Lasergestützte Mikromanipulation an der Kanincheneizelle im Rahmen von Kerntransferexperimenten Bohn, Dirk Aus der Ambulatorischen und Geburtshilflichen Tierklinik der Veterinärmedizinischen Fakultät der Universität Leipzig und dem Institut für Tierzucht und Tierhaltung mit Tierklinik der Landwirtschaftlichen Fakultät der Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg Juni, 2001 120 S., 199 Lit., 38 Tab., 20 Abb.; Anhang 15 S.: 8 Abb., 15 Tab. Mit der vorliegenden Arbeit sollten erstmalig die Methoden der Laser-vermittelten, berührungsfreien Öffnung der Zona pellucida (Laser-Zona-Drilling, LZD) und der funktionellen Deaktivierung der Vorkerne als einfachere und die Entwicklungsfähigkeit behandelter Zellen weniger beeinträchtigende Methoden im Vergleich zu herkömmlichen mechanischen Methoden des Kerntransfers experimentell bearbeitet werden. Für den Einsatz des Lasers sind grundlegende Kenntnisse über die Wirkungsweise der fokussierten Laserstrahlen am Zielobjekt der Mikromanipulation, den Kanincheneizellen, notwendig. Deshalb wurden zunächst sehr umfangreiche Untersuchungen zum Einfluß steigender Einwirkzeiten des Lasers bei Verwendung drei verschiedener Objektive an und in befruchteten Eizellen in vitro und in vivo durchgeführt. Hierfür kamen 863 Eizellen in 11 verschiedenen Methoden (M) zum Einsatz. Mit den Methoden 1-3 (231 Eizellen) wurde der Einfluß der Objektive beim LZD in vitro untersucht. In den Methoden 4 und 5 kam der Embryotransfer nach LZD zur Anwendung (202 Embryonen). Die Methoden 6-8 (202 Eizellen) wurden zum Einfluß der drei Objektive bei der direkten Laserfokus-vermittelten Manipulation der lichtmikroskopisch sichtbaren Vorkerne in vitro durchgeführt. Bei den Methoden 9-11 (228 Eizellen) wurde der Laserfokus (gleiches Objektiv) in seiner Lage zu den Vorkernen verändert (defokussiert), um zur Wirkungsweise der fokussierten Laserstrahlen in der Eizelle Aussagen zu ermöglichen. Auf der Grundlage dieser Ergebnisse wurden 3 Kerntransfergruppen (G) nach definierter Methodik gebildet, wobei zur Vergleichbarkeit die Parameter der Lasereinstellung (maximale Pulsfrequenz und Energie) von den methodischen Untersuchungen übernommen wurden. Die Empfängereizellen (Vorkerne) der ersten beiden Gruppen (G1: 117; G2: 129) wurden einheitlich mit 10 Sekunden manipuliert. Der Unterschied bestand in der Blastomeren-gewinnung (G1: nach LZD; G2: enzymatisch). Die Empfängereizellen der Gruppe 3 (134) wurden lediglich mit 2 Sekunden manipuliert (enzymatische Blastomerengewinnung) fusioniert. Nachdem die Kerntransferembryonen der Gruppe 3 in vitro die beste Entwicklungsfähigkeit zeigten, wurden 112 so erstellte Kerntransferprodukte auf 8 pseudogravide Ammentiere übertragen. Bei den Untersuchungen zum LZD (M1-M3) und zur direkten Vorkernbearbeitung (M6- M8) zeigte sich eine Abhängigkeit vom verwendeten Objektiv dahingehend, daß die Verwendung des Achroplan den größten und des Neofluar den geringsten depressiven Einfluß auf die Entwicklungsfähigkeit behandelter Eizellen hat. Das Ultrafluar-Objektiv ist dem Neofluar-Objektiv sehr ähnlich. Mit Hilfe des Embryotransfers (202 Embryonen) nach LZD (M4 u. M5) konnte die Entwicklungspotenz dieser Embryonen in vivo (45 Nachkommen) gezeigt werden, wobei die Geburtsrate der übertragenen 2-Zeller (27,55 %) (M5) den 1-Zellern (17,31 %) (M4) signifikant überlegen ist. Mit den Methoden 9-11 wurde nachgewiesen, daß im Strahlkegel, in unmittelbarer Nähe zum Laserfokus, die depressive Beeinflussung vergleichbar zur direkten Vorkernmanipulation ist. Der mit steigender Einwirkzeit kontinuierlich sinkenden Entwicklungsfähigkeit bei Laserfokuspositionierung unter der Zelle (M10) steht eine mit kurzen Einwirkzeiten bessere, jedoch mit steigender Einwirkzeit sprunghaft schlechter werdende Entwicklungsfähigkeit bei Laserfokuspositionierung neben den Vorkernen in der Zelle (M11) gegenüber. Bei den Kerntransferexperimenten konnten die Totalausfälle durch Verzicht auf die mechanische Entkernung mit der damit verbundenen Verringerung der Anzahl an Empfängereizellen vermieden werden (nahezu identisches Ausgangsmaterial). Da kein Zytoplasma abgesaugt wurde, bestand ein hoher Anpressdruck auf die sich berührenden Fusionsmembranen von Oozyte und Blastomere, wodurch sich die sehr hohen Fusionsraten im Einzelschritt (G1: 75,2 %; G2: 86,8 %; G3: 97,7 %) erklären lassen. Die signifikant geringere Fusionsrate der Gruppe 1 ist wie die signifikant geringere Teilungsrate (G1:73,9 % versus G2: 92,0 % bzw. G3: 95,2%) auf die Blastomerengewinnung nach LZD zurückzuführen. Die Entwicklungsfähigkeit der Kerntransferembryonen in vitro der Gruppen 1 und 2 ist mit 3,1 % (G1) bzw. 1,9 % (G2) zum 32-Zeller als maximal erreichtes Entwicklungsstadium sehr schlecht. Nach Verringerung der Lasereinwirkzeit auf 2 Sekunden (G3) konnten die Kerntransferembryonen, als erster Erfolg der neuen Methode, mit 40,0 % in vitro das Morulastadium erreichen. Allerdings blieb nach Transfer so erstellter 112 Kerntransferembryonen auf pseudogravide Ammentiere die Geburt von Jungtieren aus. Durch die Verringerung der Pulsfrequenz und Laserenergie in Verbindung mit der gezielten Bearbeitung des gesamten Raumes der Vorkerne sollte eine vollständige Deaktivierung der Vorkerne bei größtmöglicher Schonung des Zytoplasmas möglich sein. Nach Ermittlung dieser Parameter sollten sie zur Entkernung von Metaphase-II-Oozyten verwendet werden. / Laser-microbeam-delivered micromanipulation during nuclear transfer experiments in rabbit oocytes Bohn, Dirk From the Large Animal Clinic for Theriogenology and Ambulatory Services Faculty of Veterinary Medicine, University of Leipzig and the Institute of Animal Breeding and Husbandry with Veterinary Clinic of the Martin-Luther-University, Halle-Wittenberg June, 2001 120 p., 199 ref., 38 tab., 20 fig.; Annex 15 p.: 8 fig., 15 tab. The object of this work was to establish the first time the methods of Laser-microbeam-delivered non-touched opening of the Zona pellucida (known as Laser-Zona-Drilling, LZD) and the functional enucleation of the pronucleus. This methods are efficient and provide a good developmental capability of manipulated cells in comparison to previous used mechanical nuclear transfer methods. The basis for utilising Laser is to know about the effects of the focused laser-microbeam on targeted micromanipulated rabbit oocytes. Therefore, we next analysed in a number of in vivo and in vitro studies the time-dependent influence of laser in three different objectives of the device on or in fertilised oocytes. For this purpose about 863 oocytes in eleven different methods were used. In groups 1-3 (containing 231 oocytes) it was measured in vitro the influence of the objective during LZD, whereas in group 4 and 5 embryo transfer (202 embryos) after LZD was undertaken. In further in vitro studies (group 6-8, 202 oocytes), we were interested on the effects of three objectives on light-microscopic visible pronuclei which were directly manipulated with the laser-focus. Lastly, to follow the different application modus of the laser-focus (groups 9-11, 228 oocytes) the position of the laser-microbeam to the oocytes pronuclei was changed. Based up on these results three defined nuclear transfer groups (G) were built to compare the data of the first methodological validation with unchanged laser parameters (pulse repetition rate, laser energy). Recipient oocytes (pronuclei) of the first two groups (G1: 117; G2: 129) were manipulated with same time-duration of 10 seconds. The difference between both groups were in the isolation of blastomeres which was performed after LZD (G1) or enzymatic (G2). Recipient oocytes of group 3 (134) were merely treated with time-duration of 2 seconds and fused with enzymatic dissociated blastomeres. The nuclear transferred embryos in group 3 have shown the best developmental capability.

In this paper the development, the fabrication and the experimental characterisation of a novel electrodynamic-driven micro-actuator for in plane motions and a novel vertical field effect transistor (vertical FET) is presented. The micro-actuator for motion is based on the Lorentz force generated by a current in a magnetic field. The Lorentz force acting on the actuator can be controlled easily by the amplitude of the current. The vertical FET can be used for signal conversion from the mechanical to the electrical domain.  This low impedance sensing technique was realized by introducing a source and drain region in opposite of a movable mass which acts as the gate.  The channel resistance between drain and source is influenced by the movable mass working as a sensing unit.  Theoretical calculations and practical experiments of the structure are performed. Mechanical and electrical effects over a temperature range of  -40 °C to 180 °C  are investigated. / In dieser Arbeit wird ein neues Aktorarray zur Objektmanipulation und ein neues Verfahren zur Detektion mechanischer Bewegung in Komponenten der oberflächennahen Bulk-Mikromechanik vorgestellt. Die Aktorstrukturen werden mit Hilfe der SCREAM-Technologie hergestellt und arbeiten nach dem elektrodynamischen Wirkprinzip. Bei dem Verfahren zur Bewegungsdetektion wird der aus der Mikroelektronik bekannte Feldeffekt mit mikromechanischen Strukturen gekoppelt. Die Arbeit konzentriert sich auf den Aufbau, die Wirkungsweise und die Technologie der Aktor- und Sensorstrukturen. Diese werden jeweils separat dargestellt und analysiert. Am Ende wird eine Kombination beider Komponenten vorgestellt.

Lasergestützte Mikromanipulation an der Kanincheneizelle im Rahmen von Kerntransferexperimenten Bohn, Dirk Aus der Ambulatorischen und Geburtshilflichen Tierklinik der Veterinärmedizinischen Fakultät der Universität Leipzig und dem Institut für Tierzucht und Tierhaltung mit Tierklinik der Landwirtschaftlichen Fakultät der Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg Juni, 2001 120 S., 199 Lit., 38 Tab., 20 Abb.; Anhang 15 S.: 8 Abb., 15 Tab. Mit der vorliegenden Arbeit sollten erstmalig die Methoden der Laser-vermittelten, berührungsfreien Öffnung der Zona pellucida (Laser-Zona-Drilling, LZD) und der funktionellen Deaktivierung der Vorkerne als einfachere und die Entwicklungsfähigkeit behandelter Zellen weniger beeinträchtigende Methoden im Vergleich zu herkömmlichen mechanischen Methoden des Kerntransfers experimentell bearbeitet werden. Für den Einsatz des Lasers sind grundlegende Kenntnisse über die Wirkungsweise der fokussierten Laserstrahlen am Zielobjekt der Mikromanipulation, den Kanincheneizellen, notwendig. Deshalb wurden zunächst sehr umfangreiche Untersuchungen zum Einfluß steigender Einwirkzeiten des Lasers bei Verwendung drei verschiedener Objektive an und in befruchteten Eizellen in vitro und in vivo durchgeführt. Hierfür kamen 863 Eizellen in 11 verschiedenen Methoden (M) zum Einsatz. Mit den Methoden 1-3 (231 Eizellen) wurde der Einfluß der Objektive beim LZD in vitro untersucht. In den Methoden 4 und 5 kam der Embryotransfer nach LZD zur Anwendung (202 Embryonen). Die Methoden 6-8 (202 Eizellen) wurden zum Einfluß der drei Objektive bei der direkten Laserfokus-vermittelten Manipulation der lichtmikroskopisch sichtbaren Vorkerne in vitro durchgeführt. Bei den Methoden 9-11 (228 Eizellen) wurde der Laserfokus (gleiches Objektiv) in seiner Lage zu den Vorkernen verändert (defokussiert), um zur Wirkungsweise der fokussierten Laserstrahlen in der Eizelle Aussagen zu ermöglichen. Auf der Grundlage dieser Ergebnisse wurden 3 Kerntransfergruppen (G) nach definierter Methodik gebildet, wobei zur Vergleichbarkeit die Parameter der Lasereinstellung (maximale Pulsfrequenz und Energie) von den methodischen Untersuchungen übernommen wurden. Die Empfängereizellen (Vorkerne) der ersten beiden Gruppen (G1: 117; G2: 129) wurden einheitlich mit 10 Sekunden manipuliert. Der Unterschied bestand in der Blastomeren-gewinnung (G1: nach LZD; G2: enzymatisch). Die Empfängereizellen der Gruppe 3 (134) wurden lediglich mit 2 Sekunden manipuliert (enzymatische Blastomerengewinnung) fusioniert. Nachdem die Kerntransferembryonen der Gruppe 3 in vitro die beste Entwicklungsfähigkeit zeigten, wurden 112 so erstellte Kerntransferprodukte auf 8 pseudogravide Ammentiere übertragen. Bei den Untersuchungen zum LZD (M1-M3) und zur direkten Vorkernbearbeitung (M6- M8) zeigte sich eine Abhängigkeit vom verwendeten Objektiv dahingehend, daß die Verwendung des Achroplan den größten und des Neofluar den geringsten depressiven Einfluß auf die Entwicklungsfähigkeit behandelter Eizellen hat. Das Ultrafluar-Objektiv ist dem Neofluar-Objektiv sehr ähnlich. Mit Hilfe des Embryotransfers (202 Embryonen) nach LZD (M4 u. M5) konnte die Entwicklungspotenz dieser Embryonen in vivo (45 Nachkommen) gezeigt werden, wobei die Geburtsrate der übertragenen 2-Zeller (27,55 %) (M5) den 1-Zellern (17,31 %) (M4) signifikant überlegen ist. Mit den Methoden 9-11 wurde nachgewiesen, daß im Strahlkegel, in unmittelbarer Nähe zum Laserfokus, die depressive Beeinflussung vergleichbar zur direkten Vorkernmanipulation ist. Der mit steigender Einwirkzeit kontinuierlich sinkenden Entwicklungsfähigkeit bei Laserfokuspositionierung unter der Zelle (M10) steht eine mit kurzen Einwirkzeiten bessere, jedoch mit steigender Einwirkzeit sprunghaft schlechter werdende Entwicklungsfähigkeit bei Laserfokuspositionierung neben den Vorkernen in der Zelle (M11) gegenüber. Bei den Kerntransferexperimenten konnten die Totalausfälle durch Verzicht auf die mechanische Entkernung mit der damit verbundenen Verringerung der Anzahl an Empfängereizellen vermieden werden (nahezu identisches Ausgangsmaterial). Da kein Zytoplasma abgesaugt wurde, bestand ein hoher Anpressdruck auf die sich berührenden Fusionsmembranen von Oozyte und Blastomere, wodurch sich die sehr hohen Fusionsraten im Einzelschritt (G1: 75,2 %; G2: 86,8 %; G3: 97,7 %) erklären lassen. Die signifikant geringere Fusionsrate der Gruppe 1 ist wie die signifikant geringere Teilungsrate (G1:73,9 % versus G2: 92,0 % bzw. G3: 95,2%) auf die Blastomerengewinnung nach LZD zurückzuführen. Die Entwicklungsfähigkeit der Kerntransferembryonen in vitro der Gruppen 1 und 2 ist mit 3,1 % (G1) bzw. 1,9 % (G2) zum 32-Zeller als maximal erreichtes Entwicklungsstadium sehr schlecht. Nach Verringerung der Lasereinwirkzeit auf 2 Sekunden (G3) konnten die Kerntransferembryonen, als erster Erfolg der neuen Methode, mit 40,0 % in vitro das Morulastadium erreichen. Allerdings blieb nach Transfer so erstellter 112 Kerntransferembryonen auf pseudogravide Ammentiere die Geburt von Jungtieren aus. Durch die Verringerung der Pulsfrequenz und Laserenergie in Verbindung mit der gezielten Bearbeitung des gesamten Raumes der Vorkerne sollte eine vollständige Deaktivierung der Vorkerne bei größtmöglicher Schonung des Zytoplasmas möglich sein. Nach Ermittlung dieser Parameter sollten sie zur Entkernung von Metaphase-II-Oozyten verwendet werden. / Laser-microbeam-delivered micromanipulation during nuclear transfer experiments in rabbit oocytes Bohn, Dirk From the Large Animal Clinic for Theriogenology and Ambulatory Services Faculty of Veterinary Medicine, University of Leipzig and the Institute of Animal Breeding and Husbandry with Veterinary Clinic of the Martin-Luther-University, Halle-Wittenberg June, 2001 120 p., 199 ref., 38 tab., 20 fig.; Annex 15 p.: 8 fig., 15 tab. The object of this work was to establish the first time the methods of Laser-microbeam-delivered non-touched opening of the Zona pellucida (known as Laser-Zona-Drilling, LZD) and the functional enucleation of the pronucleus. This methods are efficient and provide a good developmental capability of manipulated cells in comparison to previous used mechanical nuclear transfer methods. The basis for utilising Laser is to know about the effects of the focused laser-microbeam on targeted micromanipulated rabbit oocytes. Therefore, we next analysed in a number of in vivo and in vitro studies the time-dependent influence of laser in three different objectives of the device on or in fertilised oocytes. For this purpose about 863 oocytes in eleven different methods were used. In groups 1-3 (containing 231 oocytes) it was measured in vitro the influence of the objective during LZD, whereas in group 4 and 5 embryo transfer (202 embryos) after LZD was undertaken. In further in vitro studies (group 6-8, 202 oocytes), we were interested on the effects of three objectives on light-microscopic visible pronuclei which were directly manipulated with the laser-focus. Lastly, to follow the different application modus of the laser-focus (groups 9-11, 228 oocytes) the position of the laser-microbeam to the oocytes pronuclei was changed. Based up on these results three defined nuclear transfer groups (G) were built to compare the data of the first methodological validation with unchanged laser parameters (pulse repetition rate, laser energy). Recipient oocytes (pronuclei) of the first two groups (G1: 117; G2: 129) were manipulated with same time-duration of 10 seconds. The difference between both groups were in the isolation of blastomeres which was performed after LZD (G1) or enzymatic (G2). Recipient oocytes of group 3 (134) were merely treated with time-duration of 2 seconds and fused with enzymatic dissociated blastomeres. The nuclear transferred embryos in group 3 have shown the best developmental capability.

In this paper the development, the fabrication and the experimental characterisation of a novel electrodynamic-driven micro-actuator for in plane motions and a novel vertical field effect transistor (vertical FET) is presented. The micro-actuator for motion is based on the Lorentz force generated by a current in a magnetic field. The Lorentz force acting on the actuator can be controlled easily by the amplitude of the current. The vertical FET can be used for signal conversion from the mechanical to the electrical domain.  This low impedance sensing technique was realized by introducing a source and drain region in opposite of a movable mass which acts as the gate.  The channel resistance between drain and source is influenced by the movable mass working as a sensing unit.  Theoretical calculations and practical experiments of the structure are performed. Mechanical and electrical effects over a temperature range of  -40 °C to 180 °C  are investigated. / In dieser Arbeit wird ein neues Aktorarray zur Objektmanipulation und ein neues Verfahren zur Detektion mechanischer Bewegung in Komponenten der oberflächennahen Bulk-Mikromechanik vorgestellt. Die Aktorstrukturen werden mit Hilfe der SCREAM-Technologie hergestellt und arbeiten nach dem elektrodynamischen Wirkprinzip. Bei dem Verfahren zur Bewegungsdetektion wird der aus der Mikroelektronik bekannte Feldeffekt mit mikromechanischen Strukturen gekoppelt. Die Arbeit konzentriert sich auf den Aufbau, die Wirkungsweise und die Technologie der Aktor- und Sensorstrukturen. Diese werden jeweils separat dargestellt und analysiert. Am Ende wird eine Kombination beider Komponenten vorgestellt.

Avdelningen för Cellens Fysik har laboratorier på bland annat Alba Nova Universitetscentrum vid KTH, där utförs forskning på immunförsvaret med NK-celler och T-celler i fokus. Humanceller är heterogena vilket innebär att samma typ av cell kan reagera olika på samma stimuli och exempelvis vara mer eller mindre rörlig. Genom att isolera celler och utföra så kallade singel-cellstudier kan beteende och rörelsemönster kartläggas. Avdelningen för Cellens Fysik, KTH, har utvecklat en mikrotitrerplatta där individuella celler samt cell-cell interaktioner kan studeras. Plattan är i storleksordningen 2×2 cm och innehåller 32 400 mikrobrunnar med måtten 50 µm × 50 µm × 300 µm och är tillverkad i kisel och glas. Teorin är att isolera celler i brunnarna och studera beteendet hos den enskilda cellen för att hitta bäst lämpade cell för uppodling/ klonal expansion inför exempelvis transplantation eller cellterapi. För att plocka upp cellen av intresse från brunnen ska en så kallad Cell-picker användas. Denna består av en datorstyrd sprutpump, med en 100µl spruta som ger ett volymsflöde på 3,75 µl/min, kopplat till ett slangsystem och ett munstycke. Syftet med detta examensarbete var bland annat att kartlägga andra metoder inom området för singel-cell analys/ mikromanipulation och utvärdera om någon av dessa liknade Cell-pickern. Det finns idag tre liknande automatiserade system; AVISO CellCelektor, Cellporter och QPix 400 Microbial Colony Pickers. Dessa system används framförallt för andra typer av analyser och används generellt i grundare brunnar än vad Cell-pickern skulle göra. Beräkningar av hastigheter i mikrofluidiksystemet gjordes för en ny konstruktion av brunn, så kallad U-brunn, där två brunnar är sammankopplade i botten med en genomströmningssektion. För jämförelser av strömning i den idag befintliga enkla brunnen jämfört med de parkopplade brunnarna användes simuleringsverktyget COMSOL Multiphysics 4.2. Jämförelser mellan hastigheter för olika höjd på genomströmningssektionen simuleras för höjderna 0,5, 1,0, 1,5 samt 2,0 µm. Genom simuleringarna kunde flödet i U-brunnen visualiseras för dessa olika tvärsnitt. Detta visade att hastigheter i genomströmningssektionen översteg blodflödets hastighet för höjderna 1,0 µm och 0,5 µm. Jämförelsen med blodflödet gjordes för att utvärdera om hastigheterna i systemet överstiger naturliga hastigheter som celler utsätts för vilket eventuellt skulle kunna skada cellerna. Simuleringarna för U-brunnen visar att det blir ett flöde genom konstruktionen men detta behöver verifieras experimentellt för att visa huruvida detta flöde räcker för att suga upp celler från botten av brunnen. Simuleringarna för den enskilda brunnskonstruktionen påvisade inget flöde vid botten av brunnen vilket antyder att denna konstruktion inte skulle vara lämplig tillsammans med Cell-pickern. Utvärdering av Cell-pickern funktion gjordes genom att hämta vätskeprov ur en mikrotitrerplatta med goda resultat. Senare kunde beads och därefter humana celler flyttas ur brunnarna med Cell-pickern. Då lyckad precisionsanalys gjorts kunde experiment med förflyttning av beads från mikrobrunnar utföras. Även försök med förflyttning av humana celler utfördes med Cell-pickern, detta dock ur större brunnar än 50 µm × 50 µm då Cell-pickerns slangar och munstycke ännu inte är anpassat för den storleken på brunn. Efter utvärdering och modifiering av Cell-pickern är den lättare att manövrera och mer anpassningsbar för olika typer av mikroskop. / The department of Cell Physics has laboratories in Alba Nova University Center at Royal Institute of Technology, which perform research on the immune system focusing on NK cells and T cells. Human cells are heterogeneous, which means that the same type of cell can react differently to stimuli such as being more or less flexible for example. By isolating the cells and perform so-called single cell studies, behavior and movement patterns can be identified. The department of Cell Physics, KTH, has developed a micro titer chip where individual cells and cell-cell interactions can be studied. The chip is made of silicon and glass with the dimensions 2 × 2 cm that contains 32 400 micro wells with dimensions of 50 microns × 50 microns × 300 microns. By isolating the cells in the wells it is possible to study the behavior of the individual cell and to find the most suitable cell for cultivation or clonal expansion used in transplantation or cell therapy. The Cell-picker is supposed to pick up the cell of interest from the well. This cell picker system consists of a syringe pump at a volumetric flow rate of 3.75 μl / min, attached to a tube system and a nozzle. The purpose of this bachelor’s thesis was to briefly summarize other methods in the field of micro manipulation and evaluate if any of these resembled with the cell picker system. There are three similar automated systems available; AVISO CellCelektor, Cell Porter and QPix 400 Microbial Colony Pickers. These systems are mostly used for other types of studies and will generally be used in shallower wells than the Cell-picker would. This thesis also included the calculations of the velocities in the micro fluidic systems of a novel design of wells, so-called U-wells, in which two wells are interconnected at the bottom with a flow section. For comparison of the simulated flow in the existing single well compared to the U-well the simulation software COMSOL Multiphysics 4.2 was used. Four different elevations of the cross section of the U-well were compared. The simulations visualized the flow in the cross section for the elevations 0.5, 1.0, 1.5 and 2.0 microns. This showed that the velocities in the flow section exceeded the rate of blood flow for the elevations 1.0 microns and 0.5 microns. The comparison with blood flow was done to evaluate if the velocities in the system exceeds natural rates cells are exposed to which could potentially damage the cells. The simulations of the U-well structure shows that there is a flow through the system but it has to be evaluated experimentally to see whether that flow is sufficient to pick up the cell on the bottom of the well. The simulations of the simple well structure showed no flow rate at the bottom of the well, suggesting that this design would not be suitable for the Cell-picker. The experimental work contained an evaluation of the Cell-pickers capability to move a fluid sample from a well on a micro titer chip. That was done successfully and the system was able to move beads and human cells from the wells. The Cell-picker was used in larger wells than 50 microns × 50 microns because the Cell-picker tubes and the nozzle are not yet adapted to this size. After evaluation, and modification of the Cell-picker it is now easier to handle and are more adaptable to different types of microscopes.

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Primär kutane Lymphome sind typische Krankheitsbilder in der Dermatologie. Obwohl diese Erkrankungen zu den seltenen Krankheiten zählen, sind sie jedoch von therapeutischem und wissenschaftlichen Interesse. Der erste Teil der Arbeit beschäftigt sich mit der Klassifikation und Therapie primär kutaner Lymphome. Die 1997 veröffentlichte EORTC-Klassifikation wird mit ihren wichtigsten Entitäten erläutert. Die EORTC-Klassifikation geht auf spezifische Besonderheiten der primär kutanen Lymphome ein und orientiert sich an der guten Prognose dieser Erkrankungen. Therapeutische Strategien wie der Einsatz von für kutane Lymphome typische Behandlungsmethoden (PUVA, Exzision, Radiatio) als auch gentechnisch hergestellte Medikamente wie therapeutische Antikörper und Vakzinen werden erklärt. Der zweiten Teil der Habilitationsschrift konzentriert sich auf experimentelle Arbeiten zur molekularbiologischen Untersuchung von primär kutanen Lymphomen. Im Mittelpunkt steht die Methode der Mikromanipulation und Einzelzell-PCR. Für die Mykosis fungoides konnte gezeigt werden, daß im initialen Ekzemstadium nur wenige klonale maligne T-Zellen in der Probe nachzuweisen sind. Mit Zunahme des Infiltrates (Plaque) sind die malignen Zellen in der Epidermis oder gruppiert in der Dermis lokalisiert. Im Tumorstadium dominieren die malignen Zellen das dermale Infiltrat (Gellrich S, J Invest Dermatol, 2000). Die Tumorzellen primär kutaner B-Zell-Lymphome weisen einen dem Keimzentrum ähnlichen Mutationsstatus, nämlich somatische Mutationen und intraklonale Diversifikation, auf (Gellrich S, J Invest Dermatol, 1997; Gellrich S, J Invest Dermatol, 2001). Die Daten sprechen für einen noch aktiven Mutationsmechanismus, sogenannte ongoing mutations (Golembowski S, Immunobiology, 2000). Eine Unterform der kutanen Lymphome stellen die primär kutanen CD30+ T-Zell Lymphome dar. In Untersuchungen mittels Mikromanipulation und Einzelzell-PCR wurden CD30+ Zellen aus primär kutanen CD30+ großzelligen Lymphomen hinsichtlich ihrer T-Zell-Klonalität untersucht. Dabei stellte sich heraus, daß nicht alle atypischen Zellen zur Tumorpopulation gehören. Es wird vermutet, daß ein unbekannter Stimulus zur Ausprägung der Zellmorphe und zur Expression des CD30-Moleküls führt (Gellrich S, J Invest Dermatol, 2003). Eine weitere Entität, bei welcher CD30+ Zellen eine Rolle spielen, ist die lymphomatoide Papulose. In den hier dargestellten Untersuchungen wurden CD30+ große atypische Zellen einzeln isoliert und anschließend mittels PCR für die Gene des T-Zell-Rezeptor-Gamma und des Immunglobulinrezeptors amplifiziert bei einem Patienten mit lymphomatoider Papulose und assoziierter Morbus Hodgkin-Erkankung. In zwei von drei Fällen waren diese CD30+ Zellen polyklonal. Die aus der Fragmentanalyse bekannte klonale T-Zell-Population konnte dagegen in CD3+CD30- kleinen Zellen gefunden werden. In einem dritten Fall enthielten die CD30+ Zellen klonale B-Zellen, welche die gleichen Immunglobulingene rearrangiert hatten wie Zellen aus einem zuvor bestehenden Hodgkin-Lymphom desselben Patienten. Diese Ergebnisse lassen vermuten, dass es für das Aufschießen und die Regredienz der Läsionen der lymphomatoiden Papulose einen Stimulus gibt und die klonalen T- und B-Zellen als Begleitinfiltrat ohne pathologische Bedeutung anzusehen sind. Insgesamt bilden die Daten dieser Arbeit eine Grundlage für eine Fortsetzung der Untersuchung zur Ätiopathogenese von primär kutanen Lymphomen und deren Therapie und bieten die Möglichkeiten vielfältiger wissenschaftlicher Kooperationen. / Primary cutaneous lymphomas present with typical clinical features in dermatology. Although these diseases are rare, they particularly are of scientific and therapeutic interest. The first part of this work deals with the classification and treatment of primary cutaneous lymphomas (PCBCL). The 1997 published EORTC classification will be explained according to the good prognosis of PCBCL. Therapeutic strategies as well as typical procedures (PUVA, excision, irradiation) and gene-technically produced drugs (therapeutic antibodies, vaccination) are illustrated in detail. The second part of this publication focuses on the experimental molecular biological work-out, done in primary cutaneous lymphomas by means of micromanipulation and single cell PCR. For the mycosis fungoides could be shown that in the patch stage only a few malignant T cells can be detected. Increasing infiltrates (plaque-stage) are characterized by epidermotrop or dermally grouped atypical cells. In tumor stage dermal atypical T cells are predominating (Gellrich S, J Invest Dermatol, 2003). The tumor cells of primary cutaneous B cell lymphomas are comparable with the stage of mutation of follicle centre cells: somatic mutations and intraclonal diversity (Gellrich S, J Invest Dermatol, 1997; Gellrich S, J Invest Dermatol, 2001). The data indicate, that there may be an active mutation mechanism, the so-called ongoing mutations (Golembowski S, Immunobiology, 2000). One subgroup of PCBCL, are presented by the CD30positve entities. By means of micromanipulation and PCR, single cells were investigated due to T cell clonality. Not all atypical cells belong to the malignant population. It is supposed that an unknown stimulus leads to morphological features and CD30 expression (Gellrich S, J Invest Dermatol, 2003). Another CD30positive entity is reflected by the lymphomatoid papulosis. In these experiments large atypical CD30positve cells were isolated and have been investigated via PCR for T cell receptor g or immunoglobuline heavy and light chain gene rearrangement. The majority of the large CD30postive cells (two cases) belong to a polyclonal T cell population. In the opposite, the small CD3positive cells are the cells persisting within the T cell clone. In another case B cells with the same immunoglobulin gene rearrangement like in a preceding Hodgkin disease of the same patient could be detected. The data seem to underline the fact that reactive polyclonal CD30positive cells are triggered by an unkown stimulus with clonal bystander cells without any pathological significance. In summary, this work could be the basis for further investigations about the etiopathogenesis of PCBCL.