Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / El ciclo estral de la hembra canina presenta algunas características únicas al ser comparadas con otras especies de mamíferos domésticos. Sin embargo, poco se conoce de las características del desarrollo folicular en relación a otras especies. El Factor de Crecimiento Diferencial 9 (GDF-9) y la Proteína Morfogenética Ósea 15 (BMP-15), son miembros de la superfamilia de Factores de Crecimiento Transformantes Beta (TGF-β), y han demostrado un rol fundamental en el desarrollo folicular en muchas especies. El objetivo de este estudio fue analizar la presencia de ambas proteínas en células foliculares proveniente de folículos antrales del ovario canino mediante citometría de flujo. Se obtuvieron células de la granulosa y del cúmulo a través de aspiración y raspado de folículos antrales de distintos niveles de desarrollo y en distintas etapas del ciclo estral. Las células se fijaron e incubaron con anticuerpo anti GDF-9 humano y anti BMP-15 de ratón (1:100) y anticuerpos secundarios conjugados con FITC y PerCP (1:500), respectivamente. Al análisis por citometría se hizo un Gate discriminatorio por tamaño y complejidad en el Dot plot inicial y adicionalmente se discriminó con marcadores de CD45 para leucocitos y yoduro de propidio (IP) para eritrocitos y debris en los histogramas correspondientes. Los resultados se analizaron con ANOVA y regresión lineal. La expresión de GDF-9 disminuyó (P<0.05) a medida que avanzó el desarrollo folicular en Anestro y Proestro/Estro, pero aumentó (P<0.05) en Diestro. BMP-15 aumentó (P<0.05) su presencia en folículos antrales más desarrollados en la etapa de Anestro, disminuyendo (P<0.05) en Proestro/Estro al alcanzar un mayor nivel de desarrollo. Estas proteínas por tanto, se expresaron en las células foliculares de caninos en distintas etapas del ciclo estral y de manera diferente durante el desarrollo folicular, donde ambas podrían estar relacionadas con las características particulares. / The estrous cycle of the bitch presents unique features when compared to other domestic mammals, however, little is known about the characteristics of the follicular development compared with other species. The Growth Differential Factor 9 (GDF-9) and Bone Morphogenetic Protein 15 (BMP-15) are members of the Transforming Growth Factor (TGF-β) superfamily and have demonstrated an important role during the follicular development of many species. The aim of this study was to analyze the presence of both proteins in the follicular cells from canine ovarian antral follicles by flow cytometry. Granulosa and cumulus cells were obtained by aspiration and scraping of antral follicles from different sizes and stages of the estrous cycle. Cells were fixed and incubated with first antibodies against human GDF-9 and mouse BMP-15 (1:100) and second antibodies conjugated with FITC and PerCP (1:500), respectively. A size and complexity discriminatory gate was used for the cytometryc analysis in the initial dot plot and, additionally, a CD45 marker for leukocyte and Iodum Propide for erythrocyte and debris discrimination in the corresponding histograms. The results were analyzed with ANOVA and lineal regression. GDF-9 expression decreased (P<0,05) during follicular development in Anestrous and Proestrous/Estrous, but increased during Diestrous (P<0,05). BMP-15 expression increased (P<0,05) during follicular development in Anestrous, but decreased in roestrous/Estrous (P<0,05) compared to small and medium sizes. Therefore, these proteins are expressed in canine antral follicle cells during different stages of the estrous cycle and at different levels of develop of the antral follicle, where both may be related to the special features of the bitch. / Financiamiento: Proyecto Fondecyt No. 1140658

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Ciências da Saúde, Programa de Pós-graduação em Nutrição Humana, 2013. / Submitted by Alaíde Gonçalves dos Santos (alaide@unb.br) on 2014-03-06T13:01:49Z No. of bitstreams: 1 2013_JulianaFrossardRibeiroMendes.pdf: 2839735 bytes, checksum: ca26477de3aa9ec18b3d8deba2ed8b8a (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2014-03-06T13:36:37Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2013_JulianaFrossardRibeiroMendes.pdf: 2839735 bytes, checksum: ca26477de3aa9ec18b3d8deba2ed8b8a (MD5) / Made available in DSpace on 2014-03-06T13:36:37Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2013_JulianaFrossardRibeiroMendes.pdf: 2839735 bytes, checksum: ca26477de3aa9ec18b3d8deba2ed8b8a (MD5) / Introdução: As deficiências de vitamina A e ferro são as carências nutricionais mais prevalentes no mundo. Estudos recentes sugerem que existe uma inter-relação entre a vitamina A e o metabolismo do ferro, porém os mecanismos envolvidos ainda não estão esclarecidos. Os retinoides modulam a expressão de diversos genes por meio da ligação aos receptores nucleares, como os receptores de ácido retinoico e receptores de retinoides X. Considerando que a hepcidina é responsável pela regulação sistêmica da homeostase do ferro e tem a sua expressão regulada em parte através da via de sinalização da hemojuvelina-proteína morfogenética do osso 6 - proteínas SMAD, o presente estudo avaliou o efeito da deficiência de vitamina A nos biomarcadores do status de ferro, nos níveis de transcritos de genes envolvidos na via de sinalização HJV-BMP-SMAD, e o possível envolvimento dos receptores nucleares RAR e RXR na manutenção da homeostase de ferro pela vitamina A. Métodos Trinta ratos Wistar machos foram tratados por 59 dias com uma das seguintes dietas: dieta controle; dieta deficiente em vitamina A (VAD); dieta deficiente em ferro (FeD); dieta deficiente em vitamina A e ferro (VAFeD) e dieta com ácido retinoico todo-trans (atRA). Os parâmetros hematológicos foram determinados utilizando kits comerciais. O fígado, intestino e baço foram removidos para determinação da concentração de ferro por espectroscopia de emissão atômica. Os níveis hepáticos de retinol foram quantificados por cromatografia liquida de alta eficiência. No fígado foram determinados os níveis de mRNA da hepcidina (Hamp), hemojuvelina (Hfe2), proteína morfogenêtica do osso 6 (Bmp6), SMAD 7 (Smad7), receptor de ácido retinóico alfa (Rar ∝, receptor de retinoides X beta (Rxrβ), e no intestino os níveis de mRNA do transportador de metal divalente 1 (Dmt1) e ferroportina 1 (Fpn1), por sistema de reação da polimerase em cadeia em tempo-real (qRT-PCR). As comparações entre os grupos de tratamento foram realizadas utilizando teste t-student para amostras independentes e o valor de p < 0,05 foi considerado estatisticamente diferente. Resultados A deficiência de vitamina A (VAD) promoveu a redução dos níveis séricos de ferro e da saturação de transferrina, acúmulo de ferro no baço, aumento dos níveis de mRNA da Bmp6 e Hfe2 e diminuição de Hamp, Smad7 e Rar ∝ no fígado, além da redução dos níveis de mRNA da Fpn1 no intestino. Os ratos tratados com dieta deficiente em ferro (FeD) apresentaram redução dos níveis séricos de ferro, da saturação de transferrina, da concentração de ferro no fígado, intestino e baço e diminuição dos níveis de mRNA de Bmp6, Hfe2, Hamp e Smad7 no fígado. A associação das deficiências de vitamina A e ferro (VAFeD) promoveu a redução dos níveis séricos de ferro, da saturação de transferrina, da concentração de ferro no fígado, intestino e baço e dos níveis hepáticos de mRNA da Hamp e Smad7. A substituição do estér de retinil pelo atRA na dieta promoveu uma redução dos níveis séricos de ferro, aumento da concentração de ferro no fígado e redução no intestino e baço, também apresentaram diminuição dos níveis de mRNA hepáticos de Hamp e aumento de Rar ∝, além de reduzir os níveis de mRNA de Dmt1, Fpn1e aumentar o Bmp6 no intestino. Conclusão Os resultados do presente estudo sugerem que a deficiência dietética de vitamina A promove uma redução da disponibilidade sistêmica de ferro com concomitante acúmulo desse micronutriente no baço. A deficiência sistêmica de ferro promovida pela deficiência de vitamina A, diminui a disponibilidade de ferro para a eritropoiese, sugerindo que o sinal eritróide prevaleça na regulação da expressão de Hamp. Os resultados sugerem ainda que a deficiência de vitamina A modula a transcrição da hepcidina no fígado de maneira indireta, não envolvendo o receptor Rar ∝. ________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Introduction Vitamin A and iron deficiencies of are the most prevalent nutritional deficiencie in the world. Although recent studies suggest that there is an interrelationship between vitamin A and iron metabolism, the mechanisms involved remain unclear. Retinoids modulate the expression of various genes by binding to nuclear receptors such as the retinoic acid receptors and retinoid X receptors. Whereas hepcidin is responsible for regulating systemic iron homeostasis and its expression is regulated in part through the signaling pathway of hemojuvelin-bone morphogenetic protein 6 - SMAD proteins, the present study evaluated the effect of vitamin A deficiency in iron status biomarkers, the transcript levels of genes involved in signaling pathway HJV-BMP-SMAD, and the possible involvement of nuclear receptors, RAR and RXR in the maintenance of iron homeostasis by vitamin A. Methods Thirty male Wistar rats were treated for 59 days with one of the following diets: control diet; vitamin A deficient diet (VAD); iron deficient diet (FeD); vitamin A and iron deficient diet (VAFeD) and the all-trans retinoic acid diet (atRA). Hematological parameters were obtained using commercial kits. Liver, intestine and spleen were removed for determination of iron concentration by atomic emission spectroscopy. The retinol hepatic levels were obtained by high performance liquid chromatography. Were determined in liver and intestine, the mRNA levels of hepcidin (Hamp), hemojuvelin (Hfe2), bone morphogenetic protein 6 (Bmp6), SMAD 7 (Smad7), retinoic acid receptor alpha (Rar? receiver retinoid X beta (Rxr?), divalent metal transporter 1 (Dmt1) and ferroportin 1 (Fpn1), system by polymerase chain reaction in realtime (qRT-PCR). Comparisons among the test groups were done using independent sample test t-test and in all tests, a value of p < 0.05 was considered statistically significant. Results Vitamin A deficiency (VAD) caused a decrease in serum iron and transferrin saturation, spleen iron accumulation, increased of Bmp6 and Hfe2 mRNA levels and decreased Hamp, Smad7 and Rar ? in liver, and the reduction mRNA levels of Fpn1 in the intestine. The rats treated with iron deficient diet (FeD) decreased serum iron levels, transferrin saturation, iron concentrations in the liver, intestine, and spleen and decreased of Bmp6, Hfe2, Hamp and Smad7 mRNA levels in liver. The association of vitamin A and iron deficiency (VAFeD) also caused a decrease in serum iron, transferrin saturation, iron concentrations in the liver, intestine and spleen, and Hamp and Smad7 mRNA hepatic levels. The replacement of retinyl ester by atRA in diet (atRA) caused a decrease in serum iron levels, increased iron concentrations in the liver and spleen, decreased iron concentrations in the intestine, lower Hamp and increased Rar? hepatic mRNA levels and, reduced Dmt1 and Fpn1 mRNA levels with increased Bmp6 in intestine. Conclusion The results of this study suggest that dietary vitamin A deficiency promotes a reduction in iron systemic availability with concomitant spleen accumulation. Systemic iron deficiency promoted by vitamin A deficiency, reduces the iron availability for erythropoiesis, suggesting that the erythroid signal prevail in the regulation of Hamp transcription. The results suggest that vitamin A deficiency modulates hepcidin expression in the liver in an indirect way, not involving the Rar∝.

Este estudo analisou a influência de diferentes superfícies de titânio na adesão, proliferação e diferenciação de células semelhantes a osteoblastos de rato (osteo-1) em culturas, na presença ou não da proteína morfogenética óssea recombinante-2 (rhBMP-2). As células osteo-1 foram cultivadas sobre as seguintes superfícies de titânio: 1. superfície lisa, 2. superfície desgastada com partículas de areia e condicionamento ácido (SLA) e 3. superfície desgastada com partículas de areia e condicionamento ácido sob proteção de nitrogênio e armazenadas em solução isotônica de cloreto de sódio (SLActive), na presença ou não de 20 ng/ml de rhBMP-2. Foram analisadas a adesão celular em 24 horas, o conteúdo total de proteínas, o conteúdo de colágeno e a atividade de fosfatase alcalina em 7, 14 e 21 dias e a formação de nódulos calcificados em 21 dias. Os resultados mostraram que a adesão não foi influenciada nem pelo tipo de superfície nem pelo tratamento com rhBMP-2 (p=0,0936). Quando relacionamos o conteúdo total de proteínas ao número total de células, percebemos que a proliferação não foi influenciada pelo tipo de superfície de titânio, porém a adição de rhBMP-2 levou a uma redução estatisticamente significante na superfície SLA aos 21 dias (p=0,0000). Em relação à diferenciação, pudemos observar que o tipo de superfície não influenciou o conteúdo total de proteínas, o conteúdo de colágeno e a formação de nódulos calcificados em quaisquer dos períodos analisados. A atividade de fosfatase alcalina somente foi influenciada pelo tipo de superfície aos 14 dias, onde o grupo C/SLAactive apresentou valores inferiores ao grupo C/Liso (p=0,0000). A adição de rhBMP-2 promoveu uma maior influência sobre o processo de diferenciação, levando a uma redução estatisticamente significante no conteúdo total de proteínas na superfície SLA aos 21 dias (p=0,0000), a um aumento estatisticamente significante no conteúdo de colágeno na superfície SLActive no período de 7 dias (p=0,0005) e a uma diminuição estatisticamente significante na atividade de fosfatase alcalina na superfície lisa nos períodos de 14 e 21 dias, na superfície SLA aos 14 dias e na superfície SLActive aos 21 dias (p=0,0000). Somente a formação de nódulos calcificados não sofreu influência da adição de rhBMP-2. / This study has analyzed the influence of different titanium surfaces in the adhesion, proliferation and differentiation of rat osteoblast-like cells (osteo-1 culture), in the presence or not, of the recombinant bone morphogenetic protein-2 (rhBMP-2). The osteo-1 cells were grown on the following titanium surfaces: 1. smooth surface; 2. coarse grit-blasted and acid-etched surface (SLA); and 3. coarse grit-blasted and acid-etched surface under nitrogen protection, and stored in sodium chloride isotonic solution (SLActive), in the presence or not, of 20 ng/ml of rhBMP-2. It was analyzed the cell adhesion in 24 hours, the total protein content, the collagen content, and the alkaline phosphatase in 7, 14 and 21-day periods, and also the formation of calcified nodules in 21 days. The results showed that the adhesion was neither influenced by the surface type, nor by the treatment with rhBMP-2 (p=0.0936). When we related the total protein content to the total number of cells, we noticed that the proliferation was not influenced by the titanium surface type; however, the addition of rhBMP-2 led to a statistically significant reduction on the SLA surface at 21 days (p=0.0000). Concerning the differentiation, we could observe that the surface type did not influence the total content of proteins, the collagen content and the formation of calcified nodules in any of the analyzed periods. The alkaline phosphatase activity was only influenced by the surface type at 14 days, where the group C/SLActive presented lower values than the group C/Smooth (p=0.0000). The addition of rhBMP- 2 promoted a bigger influence over the differentiation process, thus leading to a statistically significant reduction in the total protein content on the SLA surface at 21 days (p=0.0000), a statistically significant increase in the collagen content on the surface SLActive in the 7-day period (p=0.0005), a statistically significant reduction in the alkaline phosphatase activity on the smooth surface in the 14 and 21-day periods, on the SLA surface at 14 days, and on the SLActive surface at 21 days (p=0.0000). Only the formation of calcified nodules did not undergo influence of the rhBMP-2 addition.

Devido as limitações relacionadas ao emprego do enxerto autólogo, o uso dos biomateriais poliméricos naturais tornou-se uma opção viável em terapias regenerativas do tecido ósseo. O objetivo desse trabalho é avaliar de forma qualitativa e quantitiva a contribuição da membrana de elastina utilizada isoladamente ou em associação a hidroxiapatita e proteína morfogenética óssea, no reparo de defeitos ósseos no crânio de ratos. Foram utilizados 49 ratos (Rattus norvegicus, Wistar), machos, com peso aproximado de 330 gramas e 4 meses de idade. Os animais foram submetidos ao procedimento cirúrgico para a criação do defeito ósseo no osso parietal esquerdo e divididos em 7 grupos com 7 animais cada. Os grupos foram implantados com os seguintes bioamateriais: grupo 1 controle (G1-C) sem implante, grupo 2 (G2-E24h) membrana de elastina 24 h, grupo 3 (G3-E24h/HA) membrana de elastina 24 h com hidroxiapatita, grupo 4 (G4-E24h/BMP) membrana de elastina 24 h com proteína morfogenética óssea, grupo 5 (G5-E96h) membrana de elastina 96 h, grupo 6 (G6-E96h/HA) membrana de elastina 96 h com hidroxiapatita, grupo 7 (G7-E96h/BMP) membrana de elastina 96 h com proteína morfogenética óssea. Após a morte indolor induzida em 6 semanas, as calotas cranianas foram retiradas para análise macroscópica, radiográfica, histológica e morfométrica. As análises macroscópicas, radiográficas e histológicas demonstraram a biocompatibilidade dos biomateriais utilizados. As médias e desvios-padrão do volume percentual relativo de osso neoformado nos defeitos cranianos dos grupos G1 a G7 foram 7,87±2,53; 24,01±0,55; 9,59±1,27; 31,31±6,37; 19,77±2,62; 7,31±2,43; 43,25±3,72, respectivamente. Os biomateriais mostraram-se biocompatíveis e o grupo 7 (G7-E96h/BMP) resultou na maior neoformação óssea. / Due to the limitations related to the use of autologous grafts, the use of natural polymeric biomaterials has become a viable option in regenerative therapies of bone tissue. The objective of this dissertation is to evaluate in qualitative and quantitative way the contribution of the elastin matrice used alone or in combination with hydroxyapatite and bone morphogenetic protein in the repair of bone defects in the skull of rats. Were use 49 Mices (Rattus norvegicus, Wistar), weighting approximately 330 grams and 4 months of age, were used. The animals were submitted to the surgical procedure to create the bone defect in the left parietal bone and divided into 7 groups with 7 animals each. The groups were implanted with the following biomaterials: group 1 control (G1-C) without biomaterial, group 2 (G2-E24h) 24 h elastin membrane, group 3 (G3-E24h/HA) 24 h elastin membrane with hydroxyapatite, Group 4 (G4-E24h/BMP) elastin membrane 24 h with bone morphogenetic protein, group 5 (G5-E96h) elastin membrane 96 h, group 6 (G6- E96h/HA) elastin membrane 96 h with hydroxyapatite, group 7 (G7-E96h/BMP) 96 h elastin membrane with bone morphogenetic protein. After painless death induced at 6 weeks, the skull caps were removed for macroscopic, radiographic, histological and morphometric analysis. Macroscopic, radiographic and histological analysis demonstrated the biocompatibility of the biomaterials used. The mean and standard deviations of the relative percentage volume of newly formed bone in the cranial defects of the G1 to G7 groups were 7,87±2,53; 24,01±0,55; 9,59±1,27; 31,31±6,37; 19,77±2,62; 7,31±2,43; 43,25±3,72, respectively. The implanted biomaterials were shown to be biocompatible and the group 7 (G7-E96h/BMP) resulted with greater bone neoformation.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:23:43Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009-05-29Bitstream added on 2014-06-13T18:19:52Z : No. of bitstreams: 1 zanetti_nm_me_jabo.pdf: 847982 bytes, checksum: c0960b3258ff6b50bfdd4f45e2574a53 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Este estudo teve como objetivo avaliar comparativamente os efeitos do emprego do ultrassom pulsado de baixa intensidade e da proteína morfogenética óssea (rhBMP-2) sobre a consolidação do osso in vivo. Foram realizadas ostectomias bilaterais do rádio de 24 coelhos machos, da raça Nova Zelândia Branco, seguido da análise qualitativa (avaliação clínica, histológica e radiográfica) e quantitativa (histomorfometria óssea e bioquímica) da falha óssea preenchida ou não com gel de quitosana. Denominaram-se seis grupos experimentais com quatro animais cada (GI – grupo controle, GII – grupo ultrassom, GIII – grupo quitosana, GIV – grupo quitosana e ultrassom, GV – grupo quitosana e rhBMP-2 e GVI – grupo quitosana, rhBMP-2 e ultrassom). As avaliações radiográficas e a mensuração da fosfatase alcalina sérica foram executadas durante o período experimental. Os fragmentos de tecido provenientes da falha óssea dos coelhos sacrificados no 30o e 45o dia foram submetidos à avaliação histológica e histomorfométrica. Os diferentes métodos de avaliação empregados neste estudo demonstraram que o preenchimento do defeito ósseo foi superior nos casos em que foi empregada a terapia ultrassônica associada à implantação do gel ativado com a proteína osteoindutora. Os coelhos que receberam o implante livre da proteína (GIII e GIV) tiveram o processo de reparo ósseo comprometido. Foi possível concluir que o ultrassom acelerou o preenchimento da falha óssea e que o gel de quitosana, embora tenha induzido processo inflamatório, foi capaz de carrear a rhBMP-2, permitindo a ação sinérgica entre o ultrassom e a proteína. / This comparative study evaluated in vivo responses of bone healing under low intensity pulsed ultrasound and bone morphogenetic protein (rhBMP-2) treatment in experimental bone defects filled or not with chitosan gel. Twenty four New Zealand White rabbits were assigned in six experimental groups, four animals each (GI – control group, GII – ultrasound group, GIII – chitosan group, GIV – chitosan plus ultrasound group, GV – chitosan with rhBMP-2 and GVI – chitosan with rhBMP-2 plus ultrasound). It was performed a qualitative (radiographic, histological and clinical evaluation) and quantitative research (histomorphometrical and biochemical analysis) of bone healing. The radiographic and serum alkaline phosphatase evaluation was performed during the experimental period. Histological and bone histomorphometry was applied for bone sample evaluation from sacrificed rabbits (30th and 45th days). The different evaluation methods used in this study showed that defect filling was improved when the treatment was based on the association between ultrasound and activated chitosan gel. The bone defects filled with non-activated gel (GIII and GIV) showed a delay in bone healing. This study had demonstrate that low intensity ultrasound improves bone healing process, that chitosan gel is a good carrier for rhBMP-2 even when it induced an inflammatory reaction, allowing a synergetic effect between ultrasound and protein.

Este estudo analisou a influência de diferentes superfícies de titânio na adesão, proliferação e diferenciação de células semelhantes a osteoblastos de rato (osteo-1) em culturas, na presença ou não da proteína morfogenética óssea recombinante-2 (rhBMP-2). As células osteo-1 foram cultivadas sobre as seguintes superfícies de titânio: 1. superfície lisa, 2. superfície desgastada com partículas de areia e condicionamento ácido (SLA) e 3. superfície desgastada com partículas de areia e condicionamento ácido sob proteção de nitrogênio e armazenadas em solução isotônica de cloreto de sódio (SLActive), na presença ou não de 20 ng/ml de rhBMP-2. Foram analisadas a adesão celular em 24 horas, o conteúdo total de proteínas, o conteúdo de colágeno e a atividade de fosfatase alcalina em 7, 14 e 21 dias e a formação de nódulos calcificados em 21 dias. Os resultados mostraram que a adesão não foi influenciada nem pelo tipo de superfície nem pelo tratamento com rhBMP-2 (p=0,0936). Quando relacionamos o conteúdo total de proteínas ao número total de células, percebemos que a proliferação não foi influenciada pelo tipo de superfície de titânio, porém a adição de rhBMP-2 levou a uma redução estatisticamente significante na superfície SLA aos 21 dias (p=0,0000). Em relação à diferenciação, pudemos observar que o tipo de superfície não influenciou o conteúdo total de proteínas, o conteúdo de colágeno e a formação de nódulos calcificados em quaisquer dos períodos analisados. A atividade de fosfatase alcalina somente foi influenciada pelo tipo de superfície aos 14 dias, onde o grupo C/SLAactive apresentou valores inferiores ao grupo C/Liso (p=0,0000). A adição de rhBMP-2 promoveu uma maior influência sobre o processo de diferenciação, levando a uma redução estatisticamente significante no conteúdo total de proteínas na superfície SLA aos 21 dias (p=0,0000), a um aumento estatisticamente significante no conteúdo de colágeno na superfície SLActive no período de 7 dias (p=0,0005) e a uma diminuição estatisticamente significante na atividade de fosfatase alcalina na superfície lisa nos períodos de 14 e 21 dias, na superfície SLA aos 14 dias e na superfície SLActive aos 21 dias (p=0,0000). Somente a formação de nódulos calcificados não sofreu influência da adição de rhBMP-2. / This study has analyzed the influence of different titanium surfaces in the adhesion, proliferation and differentiation of rat osteoblast-like cells (osteo-1 culture), in the presence or not, of the recombinant bone morphogenetic protein-2 (rhBMP-2). The osteo-1 cells were grown on the following titanium surfaces: 1. smooth surface; 2. coarse grit-blasted and acid-etched surface (SLA); and 3. coarse grit-blasted and acid-etched surface under nitrogen protection, and stored in sodium chloride isotonic solution (SLActive), in the presence or not, of 20 ng/ml of rhBMP-2. It was analyzed the cell adhesion in 24 hours, the total protein content, the collagen content, and the alkaline phosphatase in 7, 14 and 21-day periods, and also the formation of calcified nodules in 21 days. The results showed that the adhesion was neither influenced by the surface type, nor by the treatment with rhBMP-2 (p=0.0936). When we related the total protein content to the total number of cells, we noticed that the proliferation was not influenced by the titanium surface type; however, the addition of rhBMP-2 led to a statistically significant reduction on the SLA surface at 21 days (p=0.0000). Concerning the differentiation, we could observe that the surface type did not influence the total content of proteins, the collagen content and the formation of calcified nodules in any of the analyzed periods. The alkaline phosphatase activity was only influenced by the surface type at 14 days, where the group C/SLActive presented lower values than the group C/Smooth (p=0.0000). The addition of rhBMP- 2 promoted a bigger influence over the differentiation process, thus leading to a statistically significant reduction in the total protein content on the SLA surface at 21 days (p=0.0000), a statistically significant increase in the collagen content on the surface SLActive in the 7-day period (p=0.0005), a statistically significant reduction in the alkaline phosphatase activity on the smooth surface in the 14 and 21-day periods, on the SLA surface at 14 days, and on the SLActive surface at 21 days (p=0.0000). Only the formation of calcified nodules did not undergo influence of the rhBMP-2 addition.

O tecido ósseo é considerado um tecido complexo e possui alta capacidade de reparação espontânea quando lesionado. Entretanto, em algumas patologias esta capacidade pode estar comprometida por diversos fatores extrínsecos e intrínsecos ao organismo. Em decorrência de sua capacidade plástica, o uso de células-tronco para terapia celular regenerativa tem se tornado uma importante ferramenta no tratamento de lesões ósseas e de doenças decorrentes da perda da densidade mineral óssea (DMO). Em contraste, o uso da Proteína Morfogenética Óssea (BMP) ganhou grande destaque pela sua eficácia em tratar doenças ósseas de caráter crônico e, quando associadas a células-tronco, trouxe um melhor resultado para tais desordens. Assim, o presente trabalho teve como objetivo avaliar a associação de célula-tronco mesenquimal de medula óssea (MSC Mesenchymal Stem Cells) e BMP-7 na regeneração óssea a partir de defeito ósseo induzido na calvária murina no 60º dia de tratamento. Foram realizadas imagens radiográficas da calvária e, após os dias estipulados, o material foi coletado para análise de microscópica. Os dados obtidos sugerem que o modelo de regeneração óssea proposto foi apropriado para avaliar a resposta terapêutica usando MSC e BMP-7, onde o cultivo e pré-diferenciação de MSC com BMP-7 produziu melhores resultados do que os outros tratamentos realizados / Bone tissue is considered a complex tissue and has high capacity for spontaneous recovery when injured. However, in some conditions this capacity can be compromised by several extrinsic and intrinsic factors to the body. Due to its plastic capacity, the use of stem cells for regenerative cell therapy has become an important tool in the treatment of bone injuries and diseases resulting from loss of bone mineral density (BMD). In contrast, the use of Bone Morphogenetic Protein (BMP) has gained wide attention for its effectiveness in treating bone diseases were chronic and brought a better outcome for such disorders when associated with stem cells. Thus, the present study aimed to evaluate the association of bone marrow mesenchymal stem cells (MSC) and BMP-7 in bone regeneration from bone defects induced in murine calvaria on the 60th day of treatment. Radiographic images of the calvaria were performed and after the stipulated days the material was collected for microscopic essays. The data obtained suggest that the proposed model of bone regeneration was appropriate to assess the therapeutic response using MSC and BMP-7, where the pre cultivation and differentiation of MSCs with BMP-7 produced better results than the other treatments performed.

Devido as limitações relacionadas ao emprego do enxerto autólogo, o uso dos biomateriais poliméricos naturais tornou-se uma opção viável em terapias regenerativas do tecido ósseo. O objetivo desse trabalho é avaliar de forma qualitativa e quantitiva a contribuição da membrana de elastina utilizada isoladamente ou em associação a hidroxiapatita e proteína morfogenética óssea, no reparo de defeitos ósseos no crânio de ratos. Foram utilizados 49 ratos (Rattus norvegicus, Wistar), machos, com peso aproximado de 330 gramas e 4 meses de idade. Os animais foram submetidos ao procedimento cirúrgico para a criação do defeito ósseo no osso parietal esquerdo e divididos em 7 grupos com 7 animais cada. Os grupos foram implantados com os seguintes bioamateriais: grupo 1 controle (G1-C) sem implante, grupo 2 (G2-E24h) membrana de elastina 24 h, grupo 3 (G3-E24h/HA) membrana de elastina 24 h com hidroxiapatita, grupo 4 (G4-E24h/BMP) membrana de elastina 24 h com proteína morfogenética óssea, grupo 5 (G5-E96h) membrana de elastina 96 h, grupo 6 (G6-E96h/HA) membrana de elastina 96 h com hidroxiapatita, grupo 7 (G7-E96h/BMP) membrana de elastina 96 h com proteína morfogenética óssea. Após a morte indolor induzida em 6 semanas, as calotas cranianas foram retiradas para análise macroscópica, radiográfica, histológica e morfométrica. As análises macroscópicas, radiográficas e histológicas demonstraram a biocompatibilidade dos biomateriais utilizados. As médias e desvios-padrão do volume percentual relativo de osso neoformado nos defeitos cranianos dos grupos G1 a G7 foram 7,87±2,53; 24,01±0,55; 9,59±1,27; 31,31±6,37; 19,77±2,62; 7,31±2,43; 43,25±3,72, respectivamente. Os biomateriais mostraram-se biocompatíveis e o grupo 7 (G7-E96h/BMP) resultou na maior neoformação óssea. / Due to the limitations related to the use of autologous grafts, the use of natural polymeric biomaterials has become a viable option in regenerative therapies of bone tissue. The objective of this dissertation is to evaluate in qualitative and quantitative way the contribution of the elastin matrice used alone or in combination with hydroxyapatite and bone morphogenetic protein in the repair of bone defects in the skull of rats. Were use 49 Mices (Rattus norvegicus, Wistar), weighting approximately 330 grams and 4 months of age, were used. The animals were submitted to the surgical procedure to create the bone defect in the left parietal bone and divided into 7 groups with 7 animals each. The groups were implanted with the following biomaterials: group 1 control (G1-C) without biomaterial, group 2 (G2-E24h) 24 h elastin membrane, group 3 (G3-E24h/HA) 24 h elastin membrane with hydroxyapatite, Group 4 (G4-E24h/BMP) elastin membrane 24 h with bone morphogenetic protein, group 5 (G5-E96h) elastin membrane 96 h, group 6 (G6- E96h/HA) elastin membrane 96 h with hydroxyapatite, group 7 (G7-E96h/BMP) 96 h elastin membrane with bone morphogenetic protein. After painless death induced at 6 weeks, the skull caps were removed for macroscopic, radiographic, histological and morphometric analysis. Macroscopic, radiographic and histological analysis demonstrated the biocompatibility of the biomaterials used. The mean and standard deviations of the relative percentage volume of newly formed bone in the cranial defects of the G1 to G7 groups were 7,87±2,53; 24,01±0,55; 9,59±1,27; 31,31±6,37; 19,77±2,62; 7,31±2,43; 43,25±3,72, respectively. The implanted biomaterials were shown to be biocompatible and the group 7 (G7-E96h/BMP) resulted with greater bone neoformation.

O tecido ósseo é considerado um tecido complexo e possui alta capacidade de reparação espontânea quando lesionado. Entretanto, em algumas patologias esta capacidade pode estar comprometida por diversos fatores extrínsecos e intrínsecos ao organismo. Em decorrência de sua capacidade plástica, o uso de células-tronco para terapia celular regenerativa tem se tornado uma importante ferramenta no tratamento de lesões ósseas e de doenças decorrentes da perda da densidade mineral óssea (DMO). Em contraste, o uso da Proteína Morfogenética Óssea (BMP) ganhou grande destaque pela sua eficácia em tratar doenças ósseas de caráter crônico e, quando associadas a células-tronco, trouxe um melhor resultado para tais desordens. Assim, o presente trabalho teve como objetivo avaliar a associação de célula-tronco mesenquimal de medula óssea (MSC Mesenchymal Stem Cells) e BMP-7 na regeneração óssea a partir de defeito ósseo induzido na calvária murina no 60º dia de tratamento. Foram realizadas imagens radiográficas da calvária e, após os dias estipulados, o material foi coletado para análise de microscópica. Os dados obtidos sugerem que o modelo de regeneração óssea proposto foi apropriado para avaliar a resposta terapêutica usando MSC e BMP-7, onde o cultivo e pré-diferenciação de MSC com BMP-7 produziu melhores resultados do que os outros tratamentos realizados / Bone tissue is considered a complex tissue and has high capacity for spontaneous recovery when injured. However, in some conditions this capacity can be compromised by several extrinsic and intrinsic factors to the body. Due to its plastic capacity, the use of stem cells for regenerative cell therapy has become an important tool in the treatment of bone injuries and diseases resulting from loss of bone mineral density (BMD). In contrast, the use of Bone Morphogenetic Protein (BMP) has gained wide attention for its effectiveness in treating bone diseases were chronic and brought a better outcome for such disorders when associated with stem cells. Thus, the present study aimed to evaluate the association of bone marrow mesenchymal stem cells (MSC) and BMP-7 in bone regeneration from bone defects induced in murine calvaria on the 60th day of treatment. Radiographic images of the calvaria were performed and after the stipulated days the material was collected for microscopic essays. The data obtained suggest that the proposed model of bone regeneration was appropriate to assess the therapeutic response using MSC and BMP-7, where the pre cultivation and differentiation of MSCs with BMP-7 produced better results than the other treatments performed.

O objetivo do atual trabalho, foi correlacionar os eventos celulares e teciduais com a expressão das proteínas VEGF, BMP-7, RANKL e OPG durante a osteogênese ectópica e ortotópica, induzida pela matriz óssea (MO) e dentinária (MD) alogênica. Matrizes alogênicas desmineralizada em HCl a 0,6N, obtidas de fêmur e incisivo de ratos, fori implantada entre as fáscias musculares da coxa e em defeito trans-ósseo de 8mm de diâmetro nos ossos parietais. As análises radiográfica e histomorfométrica da neoformação óssea e, a imunohistoquímica e o western blotting para as proteínas VEGF, BMP, RANKL e OPG, mostraram que: a) o volume da região do enxerto nos sítios ortotópicos reduziu 19% em 42 dias; b) em ambos tipos de enxerto e locais de implantação, ocorreu formação de tecido cartilaginoso e ósseo; c) nos sítios intramusculares, a reabsorção da matriz alogênica e a remodelação do tecido cartilaginoso, ósseo e medular foi mais acelerado, em relação a implantação ortotópico; d) o aumento na densidade de volume dos vasos sanguíneos e no número de osteoblastos/osteócitos e osteoclastos ocorreu simultaneamente e estava associado à maior reabsorção da matriz alogênica e à formação do tecido medular (hematopoiético); e) as proteínas VEGF, BMP-7, RANKL, OPG foram expressas em condrócitos, osteoblastos ativos, osteócitos recém aprisionados na matriz e em células estromais próximas aos osteoblastos ou às áreas da matriz alogênica reabsorvida; e f) a expressão das proteínas VEGF, BMP-7, RANKL e OPG foi maior no grupo MO. O pico de expressão dessas proteínas ocorreu nos períodos de 14 aos 21 dias no grupo da MO e 21 e 28 dias no grupo da MD. Concluímos que, a capacidade osteoindutora da matriz alogênica desmineralizada está relacionado a origem da matriz e ao sítio de implantação e que, as proteínas VEGF, BMP-7, RANKL e OPG estão associadas a maior reabsorção da matriz implantada, promovendo uma rápida e contínua liberação dos morfógenos contidos em seu interior que, induzem temporal e espacialmente a formação óssea/medular. / The aim of the present work was to correlate the cellular and tissue events with the expression of VEGF, BMP-7, RANKL and OPG during ectopic and orthotopic osteogenesis, induced by bone and dentin allogeneic matrix. Allogenic matrices obtained from femur and incisor of rats and demineralized in 0.6 N HCl were implanted into a intramuscular pocket and a 8mm-diameter bone defect in the skull. The radiographic and histomorphometric analysis of new bone formation, and immunohistochemistry and western blotting for VEGF, BMP, RANKL and OPG proteins, showed that: a) the total volume of the graft region in orthotopic site decreased 19% at 42 days b) in both graft types and implantation sites occurred formation of cartilaginous and bone tissues, c) in intramuscular sites, the resorption of allogenic matrix and remodeling of the new formed cartilage and bone were faster, in relation to orthotopic implantation sites; d) the increase in the volume density of blood vessels and in the number of osteoblasts/osteocytes and osteoclasts occurred simultaneously and was associated with greater reabsorption of the allogenic matrix and hematopoietic bone marrow formation; e) VEGF, BMP-7, RANKL, OPG proteins were expressed in chondrocytes, active osteoblasts, newly osteocytes confined and stromal cells located near the osteoblasts or in the surface of the reabsorbed matrix; and f) the VEGF, BMP-7, RANKL and OPG expression was higher in MO grafts than in the MD. The peak of expression of these proteins each occurred at 14 and 21 days in MO and 21 and 28 days in MD. We concluded that, the osteoinductive capacity of allogeneic demineralized matrix is related to matrix origin and implantation site and that the VEGF, BMP-7, RANKL and OPG proteins are associated with greater reabsorption of the implanted matrix, promoting rapid and continuous matrix-release morphogens that induces spatially and temporally the bone and bone marrow formation.