This document is a critical synopsis of prior work by Michael Dwyer submitted in support of a PhD by published work. The selected work is focused on the application of quantitative magnet resonance imaging (MRI) analysis techniques to the study of multiple sclerosis (MS). MS is a debilitating disease with a multi-factorial pathology, progression, and clinical presentation. Its most salient feature is focal inflammatory lesions, but it also includes significant parenchymal atrophy and microstructural damage. As a powerful tool for in vivo investigation of tissue properties, MRI can provide important clinical and scientific information regarding these various aspects of the disease, but precise, accurate quantitative analysis techniques are needed to detect subtle changes and to cope with the vast amount of data produced in an MRI session. To address this, eight new techniques were developed by Michael Dwyer and his co-workers to better elucidate focal, atrophic, and occult/"invisible" pathology. These included: a method to better evaluate errors in lesion identification; a method to quantify differences in lesion distribution between scanner strengths; a method to measure optic nerve atrophy; a more precise method to quantify tissue-specific atrophy; a method sensitive to dynamic myelin changes; and a method to quantify iron in specific brain structures. Taken together, these new techniques are complementary and improve the ability of clinicians and researchers to reliably assess various key elements of MS pathology in vivo.

But : La perte de l’intégrité de la barrière hémo-encéphalique (BHE) est l’une des caractéristiques principales de la sclérose en plaques. Cette augmentation de la perméabilité est associée à une désorganisation des molécules de jonction serrée et à une augmentation de l’expression de molécules d’adhérence essentielles à l’extravasation des cellules immunitaires. Identifier de nouvelles molécules impliquées dans ce processus est donc crucial pour le développement de nouvelles thérapies contre la sclérose en plaques visant à promouvoir l’intégrité de la BHE et à diminuer la migration des leucocytes dans le système nerveux central (SNC) au cours du processus neuro-inflammatoire. Dans cette étude, le rôle spécifique de la molécule d’adhérence ALCAM, qui est exprimé à la surface des cellules endothéliales de la BHE (CE-BHE) et de certains sous-types de leucocytes, a été évalué. Méthodologie : À l’aide d’une analyse protéomique exhaustive, notre laboratoire a identifié ALCAM comme étant une molécule d’adhérence surexprimée par les CE-BHE mises en culture dans un milieu pro-inflammatoire. Dans le but d’étudier le rôle spécifique d’ALCAM durant la diapédèse leucocytaire, nous avons induit chez des souris de type sauvages et des souris ALCAM déficientes l’encéphalite auto-immune expérimentale (EAE), le modèle animal de la sclérose en plaques. Le rôle d’ALCAM a aussi été étudié à l’aide d’un système d’adhérence sous flux laminaire. Cet appareil, qui imite un capillaire cérébral, permet de suivre en temps réel le mouvement des leucocytes, soumis à une pression physiologique, dans un tube couvert à sa base par des CE-BHE. Résultats : En utilisant ce système d’adhérence, j’ai pu démontrer que des anticorps dirigés contre ALCAM réduisent de façon significative le roulement et l’adhérence de monocytes CD14+ humains à la surface de CE-BHE. Par ailleurs, ces anticorps préviennent de façon marquée la diminution de la vitesse moyenne des cellules au cours de l’expérience. Par le fait même, j’ai aussi observé une réduction significative de l’extravasation des monocytes traités avec de l’anti-ALCAM au travers de CE-BHE dans un modèle statique de migration. Subséquemment, j’ai démontré que ces monocytes migrent plus rapidement et en plus grand nombre au travers d’une barrière constituée de cellules endothéliales méningées à comparer à des CE-BHE. Bien que des observations similaires ont été effectuées en utilisant des lymphocytes T CD4+ humains ex vivo, j’ai été incapable de reproduire ces résultats à l’aide de cellules Th1 et Th17 réactivées in vitro. Par opposition à nos données in vitro, j’ai découvert que les souris déficientes en ALCAM développent une EAE active plus sévère que celle observée chez des souris de type sauvages. Cette EAE est par ailleurs associée à une infiltration périvasculaire de lymphocytes T pro-inflammatoires et de monocytes/macrophages de type M1 plus marqué chez les souris ALCAM déficientes. L’induction d’une EAE par transfert adoptif, dans laquelle des cellules immunitaires de type sauvage réactivées par du MOG sont injectées à des souris déficientes en ALCAM, suggère que la pathophysiologie observée durant l’EAE active serait liée à l’absence d’ALCAM au niveau de la BHE. Une caractérisation de la barrière des souris ALCAM déficientes non immunisées a par la suite révélé une réduction de l’expression de certaines molécules de jonction serrée. Une analyse plus poussée a par ailleurs démontré qu’ALCAM est lié indirectement à des molécules de jonction serrée des CE-BHE, ce qui expliquerait l’augmentation de la perméabilité de celle-ci chez les souris déficientes en ALCAM. Une analyse de la perméabilité intercellulaire de la BHE effectuée in vitro a d’autre part corrélé ces résultats. Conclusion : Collectivement, nos données prouvent qu’ALCAM joue un rôle prépondérant dans la diapédèse des monocytes, mais pas des lymphocytes Th1 et Th17 au travers de la BHE. Par ailleurs, nos résultats suggèrent qu’ALCAM remplit une fonction biologique cruciale favorisant le maintien de l’intégrité de la BHE en agissant comme molécule adaptatrice intermédiaire entre les molécules de jonction serrées et le cytosquelette. De cette façon, l’absence d’ALCAM au niveau des CE-BHE promeut indirectement le recrutement de leucocytes pro-inflammatoires dans le SNC des souris atteintes de l’EAE en augmentant la perméabilité des vaisseaux sanguins de la BHE. / Aim: The loss of blood-brain barrier (BBB) integrity is a hallmark of multiple sclerosis. It is associated with a disorganization of junctional molecules and an upregulation of cell adhesion molecules essential for immune cell transmigration. Identifying novel key players involved in this process is thus crucial for the development of MS therapies aimed at promoting BBB integrity and decreasing leukocytes trafficking into the central nervous system (CNS) during neuroinflammation. In this study, the specific role of the adhesion molecule ALCAM, found on BBB endothelial cells (BBB-ECs) and subsets of leukocytes, was assessed. Methods: We first identified ALCAM as an important molecule upregulated during inflammation in a proteomic screen of in vitro cultured primary human BBB-ECs. In order to study the effects of ALCAM on leukocyte transmigration, both active and passive experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) was induced in ALCAM KO and WT animals. The specific role of ALCAM during leukocyte transmigration was also assessed using a modified adhesion assay under sheer-stress, in which leukocytes flow across a capillary-like channel lined with a monolayer of BBB-ECs under physiological pressure. Results: Using the modified adhesion assay, we demonstrated that anti-ALCAM blocking antibodies significantly reduce the rolling and the adhesion of human CD14+ monocytes interacting with primary human BBB-ECs, as well as prevent their overall decrease in velocity. Concurrently, we also observed a significant reduction in the migration of ex vivo CD14+ monocytes, across a monolayer of human BBB-ECs. These monocytes also migrated more rapidly and in higher number across meningeal endothelial cells, as compared to BBB-ECs. While similar observations were made using ex vivo CD4+ T lymphocytes, we failed to reproduce these results using in vitro activated Th1 and Th17 cells. In opposition to our in vitro data, ALCAM KO mice developed a more severe active EAE associated with a significant increase in perivascular infiltration of pro-inflammatory lymphocytes (Th1/Th17) and M1 monocytes/macrophages, as compared to WT controls. In addition, EAE transfer experiments, in which ALCAM KO mice received WT MOG-reactivated splenocytes, suggested that the pathophysiology observed in active EAE was linked to the absence of ALCAM on BBB-ECs. Phenotypic characterization of un-immunized ALCAM KO mice revealed a reduced expression of BBB junctional proteins. Further analysis showed that ALCAM is indirectly associated with tight junction molecules of the BBB-ECs, which explains the increased CNS parenchymal blood vessel in vivo permeability in ALCAM KO animals. Correlating with these data, primary culture of mouse brain BBB-ECs was shown to possess a lower TEER and an increased permeability coefficient. Conclusion: Collectively, our data provide evidence of the implication of ALCAM in monocyte transmigration, but not Th1 or Th17 lymphocyte diapedesis across CNS endothelium. Our results also point to a biologically crucial function of ALCAM in maintaining BBB integrity by acting as an adaptor molecule between tight junctions and the cytoskeleton. As such, the absence of ALCAM at the level of BBB-ECs indirectly promotes the recruitment of pro-inflammatory leukocytes in the CNS of EAE animals by increasing the BBB vessels permeability.

La barrière hémo-encéphalique (BHE) est formée des cellules endothéliales microvasculaires cérébrales reliées entre elles par des jonctions serrées. Grâce à sa perméabilité restreinte et sélective, la BHE entrave le passage des molécules et cellules du sang vers le système nerveux central (SNC). Chez les patients atteints de sclérose en plaques (SEP), une maladie inflammatoire du SNC, la rupture de la BHE permet aux cellules immunes actives d'infiltrer le tissu cérébral. Il s'ensuit une réaction inflammatoire excessive au cours de laquelle d'autres leucocytes sont recrutés dans le cerveau et qui culmine par la formation des plaques de démyélinisation caractéristiques de la SEP. On dénote au niveau de ces lésions une présence importante de lymphocytes T CD4⁺ activés et de cytokines pro-inflammatoires propres à une réponse de type TH1, tels l’IFN-γ et l’IL-1. Curieusement cependant, l’inhibition de la voie TH1 n’empêche pas l’apparition de la maladie dans le modèle murin de la SEP et en aggrave même les symptômes. On attribue maintenant aux lymphocytes TH17, nommées en raison de leur capacité à produire de l’IL-17, un rôle clé dans le développement de la maladie. L’objectif de ce travail de thèse visait à caractériser les lymphocytes TH17 chez l’humain et définir leur contribution exacte dans la fragilisation de la BHE, une étape décisive dans la formation des lésions de SEP. Pour ce faire, nous avons mis au point une méthode expérimentale permettant l’expansion in vitro de populations de lymphocytes TH17 à partir de cellules mononuclées du sang de donneurs sains. Nos travaux démontrent que l’IL-23 induit la production d’IL-17, d’IL-22 et de granzyme B par les lymphocytes T CD4⁺CD45RO⁺ mémoires humains et qu’une proportion des cellules exprime de manière concomitante de l’IL-17 et de l’IFN-γ. La fréquence des lymphocytes T CD4⁺ IL17⁺, IL-22⁺ et des doubles positifs IL-17⁺IFN-γ⁺ est significativement plus élevée dans les lignées de lymphocytes TH17 provenant de patientes en poussée que dans celles de contrôles. Nos analyses démontrent que les cellules endothéliales de la BHE expriment de faibles niveaux des récepteurs de l’IL-17 et de l’IL-22 à l’état basal mais que leur présence est accrue dans le cerveau de patients atteints de SEP. L’activation du récepteur de l’IL-17 entraîne une augmentation de la perméabilité de la BHE et une perturbation de l’organisation des protéines de jonction occludine et ZO-1. Finalement, nous démontrons que la migration des lymphocytes TH17 à travers la BHE est régie en grande partie par la molécule d’adhérence ICAM-1 et que les lymphocytes qui co-expriment l’IL-17 et l’IFN-γ sont plus aptes à franchir la BHE que ceux qui produisent uniquement l’une ou l’autre de ces cytokines. Nous retrouvons d’ailleurs des cellules qui expriment simultanément les facteurs de transcription T-bet et RORC, associés respectivement aux lymphocytes TH1 et aux TH17, au sein des infiltrats péri-vasculaires des lésions actives de SEP. Les travaux présentés dans cette thèse auront permis d’affiner nos connaissances sur les mécanismes d’entrée des lymphocytes TH17 dans le SNC et les propriétés délétères des cytokines qu’ils sécrètent, notamment dans l’activation et la déstabilisation de l’endothélium cérébral. / The blood-brain barrier (BBB) plays a crucial role in protecting the central nervous system (CNS) by restricting entry of cells and molecules into the brain. In the CNS disorder multiple sclerosis (MS), breakdown of the BBB allows activated leukocytes to infiltrate the brain parenchyma, leading to the formation of the characteristic demyelinated lesions. For decades, MS was viewed as a TH1-mediated disease, a notion that was largely supported by studies in its animal model and by the abundance of prototypical TH1-associated cytokines within active MS lesions. However, over the years, accumulating evidence has highlighted the involvement of another subset of CD4⁺ T cells that express IL-17, therefore named TH17 lymphocytes, in the pathology of the disease. The goal of the work presented herein was to characterize the human TH17 lymphocyte population and define their contribution to the disruption of the BBB and leukocyte infiltration into the CNS, both important early events in the formation of MS lesions. To do so, we developed and optimized a method to successfully generate human TH17 lines in vitro from peripheral blood mononuclear cells of healthy donors. We demonstrate that in response to IL-23, human memory CD4⁺CD45RO⁺ but not naïve CD4⁺CD45RA⁺ T lymphocytes produce IL-17, IL-22, and granzyme B, with a subset of cells simultaneously expressing IL-17 and IFN-γ. Interestingly, we measure a significant increase in the percentage of T CD4⁺ IL17⁺, of IL-22⁺, and of IL-17⁺IFN-γ⁺ dual producers in TH17 cell lines expanded from the peripheral blood of acutely relapsing MS women as compared to those generated from healthy controls and remitting MS patients. We show that both IL-17 and IL-22 receptors are upregulated on BBB endothelial cells in situ during inflammation and that IL-17 enhances BBB permeability by disrupting the integrity of tight junction proteins occludin and ZO-1. Finally, we provide evidence that TH17 lymphocytes transmigrate efficiently across human brain endothelial cells via the adhesion molecule ICAM-1 and show that IL-17⁺IFN-γ⁺ double producers have an increased propensity to do so. Accordingly, we detect lymphocytes that display immunoreactivity against both the TH1- and TH17-associated transcription factors T-bet and RORC within perivascular infiltrates of active MS lesions. The work presented in this thesis has refined our understanding of the mechanisms that drive TH17 lymphocyte recruitment into the CNS and shed light on the deleterious effect of TH17-secreted cytokines, specifically in the activation and breakdown of the BBB.

La sclérose en plaques (SEP) est une maladie neuro-inflammatoire du système nerveux central. Les causes sont multifactorielles impliquant à la fois une prédisposition génétique et l'influence de facteurs environnementaux. Dans environ 85% des cas, les patients sont atteints de poussées correspondants à la survenue de signes neurologiques, suivis d'une phase de rémission partielle ou totale. De nombreux travaux avancent l'hypothèse selon laquelle le taux de poussées varie au gré des saisons, survenant plus fréquemment au printemps et en été. Cette fluctuation temporelle a soulevé la question de l'influence de paramètres dépendants de la saison tels que l'ensoleillement et le statut en vitamine D, le niveau de mélatonine ou encore la pollution atmosphérique. Etant donné cette variation de la pollution de l'air, nous avons cherché à explorer l'impact à court terme des particules fines (PM10), benzène (C6H6), dioxyde d'azote (NO2), monoxyde de carbone (CO) et de l'ozone troposphérique (O3), sur le risque de déclenchement de poussée, indépendamment des saisons "chaude" (1er avril au 30 septembre) et "froide" (1er octobre au 31 mars). Ce travail s'est appuyé sur les données de patients issus du réseau ville-hôpital alSacEP. Nous avons sélectionné 424 patients atteints de SEP à début rémittent et ayant connu un total de 1 783 poussées (2000-2009). Les niveaux journaliers de pollution, produits grâce au modèle physique déterministe ADMS-Urban, ont été modélisés sur une base horaire pour chaque IRIS de la communauté urbaine de Strasbourg par l'actuelle AASQUA ATMO Grand Est. De plus, une enquête individuelle menée dans le cadre de cette étude auprès de l'ensemble des patients (PT) a permis de collecter (par questionnaire téléphonique ou auto-questionnaire sur internet) des informations personnelles socio-économiques (SES) et du mode de vie pour 188 d'entre eux (PS). Enfin, le niveau SES des IRIS a été estimé à l’aide d’un indice de défaveur social - construit à partir des données du recensement de l’INSEE. Nous avons observé une influence saisonnière délétère à court terme de la pollution (3 jours précédant la poussée) sur le risque de poussée en PT, notamment de l'O3 en saison "chaude" et des PM10 et NO2 en saison "froide". Nos résultats suggèrent également que le contexte SES puisse exacerber ces associations, notamment chez les patients résidant dans les quartiers défavorisés lors d'exposition aux PM10, NO2, C6H6 et CO ("froide") et ceux résidant dans les quartiers favorisés et défavorisés lors de l'exposition à l'O3 ("chaude"). Enfin, nous avons observé chez la PS que le niveau d'éducation faible, le revenu familial moyen, la consommation de cigarette et le manque d'activité physique régulière sont les catégories SES et du mode de vie les plus associées avec le risque de poussée lors de l'exposition à la pollution de l'air. Ce travail montre la nécessité d'étudier les expositions environnementales au cours de la SEP selon une approche holistique intégrant des facteurs individuels et contextuels. / Multiple sclerosis (MS) is a neuro-inflammatory disease of the central nervous system (CNS). Causes are multifactorial enrolling both genetic predisposition and influence of environmental factors. In 85% of cases, patients experience relapse corresponding to the occurrence of neurologic signs, followed by a phase of partial or total remission. Several studies put forth the hypothesis that relapses rate varies across season, mainly occurring during spring and summer. This temporal fluctuation raised the question of season-dependent parameters influence such as sunlight exposure and vitamin D, melatonin level or ambient air pollution. Considering this variation of air pollution, we explored the short-term impact of fine particles (PM10), benzene (C6H6), nitrogen dioxide (NO2), carbon monoxide (CO) and ground-level ozone (O3), on the risk of relapse triggering, separately for "cold" (i.e., October-March) and "hot" (April-September) season. This work has drawn from data of patients provided by the alSacEP network. We included 424 patients affected with remitting MS onset who experienced 1,783 relapses over the 2000-2009 period. Daily level of air pollution was modeled through ADMS-Urban software at the census block scale of the Strasbourg metropolitan area (AASQA ATMO Grand Est). Furthermore, an individual survey was conducted among all the patients (PT) in order to collect individual socioeconomic (SES) and lifestyle features. Finally, the census block SES position was estimated using a composite deprivation index - created from the INSEE census data. A short-term (3 days preceding the relapse) seasonal adverse effect was observed in PT, in particular during exposure to O3 in "hot" season and PM10 and NO2 in "cold" season. Results also suggest that the SES context might exacerbate these associations, in particular among patients who were living in deprived neighborhood with exposure to PM10, NO2, C6H6 and CO ("cold) and those who were living in most well-of and deprived places with exposure to O3 ("hot"). Finally, we observed among Ps that low education level, average family income, smoking and lack of physical activity are more associated with the risk of relapse triggering when patients were exposed to air pollution. This work shows the need to investigate environmental exposure such as air pollution along the SEP course using a holistic approach integrating individual and contextual factors.

La sclérose en plaques (SP) est une maladie neuro-inflammatoire caractérisée par l’invasion de cellules immunitaires périphériques dans le système nerveux central (SNC), entraînant une perte de myéline à des endroits bien délimités appelés « plaques » ou lésions. Les processus neuroinflammatoires sont associés au dommage des neurones et oligodendrocytes (OLs) en SP. Les mécanismes sous-tendant cette dégradation des OLs par les cellules immunitaires en SP sont toutefois encore mal compris. Les lymphocytes T CD4 activés, notamment les sous-types proinflammatoires Th1 et Th17, jouent un rôle clé dans la pathobiologie de la SP et de son modèle murin l’encéphalite auto-immune expérimentale (EAE). Nous avons donc choisi d’investiguer leur contribution à l’endommagement des OLs en neuroinflammation. Pour ce faire, nous avons premièrement caractérisé les interactions entre les lymphocytes Th17 et les OLs matures in vivo à l’aide de l’imagerie intravitale chez la souris EAE (microscopie deux photons) et in vitro en utilisant des cultures primaires humaines. Ceci nous a permis de mettre en évidence que les lymphocytes pro-inflammatoires Th17 adhèrent de façon prolongée aux OLs et leur causent plus de dommage que les lymphocytes anti-inflammatoires Th2. Après avoir établi que le contact avec les lymphocytes Th17 entraîne tout d’abord la perte des prolongements cellulaires puis la mort des OLs, nous avons identifié deux mécanismes à l’origine de ces dommages. En effet, tandis que la sécrétion de glutamate par les lymphocytes Th17 à proximité des OLs entraîne une perte des prolongements cellulaires de ces derniers et une diminution de leur capacité à myéliniser, la sécrétion de granzyme B mène à la mort des OLs. Dans le but de comprendre comment prévenir les dommages causés par les lymphocytes Th17 aux OLs en SP, nous avons par la suite étudié les mécanismes sous-tendant le contact entre les deux types cellulaires. Comme nous avons confirmé que les OLs matures n’expriment pas le MHC II au niveau protéique, nous avons caractérisé l’expression par les OLs de molécules d’adhérence cellulaire (CAMs) qui seraient susceptibles de sous-tendre l’adhérence des lymphocytes Th17. Nous avons découvert que cette interaction est notamment médiée par ALCAM, et que bloquer cette molécule permet de diminuer le dommage aux OLs médié par les Th17 in vitro. A l’inverse, l’expression et/ou la sécrétion d’ICAM-1 par les OLs semble avoir un effet protecteur face aux lymphocytes Th17. En résumé, nous avons distingué de nouveaux mécanismes impliqués dans le dommage aux OLs en neuroinflammation et identifié de nouvelles cibles thérapeutiques prometteuses pour la protection des OLs en SP. / Multiple Sclerosis (MS) is a neuroinflammatory disease characterized by infiltration of immune cells into the central nervous system (CNS), demyelination in multifocal areas called “plaques” or lesions, and damage to neurons and oligodendrocytes (OLs). The mechanisms underlying immune-mediated injury to OLs in MS remains only partially understood. Activated CD4 T cells, in particular pro-inflammatory subsets Th1 and Th17, play an important role in the pathobiology of MS and its animal model experimental autoimmune encephalitis (EAE). We set out to investigate their contribution to immune-mediated oligodendrocytic damage in neuroinflammation. We first characterized the interactions between Th17 cells and mature OLs in vivo using live imaging of EAE mice (two photon microscopy) and in vitro using human primary cell cultures. We found that pro-inflammatory Th17 cells form prolonged contacts with OLs and cause greater harm compared to anti-inflammatory Th2 cells. After demonstrating that contact with Th17 cells leads first to destruction of cell processes and then death of OLs, we identified two mechanisms underlying these deleterious impacts. Indeed, while secretion of glutamate by Th17 cells in contact with OLs is associated with damage to OLs cell processes and impairment of their myelinating capacity, secretion of granzyme B leads to OLs death. To better understand how to prevent Th17-mediated OLs injury in MS, we next studied mechanisms involved in the interaction between these two cell types. As we confirmed that mature OLs do not express MHC II at the protein level, we characterized expression of cell adhesion molecules (CAMs) by OLs that could mediate Th17 cell adhesion. We discovered that ALCAM contributes to OLs and Th17 cells interactions, and that blocking this olecule reduces Th17-mediated OL damage in vitro. Inversely, ICAM-1 expression and/or secretion by OLs seems to have a protective effect in neuroinflammatory conditions. In summary, we have uncovered new mechanisms implicated in OLs njury in neuroinflammation and have identified potential novel therapeutic targets for neuroprotection in MS.

Indiana University-Purdue University Indianapolis (IUPUI) / Multiple sclerosis (MS) is a disabling disease that afflicts an estimated two million people worldwide. The disease is characterized by degradation of the myelin sheath that insulates neurons of the central nervous system manifesting as a heterogeneous collection of symptoms. Two enzymes, protein arginine deaminases type 2 and 4 (PAD2 and PAD4) have been implicated to play an etiologic role in demyelination and neurodegeneration by catalyzing a post-translational modification of arginine peptide residues to citrulline. The pathogenesis of MS is poorly understood, though vitamin D deficiency is a well-associated risk factor for developing the disorder. Using the experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) model of MS we demonstrate vitamin D treatment to attenuate over-expression of PAD 2 and 4 in the brain and spine during EAE. In addition, we identify two molecules produced by peripheral immune cells, IFNɣ and IL-6, as candidate signaling molecules that induce PAD expression in the brain. We demonstrate vitamin D treatment to inhibit IFNɣ mediated up regulation of PAD2 and PAD4 both directly within the brain and by modulating PAD-inducing cytokine production by infiltrating immune cells. These results provide neuroprotective rational for the supplementation of vitamin D in MS patients. More importantly, these results imply an epigenetic link between vitamin D deficiency and the pathogenesis of MS that merits further investigation.