Alzheimers sjukdom (AD) är den vanligaste demenssjukdomen, med 60-80 % utav alla kliniska diagnoser, där hög ålder och ärftlighet är riskfaktorer för att drabbas. I Sverige har ca 100 000 diagnosen AD. AD karaktäriseras av kognitiva störningar som t.ex. minnesdefekter, där β-amyloida (Aβ)-plack och tau-protein är två viktiga biomarkörer. Godkända terapier är endast symtomlindrande och delas in i läkemedelsklasserna kolinesterashämmare och N-metyl-D-aspartat (NMDA)-glutamatreceptorantagonister. Dagens forskning riktas bl.a. gentemot antikroppar mot Aβ-plack och vaccin mot tau-protein, dock hittills utan framgång. Mikroglia har en immunologisk roll i centrala nervsystemet (CNS) och kan ändra fenotyp för att bibehålla homeostas i CNS. Men vid en långvarig och okontrollerad aktivering av mikroglia sker en kronisk syntetisering av cytokiner och proinflammatoriska mediatorer vilket kan resultera i neuroinflammation, ett karaktäristiskt fynd vid AD. Flertalet riskgener som associerats med AD påverkar och uttrycks i mikroglia, t.ex. gener som kodar för NOD-like receptor family pyrin domain containing 3 (NLRP3), komplementreceptor 3 (CR3), triggering receptor expressed on myeloid cells 2 (TREM2), apolipoprotein E (APOE) och CX3C kemokinreceptor 1 (CX3CR1).  Syftet med följande litteraturarbete var att besvara frågan om mikroglia som läkemedelsmål kan vara lösningen på att förebygga och bromsa progressionen av AD. Frågeställningen har försökts att besvaras med aktuella vetenskapliga artiklar inom ämnet, hämtade från sökdatabasen PubMed. De första fyra studierna (I-IV) användes för att besvara hur mikroglia som läkemedelsmål kan vara relaterat till AD. Resultatet tyder på och identifierade riskgener, t.ex. APOE och CD33, vilka kunde relateras till AD. Inhibering av nikotinamid-adenin-dinukleotidfosfat (NADPH) oxidas 2 (Nox2) och CX3CR1, uttrycka i mikroglia, påvisades vara relaterade till reglering av den dysfunktionella mikroglian och upprensandet av Aβ-plack. Ökad aktivitet av TLQP-21, en VGF-inducerad ligand till komplementkomponent 3a receptor 1 (C3aR1), reducerade mikroglias neuropatologiska fenotyp. Studie V och VI användes för att besvara hur ett läkemedel med mikroglia som läkemedelsmål skulle kunna se ut. Aminosyran glycin tycks kunna stödja en dysfunktionell mikroglia. Nanopartiklar (NP) med olika aktiva substanser, gav en synergistisk effekt genom att modulera mikroglia och rensa upp Aβ-plack. Slutsatsen är att mikroglia är direkt relaterat till AD med flertalet gener och olika vägar som påverkar den dysfunktionella mikroglian och tillåter sjukdomsprogressionen. Det finns läkemedelsstrategier för att nå mikroglia, som t.ex. kroppsegna substanser med välkänd effekt och NPs innehållandes flera modulerande substanser. Idag finns det inget svar på vilken/vilka av ovannämnda strategier som skulle kunna stoppa eller bromsa AD-progressionen, men det finns en förhoppning att finna läkemedelsmålet i eller riktat mot mikroglia. / Alzheimer's disease (AD) is the most common form of dementia, with 60-80 % of all clinical diagnoses, with high age and heredity as well-known risk factors. In Sweden there are approximately 100 000 people diagnosed with AD. AD is characterized by changes in cognitive abilities like memory problems, with β-amyloid (Aβ)-plaque and tau protein acting as two important biomarkers. Today's approved therapeutics are only symptom-relieving and is categorized in colinesterase inhibitors and N-methyl-D-aspartate (NMDA)-glutamate receptor antagonists. Clinical trials and studies on AD are today aimed to study antibodies against Aβ-plaque and tau protein though, without success so far.  Microglia has an immunological role in the central nervous system (CNS) and change its phenotype to keep homeostasis in the CNS. When microglia undergo a persistent and uncontrolled activation, a chronic synthesis of cytokines and proinflammatory mediators starts and results in neuroinflammation, a characteristic finding in AD. Many risk genes that have been identified in AD affects and has shown to be expressed in microglia, like for example NOD-like receptor family pyrin domain containing 3 (NLRP3), complement receptor 3 (CR3), triggering receptor expressed on myeloid cells 2 (TREM2), apolipoprotein E (APOE) and CX3C chemokine receptor 1 (CX3CR1).  The purpose of the present literature work was to answer if microglia as a drug target can be the solution to prevent and delay the progression of AD. Six scientific articles were analyzed and selected from the database PubMed. Four articles were used to answer how microglia as a drug target is related to AD. Directly related risk genes for the development of AD could be identified, for example APOE and CD33. Inhibition of nicotinamide-adenine dinucleotide phosphate (NADPH) oxidase 2 (Nox2) and CX3CR1 where shown to be directly related to the regulation of the dysfunctional microglia and to the deletion of Aβ-plaque. Increased activity of TLQP-21, a VGF-derived ligand to complement component 3a receptor 1 (C3aR1), reduced microglias neuropathological phenotype. Two articles was used to answer how a drug could look like, with microglia as a drug target. The amino acid glycine probably support the dysfunctionally microglia and may be useful in drug development. Nanoparticle (NP) encapsuling different active substances, exhibited a synergistic effect: able to modulate microglia and delete Aβ-plaque. The conclusion that could be drawn from this work is that microglial cells are directly realted to AD. The are AD-related genes and different signaling pathways, which affects the dysfunctionally microglia and allows the progression of AD to continue. The are interesting strategies to develop a drug with microglia as a drug target, for example to use endogenous substances to get a synergistic effect. Today there are no answers to which of the pathways that may stop or delay the progression of AD, but there is good expectancy to find the drug target in microglia.

Die Mikroglia entspricht in ihrer Gesamtpopulation und Funktion den ortsansässigen Makrophagen des zentralen Nervensystems. Sie nehmen sowohl in der Neuroinflammation und -degeneration als auch bei der Entwicklung und Erhaltung der neuronalen Funktion eine wichtige Rolle ein. Entwicklungsgeschichtlich stammen die Mikroglia, im Gegensatz zu anderen Makrophagen, wohl mehrheitlich von primitiven Dottersackmakrophage ab, welche in der frühen embryonalen Entwicklung in das zentrale Nervensystem immigrieren und dort zur endgültigen Mikrogliapopulation differenzieren. Dieses Konzept basiert vor allem auf den Arbeiten von Ginhoux et al. und Schulze et al. In diesen Arbeiten, die auf sogenannten Fate-Mapping-Experimenten basieren, kann die Abstammung der Mikroglia von Dottersackmakrophagen zwar demonstriert, der Einfluss anderer Vorläuferzellen jedoch nicht vollständig ausgeschlossen werden. Um den Einfluss einer nicht aus dem Dottersack stammenden Zelllinie auf die adulte Mikroglia zu untersuchen, nutzten wir daher Mäuse mit einem homozygoten knock-out der RNS Endoribonuklease Dicer, welche an die Expression von Vav1 gebunden ist. Der Vav1-Lokus wird exklusiv in hämatopoetischen Zellen aktiviert und dies zu einem Zeitpunkt, an dem die Rekrutierung der Mikroglia aus den Dottersackmakrophagen bereits vollständig abgeschlossen ist. Verglichen wurden daher in der vorgelegten Arbeit Vav1-Cre+:dicer knock-out Mäuse mit den entsprechenden Wildtyp Geschwistertieren zu prä- und postnatalen Zeitpunkten hinsichtlich der Anzahl an Iba-1 positiven Zellen. In makroskopischer Betrachtung konnten keine wesentlichen Unterschiede zwischen den Tieren beobachtet werden. Die Mäuse sind von vergleichbarem Gewicht und Größe. Im Erscheinungsbild zu postnatalen Zeitpunkten imponieren die knock-out Mäuse jedoch blass. Entsprechend hierzu stellt sich das Knochenmark mit deutlicher fibröser Involution dar, was in Blutuntersuchung als eine Panzytopenie der kock-out Mäuse diagnostiziert werden kann. Ein Umstand, der durch den Dicer knock-out in hämatopoetischen Zellen zu erwarten war. In lichtmikroskopischen Schnitten stellte sich die Gewebearchitektur des zentralen Nervensystems vergleichbar dar. In immunhistochemischen Färbung der Mikroglia mit Iba-1 als spezifisches Zielgen waren Form und Verteilung zwischen den Mäusen zwar vergleichbar, jedoch war die Anzahl an Mikroglia in den knock-out Tieren zum Zeitpunkt P1 um rund 40% vermindert. Es konnte ausgeschlossen werden, dass dies durch unterschiedliche Proliferation oder Apoptose der Mikroglia erklärt werden kann. Eine Zeitreihe mit den Zeitpunkten E16.8, E18.5, P0 und P1 konnte aufzeigen, dass sich bis einschließlich P0 kein Unterschied in der absoluten Mikrogliaanzahl zwischen Wildtyp und knock-out Mäusen festzustellen war. Untersucht wurden pro Zeitpunkt und Maus je vier Areale (Hippocampus, Mesencephalon, genu corporis callosi und ventrale hippocampale Kommissur). Ferner konnte gezeigt werden, dass die Mikroglia in den knock-out Mäusen die Mikroglia typischen Marker F4/80 und PU.1 exprimieren. Schlussendlich demonstriert die vorgelegte Arbeit, dass Störungen der definitiven Hämatopoese einen Einfluss auf die Mikrogliapopulation haben, was gegen die Annahme einer exklusiven Rekrutierung aller Mikroglia von Dottersackmakrophagen spricht.

Nach Angaben der WHO hat sich die Prävalenz von Adipositas seit 1975 nahezu verdreifacht, wofür neben der genetischen Disposition Sozial- und Umweltfaktoren wie die Kombination aus gesteigerter Fettaufnahme über die Nahrung sowie eine Abnahme der körperlichen Aktivität verantwortlich sind. Der Verzehr einer fettreichen Nahrung und Adipositas sind mit zahlreichen Krankheiten wie Herz-Kreislauf-Erkrankungen, Krebs, Störungen des Glukosestoffwechsels und Typ-2-Diabetes verbunden. Darüber hinaus geht eine ernährungsbedingte Adipositas mit kognitiven Defiziten und einem erhöhten Risiko für neurodegenerative Erkrankungen, einschließlich der Alzheimer-Krankheit, einher, indem Entzündungen im Gehirn verstärkt und die Gehirnalterung beschleunigt werden. Der westliche Lebensstil und die ernährungsbedingte Adipositas beeinflussen zudem den funktionalen und morphologischen Phänotyp von Mikrogliazellen. Mikroglia sind immunkompetente Makrophagen des ZNS, die das Hirnparenchym fortlaufend mit ihren mobilen Zellfortsätzen auf Gewebeschäden, Infektionen oder homöostatische Störungen hin überwachen. Indem sie Krankheitserreger, apoptotische Zellen, synaptische Überreste, Toxine und Myelintrümmer aufnehmen, tragen Mikrogliazellen entscheidend zur Homöostase, Plastizität und zum Lernen bei. Die auffällige morphologische Plastizität der Mikroglia ist eine herausragende Eigenschaft dieser Zellen und die Kategorisierung der Funktion von Mikrogliazellen auf Grundlage der Morphologie ist gut etabliert. Häufig wird eine automatische Klassifizierung der morphologischen Phänotypen von Mikrogliazellen anhand quantitativer Parameter vorgenommen. Diese Ansätze sind allerdings auf einige wenige und vor allem manuell ausgewählte Kriterien beschränkt, was das Risiko eines Selektionsbias birgt und die resultierenden Klassifizierungen beeinträchtigen kann. Im ersten Teil dieser Arbeit wurden Mikroglia mit Hilfe eines maschinellen Lernansatzes vier morphologischen Kategorien (verzweigt, stäbchenförmig, aktiviert, amöboid) zugeordnet. Hierfür wurde ein neuronales Faltungsnetzwerk (Convolutional Neural Network (CNN)) mit manuell ausgewählten Mikrogliazellen im Hippocampus und Kortex verschiedener Mausstämme (C57BL/6J-, db/db- und db/+-Mäuse) angewendet. Die entwickelte Methode zur Klassifizierung mikroglialer morphologischer Phänotypen wurde in einem Mausmodell des ischämischen Schlaganfalls, bei dem nachgewiesenermaßen Mikrogliazellen in den betroffenen Hirnregionen aktiviert sind, überprüft und bestätigt. Die vom ischämischen Schlaganfall betroffenen Areale im Hippocampus und Neokortex wiesen mehr aktivierte und stäbchenförmige Mikrogliazellen und folglich weniger verzweigte Mikroglia auf als die relevanten Hirnareale der kontralateralen Hemisphäre. Bereits kleine morphologische Unterschiede in Mikrogliazellen sind mit Hilfe eines CNNs nachweisbar und können auf eine beginnende Veränderung des Aktivierungszustands von Mikrogliazellen und damit auf pathologische Prozesse im Gehirn hinweisen. Im Gegensatz zur konventionellen parameterbasierten Klassifizierung, bei der vor Einteilung der Zellen in morphologische Klassen ausgewählte Parameter berechnet werden müssen, erfordert die auf einem CNN basierende Klassifizierung keine Parameter oder eine Kombination von diesen, sondern lediglich Bildausschnitte einzelner Zellen. Beim Vergleich beider Klassifizierungsmethoden wurde deutlich, dass sich die Festlegung geeigneter Parameterkombinationen und Schwellenwerte als schwierig gestaltet, da es teils sehr große Überlappungen von Parameterwerten zwischen den einzelnen Klassen gibt. Damit bietet die CNN-Klassifizierung, die sich ausschließlich auf den morphologischen Phänotyp stützt, eine leistungsstarke Alternative zur parameterbasierten Klassifizierung. Im zweiten Teil der Arbeit wurden die Auswirkungen einer langfristigen fettreichen Ernährung auf Verhaltensmerkmale, Mikroglia und Neuronen bei Mäusen und etwaige reversible Effekte nach einer Ernährungsumstellung untersucht. Hierfür wurden 8 Wochen alte männliche C57BL/6J-Mäuse genutzt, bei denen für 24 Wochen eine normale Diät (11 kcal% Fett), eine fettreiche Diät (59 kcal% Fett) oder ein Ernährungswechsel durchgeführt wurde. Die Folgen der ernährungsbedingten Adipositas und der Ernährungsumstellung für den allgemeinen Gesundheitszustand, die sensorischen und motorischen Fähigkeiten, das Lernen sowie das Gedächtnis wurden anhand eines angepassten Protokolls zur Bewertung des Phänotyps sowie unter Verwendung von Y-Maze-, Morris-Water-Maze- und Tail-Suspension-Tests untersucht. Neuronen und Mikroglia wurden im mediobasalen Hypothalamus, im Hippocampus und im frontalen motorischen Kortex nach einer langfristigen fettreichen Ernährung sowie einer anschließenden Ernährungsumstellung histologisch analysiert. Eine gesteigerte mikrogliale Reaktion (erhöhte Iba1-Fluoreszenzintensität, gesteigerter Anteil der Iba1-gefärbten Fläche und höhere Genexpression von Iba1) auf eine 24-wöchige fettreiche Ernährung war auf den Hypothalamus begrenzt und bestätigte vorangegangene Studien. Die detaillierte quantitative Analyse der mikroglialen Morphologie unter Verwendung des im ersten Teil dieser Arbeit beschriebenen und für Fluoreszenzaufnahmen angepassten Ansatzes zeigte bei Mikrogliazellen im Kortex und Hippocampus adipöser Mäuse keine Veränderungen in relevanten morphologischen Parametern. Eine Vergrößerung von Zell- und Somafläche oder eine verringerte Länge der Fortsätze der Mikrogliazellen hätte z. B. auf einen aktivierten morphologischen Phänotyp hingedeutet. In keiner der drei analysierten Hirnregionen wurden dystrophe Mikrogliazellen, eine Neurodegeneration oder eine Anhäufung intrazellulärer Lipidtröpfchen, wie in der Leber untersucht und nachgewiesen, beobachtet. Eine fettreiche Ernährung für 24 Wochen führte zu allgemeinen Gesundheitsproblemen in Form von Fellveränderungen (struppiges Fell mit kahlen Stellen) und Vibrissenverlust. Sensorische oder motorische Fähigkeiten und der emotionale Zustand (z. B. Motivation) adipöser Mäuse waren nicht eingeschränkt verglichen mit altersentsprechenden Kontrollmäusen (normale Ernährung oder kürzere Zeit auf fettreicher Ernährung mit anschließender Ernährungsumstellung). Dadurch konnte ausgeschlossen werden, dass die Motivation oder Leistung in den weiteren Verhaltenstests durch Veränderungen des emotionalen Zustands, schwere motorische Probleme oder eingeschränkte Reflexe beeinflusst wurde. Das Kurz- und Langzeitgedächtnis der Versuchstiere war durch eine lang anhaltende fettreiche Ernährung nicht beeinträchtigt. Mäuse, denen für längere Zeit eine fettreiche Ernährung verabreicht wurde, hielten allerdings im Vergleich zu Kontrolltieren beim Morris-Water- Maze-Test an ihrer alten Suchstrategie fest, indem sie den alten, bekannten Standort der Plattform bevorzugten, anstatt andere Quadranten zu überprüfen. Die ernährungsbedingte Adipositas hatte demzufolge bei Mäusen dieser Studie, die ab einem Alter von 8 Wochen eine fettreiche Ernährung erhielten, zwar keine Defizite beim Lernen und Langzeitgedächtnis zur Folge, könnte aber die kognitive Flexibilität beeinflusst haben. Mäuse profitierten erwartungsgemäß hinsichtlich ihres Gewichts von einer Ernährungsumstellung auf eine normale Diät. Eine morphologische Aktivierung mikroglialer Zellen im mediobasalen Hypothamus, wie nach 24 Wochen fettreicher Diät beobachtet, wurde bei Mäusen, die nach einer 24-wöchigen fettreichen Ernährung auf eine normale Ernährung für 4 Wochen umgestellt wurden, nicht beobachtet und war demnach reversibel. Zusammenfassend wurde festgestellt, dass lange Zeiträume mit übermäßigem Fett in der Nahrung allein keine Lerndefizite oder Beeinträchtigungen des räumlichen Gedächtnisses verursachen, obwohl eine ernährungsbedingte Adipositas nachteilige Folgen für die kognitive Flexibilität haben kann und Mäuse von einer Ernährungsumstellung profitieren. Keine Defizite im Kurz- und Lachzeitgedächtnis nach einer langfristigen fettreichen Ernährung stehen nicht im Einklang mit Ergebnissen anderer Studien, was auf unterschiedliche Diäten, abweichendes Alter der Mäuse oder Überinterpretation zurückzuführen sein könnte. Insbesondere die Art der Nahrung sowie die genaue Zusammensetzung des Futters sind entscheidend für die Interpretation von Daten und somit für die therapeutischen Konsequenzen für Stoffwechselerkrankungen und kognitive Störungen. Zum besseren Verständnis des Zusammenhangs unterschiedlicher Risikofaktoren für neurodegenerative Erkrankungen wie M. Alzheimer und zur Untersuchung der zugrunde liegenden Mechanismen im Mausmodell ist es nach Betrachtung der aktuellen Studienlage notwendig, den Fokus auf die Futterzusammensetzung und das Alter bei Beginn der Fütterungsstudie zu legen.:1. Einleitung 3 1.1 Mikroglia 3 1.1.1 Funktion der Mikroglia 3 1.1.2 Morphologie der Mikroglia 5 1.1.3 Darstellung der Mikroglia mit Iba1 7 1.2 Automatisierte Klassifizierung und Quantifizierung mikroglialer morphologischer Phänotypen 7 1.3 Verhaltensphänotypisierung von Mäusen 8 1.4 Morbus Alzheimer 9 1.5 Adipositas 10 1.5.1 Mikrogliale Reaktion auf fettreiche Ernährung und Adipositas 11 1.5.2 Adipositas als Risiko für M. Alzheimer 13 1.5.3 Mausmodelle für Adipositas 14 2. Fragestellungen 16 3. Publikationen 17 3.1 Classification of Microglial Morphological Phenotypes Using Machine Learning 17 3.2 Long-term diet-induced obesity does not lead to learning and memory impairment in adult mice 39 4. Zusammenfassung 81 5. Literaturverzeichnis 85 6. Darstellung des eigenen wissenschaftlichen Beitrags 97 7. Erklärung über die eigenständige Abfassung der Arbeit 99 8. Lebenslauf 100 9. Publikationsliste 101 10. Danksagung 102

Die vorliegende Arbeit beinhaltet experimentelle Untersuchungen zur neuroprotektiven Wirkung des körpereigenen Lipids L-alpha-Lysophosphatidylinositol (LPI). Die Vermittlung dieser Wirkung soll durch den zentralnervös exprimierten G-Protein-gekoppelten Rezeptor 55 (GPR55) erfolgen. Als Modelsystem diente die organotypische hippocampale Schnittkultur (OHSC) der Ratte, welche exzitotoxisch mittels N-Methyl-D-Aspartat (NMDA) geschädigt wurde, um Neurodegeneration zu initiieren. Die Inkubation mit LPI nach NMDA-Schädigung reduzierte die Anzahl toter Neurone und die der Mikroglia in der Körnerzellschicht des Gyrus dentatus. Ein Clodronat-induzierter Verlust der Mikroglia und die siRNA-vermittelte Herabregulation von Gpr55 hoben jeweils den neuroprotektiven Effekt von LPI in der OHSC auf. Diese Beobachtungen wiesen auf eine Mikroglia- und GPR55 abhängige Neuroprotektion hin. LPI wirkte zudem synergistisch und verstärkte die (bekannter Maßen) durch Cannabinoide induzierte und über den Cannabinoid Typ 1 Rezeptor vermittelte Neuroprotektion. Ferner wurde Gpr55 mittels qPCR in Mikroglia und Astrozyten nachgewiesen. LPI steuerte außerdem die Expression von Gpr55 in Mikroglia und beeinflusste deren Migrationsverhalten. Die vorliegenden Ergebnisse machen deutlich, dass LPI in einem in vitro Modellsystem zur Untersuchung des sekundären neuronalen Schadens protektiv wirkt und für die Vermittlung dieser Neuroprotektion Mikroglia und GPR55 in Frage kommen.

Typisch für die Alzheimer' schen Erkrankung ist die Bildung unlöslicher Ablagerungen im Gehirn, sogenannter "seniler Plaques". Diese Plaques bestehen im Wesentlichen aus fibrillärem beta-Amyloid, das durch Glykierungen verändert vorliegen kann. Außerdem beinhalten die Plaques, sogenannte AGEs "Advanced Glycation Endproducts", die aus nichtenzymatisch glykierten Proteinen entstehen. Diese AGE-modifizierten Proteine sowie das fibrilläre beta-Amyloid sind in der Lage Mikrogliazellen zu aktivieren. Die sessilen Gehirnmakrophagen wirken in aktiviertem Zustand neurotoxisch, wobei es verschiedene Hypothesen gibt, wie die Mikrogliazellen zu dem neuronalen Zelltod führen. Um dieses zu untersuchen wurden murine Mikrogliazellen herangezogen, die als Merkmal ihrer Aktivierung auf die Translokation des Transkriptionsfaktors NF-kappa-B in den Zellkern überprüft wurden. In der vorliegenden Arbeit wurden die Rahmenbedingungen näher untersucht, die zu der AGE vermittelten Mikrogliaaktivierung führen. Es wurde in vitro gezeigt, daß die Mikrogliaaktivierung zunächst durch eine hochmolekulare Hyaluronsäure, wie sie nativ in der extrazellulären Matrix vorliegt, verhindert wird. Im Gegensatz dazu konnte NF-kappa-B in Mikrogliazellen aktiviert werden, die in Gegenwart von Hyaluronsäurefragmenten mit AGE behandelt wurden. In der vorliegenden Arbeit wurde festgestellt, daß die Mikrogliaaktivierbarkeit umgekehrt proportional zu der durchschnittlichen Hyaluronsäuremolekülgröße ist. Andere Glykosaminoglykane aus der extrazellulären Matrix, wie D-Glukuronsäure, N-Azetylglukosamin oder Chondroitin-4-sulfat reduzierten die Aktivierbarkeit der Mikrogliazellen nur geringfügig. Sowohl beta-Amyloid, als auch AGEs setzen während ihres Entstehungsprozesses reaktive Sauerstoffspezies frei, die Hyaluronsäure in kleinere Bruchstücke zerschneiden können. Die Signaltransduktion der AGE-aktivierten Mikrogliazellen wurde mittels unterschiedlicher Inhibitoren gehemmt und die Auswirkung auf die NF-kappa-B Aktivierung untersucht. Hier zeigte sich ein komplexes Netzwerk an aktivierten Signalwegen, so daß kein Rückschluß auf einen bestimmten Rezeptor möglich war. Daher wurde ein "in vitro Modell" entwickelt, um die ausschlaggebende neurotoxischen Komponenten der Mikrogliareaktion aufzufinden. Darin wurden die Signalkaskaden der aktivierten Mikroglia erneut durch pharmakologische Inhibierung unterbrochen, das zellfreie Medium das von diesen Mikrogliazellen sezerniert wurde, wurde als "konditioniertes Medium" für die Kultur muriner Neuronen eingesetzt. Diese wurden bezüglich ihrer Überlebensrate in diesem konditionierten Medium untersucht. Die Hemmung der Transkription oder der Translation in den Mikrogliazellen zeigte keine Reduktion der neurotoxischen Wirkung des konditionierten Mediums. Ebensowenig wirkten Inhibitoren der mitochondrialen Atmungskette, der Radikalquellen Xanthin Oxidase, Lipoxygenase oder Cyclooxygenase. Die Hemmung der NADPH Oxidase reduzierte die Neurotoxizität des konditionierten Mediums auf etwa 30 Prozent. Die NADPH Oxidase ist ein Enzymkomplex, der im Rahmen des "oxidativen bursts" große Mengen Superoxidanionen freisetzt. Um die Bedeutung der NADPH Oxidase Aktivierung für die neurotoxische Wirkung nachzuweisen, wurde eine Untereinheit der NADPH Oxidase, das membranständige gp91phox in den Mikrogliazellen deaktiviert. Dies führte dazu, daß diese Zellen kein Superoxid auf die Stimulation mit beta-Amyloid oder AGE hin abgaben, im Gegensatz zu den Mikrogliazellen mit funktioneller NADPH Oxidase. Das konditionierte Medium der NADPH Oxidase defizienten Zellen war nicht mehr neurotoxisch. Die freien Sauerstoffradikale die aufgrund der NADPH Oxidase Aktivierung entstehen, können zu einer NF-kappa-B Aktivierung führen. NF-kappa-B wurde erfolgreich in den Mikroglia durch exogenes Wasserstoffperoxid stimuliert, wobei aber keine neurotoxische Wirkung im Modellsystem festgestellt wurde. NF-kappa-B scheint damit nicht für die mikrogliavermittelte Neurotoxizität verantwortlich zu sein, im Gegensatz zu der NADPH Oxidase, deren Aktivität unmittelbar mit der Neurotoxizität korreliert ist. / Senile plaques are a hallmark in Alzheimer's Disease progression. These plaques consist mainly of fibrillar beta-amyloid, which can be modified by glycation. In addition these plaques contain so called AGEs "Advanced Glycation Endproducts", emerging from nonenzymatic glycated proteins. Subsequent dehydration, condensation and oxidation produces a heterogenous group of heterocyclic, coloured and fluorescent compounds. These AGE modified proteins are resistant to proteases and their formation is irreversible. AGEs and beta-amyloid are able to activate Microglia cells, resulting in a neurotoxic effect, with several hypothesis of how microglia contribute to neuronal cell death. To investigate the neurotoxic effect murine microglia cells were used. The NF-kappa-B translocation into the nucleus was taken as an indicator of microglial activation. In this work conditions were investigated, that are necessary to activate murine microglia cells by AGE stimulation. High molecular weight hyaluronic acid from extracellular matrix, in its native form, is inhibiting activation of microglia cells in vitro. In contrast NF-kappa-B was activated in AGE stimulated microglia cells in the presence of low molecular weight hyaluronic acid fragments. Here it was shown that the ability to activate microglia cells is inversly proportional to the average size of the hyaluronic acid. The ability for activation of microglia cells was reduced only in parts by other extracellular matrix glycosaminoglycans, like D-glucuronic acid, N-acetylglucosaminoglycane or chondroitine-4-sulfate. Ab and AGEs release reactive oxyen species during their develompent, which were shown to be able to cleave hyaluronic acid into small fragments. The signal transduction of AGE activated microglia cells was examined by measurement of NF-kappa-B activation reduced by different inhibitors. A complex network of signaling pathways was detected, without revealing a certain receptor. Therefore an "in vitro model" was established, to find out the main neurotoxic component in the reaction of microglia cells. Again the signaling pathways were inhibited pharmacologically, using the cell free medium produced by these microglia cells as "conditioned medium" in neuronal cell culture. The murine neuronal cells were tested for their surviving in the conditioned medium, to correlate activated signal pathways with neurotoxicity. Inhibition of translation or transcription in microglia cells led to no reduction of the neurotoxic effect of the conditioned medium, nor did the inhibition of the mitochochondrial respiratory chain or the radical sources xanthine oxidase, lipoxygenase or cyclooxygenase. Inhibition of NADPH oxidse was able to reduce the neurotoxicity of the conditioned medium down to 30 per cent. The NADPH oxidase is an enzyme complex , releasing huge numbers of superoxide anion radicals during the "oxidative burst". The neurotoxic component was released 30 min after activation of microglia cells into the conditioned medium, was bigger than 50 kDa and was removed out of the conditioned medium by EDTA chelation followed by dialysis. To proof the importance of NADPH oxidase activation for neurotoxicity, a part of the NADPH oxidase, the membranebound gp91phox was disrupted by gene targeting. As a consequence these cells did not react with superoxide release, when treated with beta-amyloid or AGE. Conditioned medium of these cells was not neurotoxic, in contrast to that of the microglia cells with a functional NADPH oxidase. The reactive oxygen species resulting from the NADPH oxidase activity are able to activate NF-kappa-B. Because of the wide range of gene activation performed by NF-kappa-B, there are various potential neurotoxic gene products to consider. For that reason NF-kappa-B was stimulated sucessfully in microglia cells with exogenous hydrogen stimulation, without a neurotoxic result in the model system. Activated NF-kappa-B seems not to be responsible for the microglia mediated neurotoxicity, whereas there is a direct correlation of NADPH oxidase activity and neurotoxicity.

Das Chemokin SDF-1 spielt eine wichtige Rolle bei der Hämatopoese, bei Immunreaktionen sowie bei der Entwicklung des Herzens, der Extremitätenmuskulatur und des zentralen und peripheren Nervensystems. Lange Zeit galt CXCR4 als der einzige Chemokinrezeptor für SDF-1, bis vor wenigen Jahren CXCR7 als ein alternativer Rezeptor für SDF-1 identifiziert wurde. Da alle Zelltypen des zentralen Nervensystems (ZNS) sensitiv für SDF-1 sind, sollte in dieser Arbeit die Funktion der beiden Rezeptoren in primärer Mikroglia und primären Astrozyten untersucht werden. Bisher konnte CXCR7 nur als Scavenger-Rezeptor für SDF-1 oder als atypischer Chemokinrezeptor nachgewiesen werden. Die Untersuchungen ergaben einen mitogenen und chemotaktischen Effekt von SDF-1 auf primäre Mikroglia, wobei sowohl CXCR4 als auch CXCR7 für das SDF-1-Signalverhalten essentiell sind. Nach Aktivierung von Mikroglia in vitro und in vivo wurden beide Rezeptoren verstärkt expremiert. In primären Astrozyten ergab sich ein ligandenabhängiges Signalverhalten von CXCR7. So führte die Bindung von SDF-1 an CXCR7 zu einer Aktivierung von G-Proteinen, während die Kopplung von interferon-inducible T cell alpha chemoattractant (I-TAC), als zweiten Liganden von CXCR7, eine Signalweiterleitung über ß-Arrestin2 zur Folge hatte. Zudem konnte die G-Protein-gekoppelte Rezeptorkinase (Grk)2 als ein positiver Regulator des SDF-1-CXCR7-Signalverhaltens in Astrozyten identifiziert werden.

Die Alzheimer-Demenz drängt immer mehr in den Fokus unserer Gesellschaft, doch ihre Pathophysiologie ist bisher nicht vollständig verstanden. Seit einigen Jahren ist das Enzym Glutaminylzyklase (QC) als wichtiger Katalysator der Bildung von Pyroglutamat-ß-Amyloid Inhalt intensiver Forschung. Zielsetzung dieser Arbeit war es, die Expression der QC, welche bisher nur in Neuronen nachgewiesen wurde, in Astrozyten und Mikrogliazellen zu untersuchen. Da Gliazellen einen wichtigen Faktor der pathologischen Veränderungen neurodegenerativer Erkrankungen ausmachen, stellt sich die Frage nach ihrer kausalen Beteiligung an Prozessen, die zur Entstehung der Alzheimer-Demenz beitragen können. Für diese Studie wurden zwei Modelle gewählt, die zu einer spezifischen Aktivierung von Astrozyten und Mikrogliazellen als Reaktion auf eine Schädigung von Neuronen führten, zum einen nach Schädigung cholinerger Neurone durch das Neurotoxin 192-IgG-Saporin, zum anderen nach temporärer Okklusion der Arteria cerebri media. Die aktivierten Astrozyten zeigten eine deutliche Expression der QC, welche hingegen bei ruhenden Astrozyten im gesunden Gewebe nicht nachweisbar war, so dass von einer Hochregulation der Expression bei Aktivierung der Zellen ausgegangen werden kann. Weiterhin konnte die QC in Mikrogliazellen, die sich im phagozytierenden Stadium befinden, dargestellt werden. Diese Arbeit soll dazu beitragen die Zusammenhänge zwischen einer Aktivierung von Gliazellen nach einem Schädigungsereignis, wie zum Beispiel einer Ischämie bei Verschluss eines cerebralen Gefäßes, und der Entwicklung einer Alzheimer-Demenz aufzuklären.

Bei der Alzheimerschen Erkrankung handelt es sich um eine progressiv verlaufende, neurodegenerative Erkrankung, die die häufigste Form altersbedingter, kognitiver Dysfunktionen des Menschen darstellt. Sie ist pathomorphologisch durch eine fortschreitende Formation von amorphen und kompakten extrazellulären Amyloid-Ablagerungen (Plaques) sowie durch die Ausbildung intrazellulärer neurofibrillärer Bündel charakterisiert. Die Oligomerisierung und die Aggregation von β-Amyloid1-42-Peptiden zu fibrillären Plaques und davon ausgehende neurodegenerative Veränderungen führen zu einer unspezifischen Aktivierung von Mikrogliazellen und zu Entzündungsprozessen im ZNS. Diese Antigen-unspezifische Form der Mikroglia-Aktivierung ist neurotoxisch und fördert daher die Neurodegeneration im Verlauf der Alzheimerschen Erkrankung. Mikroglia-Aktivierung ist allerdings nicht generell neurotoxisch, da es verschiedene, in der vorliegenden Arbeit diskutierte Arten von mikroglialer Aktivierung mit jeweils unterschiedlichen – neurotoxischen bis hin zu neuroprotektiven - Auswirkungen gibt. Das Ziel dieser Arbeit war es, die mikrogliale Aktivierung in einem Mausmodell des Morbus Alzheimer zu modulieren und die resultierenden Effekte zu charakterisieren. Für die Modulation der mikroglialen Aktivierung wurde die subklinische Infektion mit dem neurotropen Borna Disease Virus (BDV) genutzt. Um den Einfluss der veränderten mikroglialen Aktivierung auf die zerebrale β-Amyloid-Belastung zu untersuchen, wurden swAPP-transgene Mäuse der Linie Tg2576 verwendet, die die schwedische Mutationsvariante des humanen app überexprimieren. Diese Mäuse produzieren humane β-Amyloid-Peptide, die sich mit zunehmendem Alter zu Plaques formieren. Transgene Mäuse wurden in drei Altersgruppen (11, 13,5 und 18 Monate) BDV-infiziert. Vier Wochen später wurden im Gehirn der Mäuse immunhistochemisch Lymphozyteninfiltration, Astroglia- und Mikroglia-Aktivierung untersucht. Die zerebrale βA-Belastung dieser BDV-infizierten Mäuse wurde mittels βA1-42-Immunhistochemie und Thioflavin-S-Markierung histometrisch quantifiziert und mit nicht infizierten, transgenen Kontrollmäusen verglichen. Auch eine biochemische Analyse der βA1-40- und βA1-42-Peptide mittels ELISA wurde vorgenommen. Zu keinem Zeitpunkt wurde eine klinisch manifeste BDV-Erkrankung registriert; die BDV-infizierten Mäuse blieben klinisch unauffällig. βA-Ablagerungen allein waren nur bei massiver Formation in der Lage, einzelne Mikroglia-zellen zu aktivieren. Erst die intrazerebrale BDV-Infektion induzierte vorrangig CD4-T-lymphozytäre Infiltrationen sowie eine deutliche BDV-spezifische Aktivierung der Mikroglia-zellen, die vier Wochen p.i. maximal ausgeprägt waren. Es lag eine positive lokale und graduelle Korrelation zwischen CD4-T-Lymphozyteninfiltrationen und Mikroglia-Aktivierung in den Gehirnen BDV-infizierter Mäuse vor. Bis auf eine Untersuchungsgruppe wurde keine nachweisbare Reaktion der Astroglia - weder auf die BDV-Infektion, noch auf die βA-Ablagerungen - registriert. In allen untersuchten Altersgruppen wurde ein tendenziell reduzierter βA-Gehalt in den Gehirnen der BDV-infizierten Tiere gegenüber den nicht infizierten Kontrolltieren registriert. Diese βA-Reduktion nach BDV-Infektion war in der Altersgruppe 13,5 Monate am deutlichsten ausgeprägt, wo die βA-Belastung der BDV-infizierten Tiere in vielen untersuchten Arealen signifikant geringer war als die der Kontrolltiere. Eine lokale Korrelation zwischen Mikroglia-Aktivierung und βA-Reduktion wurde nicht nachgewiesen. In zahlreichen untersuchten Hirnarealen aller drei Altersgruppen war der Anteil von vaskulär lokalisiertem β-Amyloid in den Gehirnen der BDV-infizierten Mäuse gegenüber den nicht infizierten Kontrollmäusen signifikant erhöht. Schlussfolgerungen: 1) In unserem Mausmodell führt die BDV-Infektion zu einer Modulation der Mikroglia-Aktivierung. 2) Die Korrelation der Mikroglia-Aktivierung mit viral bedingter T-Zellinfiltration und erhöhter Zytokinexpression deutet auf adaptive, T-Zell-vermittelte Modulation als Induktor dieser Aktivierung. 3) Die BDV-induzierte Mikroglia-Aktivierung führt zu einer: a) β-Amyloid-Reduktion, an der vermutlich von spezifisch aktivierten Mikrogliazellen ausgehende Clearance-Mechanismen beteiligt sind. b) β-Amyloid-Umverteilung vom Parenchym zu den Gefäßen, vermutlich, um den βA-Abtransport über das Gefäßsystem zu realisieren, wobei Amyloid-Einlagerungen in die Gefäßwände möglich sind. 4) Die viral induzierte Mikroglia-Aktivierung hängt sowohl vom Alter als auch von möglicher Voraktivierung der Zellen ab; altersbedingte Dysfunktionalität der Mikroglia ist eine potentielle Ursache der geringeren β-Amyloid-Clearance in der Altersgruppe 18 Monate. 5) Die Modulation der Mikroglia-Aktivierung ist prinzipiell möglich und führt zu potentiell positiven Effekten. 6) Dieses Modell ist zur Untersuchung der Modulation mikroglialer Aktivierung über adaptive Mechanismen geeignet. / Alzheimer´s Disease (AD) is a progressive neurodegenerative disorder and the most common form of age-related cognitive failure in humans. Pathomorphologically, it is characterized by a progressive accumulation of amorphous and compact extracellular amyloid-β deposits (plaques) as well as intracellular neurofibrillary tangles. Oligomerization and aggregation of amyloid-β1-42, its formation of fibrillary deposits as well as associated neurodegenerative changes lead to an unspecific activation of microglial cells and to inflammatory processes in the CNS. This unspecific form of microglial activation is neurotoxic and enhances neurodegeneration in the course of Alzheimer´s Disease. However, microglial activation is not neurotoxic per se, since there are various types of microglial activation that are being discussed in this study; the different activation types have varying effects reaching from neurotoxic to neuroprotective. The aim of the study was to modify microglial activation in a mouse model of Morbus Alzheimer and to characterize the resulting effects. For the modulation of microglial activation, we used the subclinic infection with the neurotropic Borna Disease Virus (BDV). In order to study the impact of the modulated microglial activation on the cerebral amount of beta-amyloid material, we used swAPP-transgenic Tg2576 mice, which overexpress the Swedish mutation variant of the human APP. These mice produce human amyloid β peptides that form amyloid plaques upon aging. We infected transgenic mice intracerebrally with BDV at different ages (11, 13,5 and 18 months old) and investigated brain-sections of these mice four weeks later by means of immunohistochemistry with regard to lymphocytic infiltrations, astroglial and microglial activation. The amount of amyloid β in the brains of BDV-infected mice was compared to that of non-infected, transgenic mice. The investigation of the cerebral amyloid β load was realized immunohistochemically by using an anti-Aβ1-42-antibody as well as by means of Thioflavin-S fluorescence technique followed by histometric quantification. Additionally, a biochemical analysis of Aβ1-40 and Aβ1-42 peptides was done using an ELISA-kit. A clinically apparent BDV-disorder could not be seen at any stage; BDV-infected mice remained free of BDV symptoms. Only massive amyloid-β deposits were able to independently induce activation of single microglial cells. Intracerebral BDV-infection caused marked infiltrations of primarily CD4-T-lymphocytes as well as a prominent specific microglial activation, which reached maximum levels four weeks p.i. A positive local and gradual correlation of CD4-T-lymphocytes and microglial activation was registrated in the brains of BDV-infected mice. Except one age group, neither BDV-infection nor amyloid-β deposits induced a detectable reaction of astrocytes. In all investigated age groups, a reduced amount of amyloid-β could be measured in the brains of BDV-infected mice compared to non-infected control mice. This Aβ reduction after BDV-infection was most prominent in the age group 13,5 months, where Aβ-load of BDV-infected mice was significantly decreased in many brain areas compared to that of control mice. A local correlation of microglial activation and Aβ reduction could not be observed. Several brain areas in all three age groups showed a significantly higher amount of vascular amyloid-β in the brains of BDV-infected mice compared to those of non-infected controls. Conclusions: 1) In our mouse model, BDV-infection leads to a modulation of microglial activation. 2) The correlation of microglial activation with viral-induced infiltrations of T cells and with upregulated cytokine expression suggests an adaptive, T cell-induced modulation as trigger of this acivation. 3) BDV-specific microglial activation leads to: a) Reduced cerebal amyloid-β load, possibly realized by clearance mechanisms of activated microglial cells. b) Redistribution of amyloid-β from the parenchyma to the vessels, possibly in order to clear the amyloidogenic material via the vasculature. During these processes, amyloid deposition in the walls of the cerebral blood vessels is possible. 4) Viral-induced microglial activation depends on the cell´s age and possible pre-activation; dysfunctional changes in microglia might be a cause for the less effective Aβ-clearance observed in the age group 18 months. 5) In principle, modulation of microglial activation is possible and leads to potential beneficial effects. 6) This study displays a proper model for investigations of the modulation of microglial activation via adaptive mechanisms.

Microglia represent resident immune cells of the central nervous system (CNS), which have been shown to be involved in the pathophysiology of practically every neuropathology. As microglia were described to participate in the formation of the astroglial glia limitans around CNS vessels, they are part of the neurovascular unit (NVU). Since the NVU is a highly specialized structure, being functionally and morphologically adapted to differing demands in the arterial, capillary, and venous segments, the present study was aimed to systematically investigate the microglial contribution to the glia limitans along the vascular tree. Thereby, the microglial participation in the glia limitans was demonstrated for arteries, capillaries, and veins by immunoelectron microscopy in wild-type mice. Furthermore, analysis by confocal laser scanning microscopy revealed the highest density of microglial endfeet contacting the glial basement membrane around capillaries, with significantly lower densities around arteries and veins. Importantly, this pattern appeared to be unaltered in the setting of experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in CX3CR1CreERT2:R26-Tomato reporter mice, although perivascular infiltrates of bloodborne leukocytes predominantly occur at the level of post-capillary venules. However, EAE animals exhibited significantly increased contact sizes of individual microglial endfeet around arteries and veins. Noteworthy, under EAE conditions, the upregulation of MHC-II was not limited to microglia of the glia limitans of veins showing infiltrates of leukocytes, but also appeared at the capillary level. As a microglial contribution to the glia limitans was also observed in human brain tissue, these findings may help characterizing microglial alterations within the NVU in various neuropathologies.:1 Abkürzungsverzeichnis 2 Tabellen- und Abbildungsverzeichnis 3 Einführung in die Thematik 3.1 Die neurovaskuläre Einheit 3.2 Die Bluthirnschranke als funktionelle Besonderheit des zerebralen Gefäßendothels 3.3 Leukozytenmigration im Rahmen der Neuroinflammation 3.4 Mikroglia 3.4.1 Entwicklung und Funktion 3.4.2 Mikroglia und ZNS-Pathologien 3.4.3 Mikroglia und die Glia limitans 3.5 Fragestellung 4 Publikationsmanuskript 5 Zusatzmaterial 6 Zusammenfassung der Arbeit 7 Literaturverzeichnis 8 Darstellung des eigenen Beitrags 9 Erklärung über die eigenständige Abfassung der Arbeit 10 Curriculum vitae 11 Danksagung

In der vorliegenden Arbeit wurde die Funktion des G-Protein-gekoppelten Rezeptors 34 (GPR34) in Mikroglia untersucht. Dieser Rezeptor weist eine hohe Expression auf Gliazellen auf, jedoch ist über dessen Aufgabe innerhalb dieser Zellpopulation bisher nichts bekannt. In bisherigen Arbeiten wurde dem GPR34 eine Rolle in der Immunantwort zugeschrieben. Knock-out (ko)-Mäuse, welche mit Cryptococcus neoformans infiziert wurden, zeigten im Vergleich zum infizierten Wildtyp (wt) eine deutlich höhere Pathogenlast in verschiedenen Geweben u.a. im Gehirn, was für eine inadäquate Immunantwort spricht. In dieser Arbeit konnte mittels morphologischer Studien gezeigt werden, dass eine GPR34- Defizienz zu einer veränderten Gestalt der Mikroglia im Cortex sowie der Retina führt. Mikrogliazellen aus ko-Mäusen sind kleiner und deutlich weniger ramifiziert. Mit Hilfe von Transkriptomanalysen wurde eine große Vielfalt an unterschiedlich exprimierten Genen zwischen ko- und wt-Tieren identifiziert. Hierunter befanden sich Gene, die die Motilität, aber auch die Phagozytose der Mikroglia beeinflussen. Um den Einfluss der GPR34-Defizienz auf diese Vorgänge zu untersuchen, wurden zahlreiche funktionelle Untersuchungen an murinen Mikrogliazellen durchgeführt. Mittels basalen Motilitätsstudien aber auch unter Stimulation durch Laserläsion und Läsion des entorhinalen Cortex konnten keine Unterschiede in der Beweglichkeit von Mikroglia aufgedeckt werden. Jedoch zeigten ko- Mikrogliazellen des Cortex und der Retina eine deutlich geringere Phagozytoseaktivität. Dies ist ein möglicher Erklärungsansatz für die beschriebene erhöhte Pathogenlast in den GPR34- defizienten Tieren. Da die Phagozytoseaktivität von Mikroglia in neurodegenerativen Erkrankungen wie Multipler Sklerose oder der Alzheimer´schen Demenz eine bedeutende Rolle spielt, sollte zukünftig die Relevanz des GPR34 bei diesen Erkrankungen untersucht werden.