuronal activation or Amyloid beta-induced neuronal injury through tau.

Chromosome alignment is highly conserved in all eukaryotic cell divisions. Microtubule (MT) -based forces generated by the mitotic spindle are integral for proper chromosome alignment and equal chromosome segregation. The kinetochore is a multi-subunit protein complex that assembles on centromeric regions of chromosomes. Kinetochores tether chromosomes to MTs (K fibers) that emanate from opposite poles, in a process called biorientation. This linkage translates K fiber dynamics into chromosome movements during alignment and segregation. Stable, high-affinity kinetochore attachments promote spindle assembly checkpoint (SAC) silencing, which is active when unattached kinetochores are present. During chromosome alignment, 1) K fiber plus-end dynamics decrease, confining chromosome movements near the spindle equator, and 2) electrostatic interactions between kinetochore proteins and MTs increase. Chromosome segregation occurs as soon as all chromosomes are stably attached to microtubules and the SAC has been silenced. SAC silencing and chromosome alignment are temporally coordinated during normal divisions, implying that the mechanisms regulating K fiber dynamics and kinetochore affinity must be linked. Interestingly, HeLa cells depleted of a kinesin-8 motor Kif18A, known for its role in promoting chromosome alignment, display a SAC-dependent mitotic delay due to kinetochore-MT attachment defects. This is puzzling, as Kif18A's function in chromosome alignment is to suppress MT growth by stably associating with MT plus-ends. Whether Kif18A is required for attachment in all cells and how it promotes kinetochore microtubule linkages are not understood. The work presented in this dissertation supports a model in which Kif18A functions as a molecular link that coordinates chromosome alignment and anaphase onset. We find that Kif18A is required to stabilize kinetochore-MT attachments during mammalian germline development, as germline precursor cells in Kif18A mutant mice are unable to divide during embryogenesis due to an active SAC. However, while all cell types require functional Kif18A for chromosome alignment, mouse primary somatic cells can still divide with normal timing. This finding indicates a cell-type specific dependence on Kif18A for stabilizing kinetochore-MT attachments, and provides evidence that this function might be separate from Kif18A's known role in chromosome alignment. Consistent with this idea, we find that an evolutionarily conserved binding motif for protein phosphatase 1 (PP1) is required for Kif18A's novel role in regulating kinetochore microtubule attachments. Kif18A-PP1 interaction is required for Kif18A-mediated dephosphorylation of the kinetochore protein Hec1, which enhances attachment. However, Kif18A's interaction with PP1 is dispensable for chromosome alignment. Thus, point mutations that disrupt PP1 binding separate Kif18A's role in stabilizing kinetochore attachments from its function in promoting chromosome alignment. Additionally, through structure function studies of the motor domain, we identified a long surface loop (Loop2) that is required for Kif18A's unique MT plus-end binding activity, which is essential for its function in confining chromosome movements. Taken together, we find that Kif18A is molecularly tuned to provide temporal control of chromosome alignment and anaphase entry.

Dans les neurones, la stabilité des microtubules est induite par leur association avec deux protéines associées aux micotubules, les protéines E- et N-STOP (Early and adult neuronal Stable Tubule Only Polypeptide). L'invalidation du gène stop chez la souris entraîne des défauts de la transmission synaptique associée à une réduction du nombre de vésicules synaptiques. <br />Les neurones matures contiennent également une protéine apparentée à la protéine N-STOP, la protéine SL21 (STOP like protein of 21 kDa) qui possède deux zones homologues aux protéines STOPs : un domaine homologue au domaine de liaison et de stabilisation des microtubules et une région de 35 acides aminés située à l'extrémité amino-terminale. Cette protéine se localise à la fois au niveau de l'appareil de Golgi et des microtubules.<br />La première partie de ce travail est consacrée à la caractérisation fonctionnelle du domaine amino-terminal. Il contient 3 résidus cystéines en position 5, 10 et 11 qui peuvent être palmitoylée (modification permettant l'association des protéines aux membranes). Nous avons montré que les cystéines 5 et 11 de SL21 sont palmitoylables mais que seule la cystéine 5 est suffisante et nécessaire pour localiser SL21 au niveau de l'appareil de Golgi. Nous avons également mis en évidence que la protéine STOP, en plus d'être localisée aux microtubules, s'associe également au Golgi par l'intermédiaire de son domaine amino-terminal homologue à SL21 et qu'elle est aussi palmitoylable.<br />Dans la deuxième partie de ce travail, pour mieux comprendre la fonction de SL21, nous nous sommes intéressées aux partenaires de SL21. Un criblage ciblé en Double-Hybride, utilisant comme protéines cibles des protéines connues comme étant des partenaires de STOP, a été réalisé au laboratoire. Trois partenaires potentiels ont été mis en évidence : la protéine Tctex1, une des chaînes légère du moteur moléculaire dynéine. Nous avons confirmé l'interaction de ces protéines avec SL21 par co-immunoprécipitation après surexpression dans les cellules et aussi, à partir d'un extrait de cerveau pour l'interaction de SL21 et de STOP. Nous avons également déterminé leur site d'interaction au niveau de SL21. La protéine Tctex1 interagit avec SL21 au niveau de son module de liaison aux microtubules, le site de multimérisation de SL21 se localise au niveau du domaine amino-terminal, pouvant impliquer la palmitoylation de ces protéines. <br />L'ensemble de ces résultats permet d'envisager un rôle des protéines STOPs au niveau de la régulation de la relation microtubule-membrane des vésicules synaptique au sein de la synapse

L'accumulation du peptide amyloïde Aβ semble être le facteurs décisif dans la<br />physiopathologie de la maladie d'Alzheimer.<br />Au cours de ce travail, nous avons montré différents effets de ces peptides.<br />Nous avons montré les effets de différents types de peptides amyloïdes sur les<br />courants calciques des neurones de l'hippocampe. Ainsi, l'Aβ(25-35) augmente les courants<br />calciques de type L alors que l'Aβ(1-40) ceux de types non-L.<br />Ensuite, l'application de peptide Aβ diminue les courants postsynaptiques excitateurs<br />évoqués mais également des courants miniatures spontanés. Ces diminutions seraient dues à<br />une internalisation des récepteurs AMPA et impliquent des processus inflammatoires et<br />l'activation de voies de transduction.<br />Enfin, lors de l'apoptose neuronale induite par le peptide amyloïde la β-tubuline de<br />classe III est exclue des microtubules et forme des agrégats cytoplasmiques. Ces effets ne sont<br />pas dus à des changements dans les modifications post-traductionnelles de la tubuline.

Les microtubules jouent un rôle central dans l'organisation et la vie cellulaire. L'assemblage des microtubules présente des comportements non linéaires et mal compris comme l'instabilité dynamique. Nous avons voulu déterminer les paramètres limitant la réaction d'assemblage des microtubules, puis isoler des effecteurs de cette réaction. Des études cinétiques ont été réalisées dans des conditions expérimentales simples où tous les paramètres de la réaction ont été mesurés. D'après nos résultats, la nucléation des microtubules se produirait en deux étapes : formation rapide et irréversible d'oligomères de tubuline puis assemblage de ces oligomères en microtubules. La vitesse d'élongation des microtubules est indépendante de la concentration en tubuline-GTP : cette vitesse d'élongation est sans doute limitée par les propriétés structurales des microtubules. Enfin, le désassemblage des microtubules se produirait par catastrophes et serait stimulé par des oligomères de tubuline se formant au cours de la réaction. Dans une seconde partie, nous avons produit des oligomères de tubuline stimulant la nucléation des microtubules par pontage covalent modéré des microtubules. Ces oligomères sont constitués par assemblage latéral de 10 dimères de tubuline et s'agrègent par quatre pour former un microtubule. Les microtubules formés dans nos conditions en présence d'oligomères de nucléation ne désassemblent pas spontanément : ces conditions permettront de rechercher des facteurs de catastrophe. Enfin, nous avons développé une procédure chromatographique pour isoler des protéines liant la tubuline. Les partenaires de la tubuline sont isolés à l'état natif et se prêtent à des tests fonctionnels. L'utilisation des techniques de cartographie peptidique a permis d'identifier les protéines par spectrométrie de masse. Nous avons ainsi isolé des protéines connues pour contrôler la dynamique des microtubules, mais d'autres, inconnues restent à étudier.

Understanding the role of microtubule-associated proteins is the key to understand the complex mechanisms regulating microtubule dynamics. This study employs the model system Dictyostelium discoideum to elucidate the role of the microtubule-associated protein TACC (Transforming acidic coiled-coil) in promoting microtubule growth and stability. Dictyostelium TACC was localized at the centrosome throughout the entire cell cycle. The protein was also detected at microtubule plus ends, however, unexpectedly only during interphase but not during mitosis. The same cell cycle-dependent localization pattern was observed for CP224, the Dictyostelium XMAP215 homologue. These ubiquitous MAPs have been found to interact with TACC proteins directly and are known to act as microtubule polymerases and nucleators. This work shows for the first time in vivo that both a TACC and XMAP215 family protein can differentially localize to microtubule plus ends during interphase and mitosis. RNAi knockdown mutants revealed that TACC promotes microtubule growth during interphase and is essential for proper formation of astral microtubules in mitosis. In many organisms, impaired microtubule stability upon TACC depletion was explained by the failure to efficiently recruit the TACC-binding XMAP215 protein to centrosomes or spindle poles. By contrast, fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) analyses conducted in this study demonstrate that in Dictyostelium recruitment of CP224 to centrosomes or spindle poles is not perturbed in the absence of TACC. Instead, CP224 could no longer be detected at the tips of microtubules in TACC mutant cells. This finding demonstrates for the first time in vivo that a TACC protein is essential for the association of an XMAP215 protein with microtubule plus ends. The GFP-TACC strains generated in this work also turned out to be a valuable tool to study the unusual microtubule dynamics in Dictyostelium. Here, microtubules exhibit a high degree of lateral bending movements but, in contrast most other organisms, they do not obviously undergo any growth or shrinkage events during interphase. Despite of that they are affected by microtubuledepolymerizing drugs such as thiabendazole or nocodazol which are thought to act solely on dynamic microtubules. Employing 5D-fluorescence live cell microscopy and FRAP analyses this study suggests Dictyostelium microtubules to be dynamic only in the periphery, while they are stable at the centrosome. In the recent years, the identification of yet unknown components of the Dictyostelium centrosome has made tremendous progress. A proteomic approach previously conducted by our group disclosed several uncharacterized candidate proteins, which remained to be verified as genuine centrosomal components. The second part of this study focuses on the investigation of three such candidate proteins, Cenp68, CP103 and the putative spindle assembly checkpoint protein Mad1. While a GFP-CP103 fusion protein could clearly be localized to isolated centrosomes that are free of microtubules, Cenp68 and Mad1 were found to associate with the centromeres and kinetochores, respectively. The investigation of Cenp68 included the generation of a polyclonal anti-Cenp68 antibody, the screening for interacting proteins and the generation of knockout mutants which, however, did not display any obvious phenotype. Yet, Cenp68 has turned out as a very useful marker to study centromere dynamics during the entire cell cycle. During mitosis, GFP-Mad1 localization strongly resembled the behavior of other Mad1 proteins, suggesting the existence of a yet uncharacterized spindle assembly checkpoint in Dictyostelium. / Die Kenntnis der Funktion von Mikrotubuli-assoziierenden Proteinen (MAPs) ist von grundlegender Bedeutung für das Verständnis der Mikrotubuli-Dynamik und deren Regulation. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Rolle des Mikrotubuli-assoziierenden Proteins TACC (Transforming acidic coiled-coil), welches in vielen Organismen an der Stabilisierung und dem Wachstum von Mikrotubuli beteiligt ist, im Modellorganismus Dictyostelium discoideum untersucht. Das Dictyostelium TACC Protein konnte während des gesamten Zellzyklus am Centrosom nachgewiesen werden. Darüber hinaus wurde es an den Mikrotubuli-Plus-Enden vorgefunden, überraschenderweise jedoch ausschließlich während der Interphase. Die gleiche Zellzyklusabhängige Lokalisation wurde für CP224 beobachtet, einem Homologen der XMAP215 Proteine in Dictyostelium. Diese ubiquitären MAPs sind konservierte, direkte Interaktionspartner der TACC Proteine und spielen eine zentrale Rolle bei der Nukleation und der Polymerisation von Mikrotubuli. Durch diese Arbeit konnte erstmals in vivo gezeigt werden, dass TACC und XMAP215 Proteine während der Interphase und Mitose unterschiedlich stark mit Mikrotubuli-Plus-Enden assoziiert sein können. Durch Untersuchungen an Knockdown-Mutanten wurde ersichtlich, dass Dictyostelium TACC eine Rolle beim Mikrotubuli-Wachstum während der Interphase spielt und über weite Strecken der Mitose essentiell für die Ausbildung von astralen Mikrotubuli ist. In anderen Organismen konnte als Ursache instabiler Mikrotubuli in TACC Mutanten häufig unzureichendes Rekrutieren des jeweiligen XMAP215 Proteins an das Centrosom ausgemacht werden. Um entsprechende Auswirkungen auf die Lokalisation von CP224 durch den Knockdown von TACC in Dictyostelium zu untersuchen, wurden Fluorescence Recovery after Photobleaching (FRAP) Experimente durchgeführt. Diese ergaben, dass CP224 auch in Abwesenheit von TACC in vollem Umfang an die Centrosomen und Spindelpole rekrutiert wird. Anders als im Wildtyp, konnte in TACC Mutanten allerdings kein CP224 an den Mikrotubuli-Plus-Enden nachgewiesen werden. Somit konnte erstmals in vivo gezeigt werden, dass ein TACC Protein essentiell für die Assoziation eines XMAP215 Proteins mit den Mikrotubuli-Plus-Enden ist. Im Laufe der genannten Experimente stellte sich heraus, dass sich die GFP-TACC Stämme aufgrund ihrer markierten Plus-Enden sehr gut für Untersuchungen zur ungewöhnlichen Mikrotubuli-Dynamik in Dictyostelium eignen. Zwar weisen Mikrotubuli hier über die gesamte Länge ausgeprägte Krümmungs- und Seitwärtsbewegungen auf, es können jedoch im Vergleich zu anderen Organismen während der Interphase kaum Wachstums- oder Verkürzungsvorgänge beobachtet werden. Dennoch können Dictyostelium Mikrotubuli unter Verwendung von Agenzien wie Thiabendazol oder Nocodazol, welche ausschließlich auf dynamische Mikrotubuli wirken, signifikant verkürzt werden. Durch FRAP Experimente und Einsatz von 5D Fluoreszenz-Mikroskopie an lebenden Zellen konnte in dieser Arbeit erstmalig nachgewiesen werden, dass Dictyostelium Mikrotubuli nur in der Zellperipherie, nicht aber im pericentrosomalen Bereich dynamisch sind. Die Identifikation bislang unbekannter Bestandteile des Dictyostelium Centrosoms erfuhr in den vergangenen Jahren große Fortschritte. Ein von unserer Gruppe durchgeführter Proteomics-Ansatz brachte eine Vielzahl potentiell centrosomaler Proteine zu Tage, von welchen bereits viele am Centrosom nachgewiesen werden konnten. Der zweite Teil dieser Arbeit befasst sich mit der Charakterisierung dreier noch unbekannter Proteine aus dem Proteomics-Ansatz, Cenp68, CP103 und dem Dictyostelium Homologen des Spindle Assembly Checkpunkt Proteins Mad1. Hierbei zeigte sich, dass lediglich CP103 Bestandteil isolierter, Mikrotubuli-freier Centrosomen ist, während Cenp68 an die Centromere und Mad1 an die Kinetochoren lokalisieren. Die Charakterisierung von Cenp68 umfasste außerdem die Herstellung eines polyklonalen anti-Cenp68 Antikörpers, das Suchen nach Interaktionspartnern und die Erzeugung eines Cenp68 Knockout-Stammes. Letzterer wies jedoch keinen offensichtlichen Phänotyp auf. Das Verhalten des Dictyostelium Mad1 Proteins während der Mitose stimmte in großen Teilen mit dem anderer Mad1 Proteine überein, was auf die Existenz eines bislang unerforschten Spindle Assembly Chekpunkts in Dictyostelium hinweisen könnte.