Vascular smooth muscle cells (SMCs) regulate vessel contraction but during diseases including atherosclerosis, SMCs undergo functional changes that contribute to pathology. Chronic inflammation in the vasculature exacerbates disease progression. Acute phase serum amyloid A (SAA) is up-regulated during inflammation and expressed in atherosclerotic lesions. Previous work in our laboratory demonstrated that SAA activates secretory phospholipase A2 group IIA (sPLA2), whose products impact cellular cholesterol homeostasis. It was hypothesized that SAA promotes cholesterol trafficking from the plasma membrane to the endoplasmic reticulum (ER) in an sPLA2-dependent manner. SAA induced SMC cholesterol accumulation in the ER. Levels of plasma membrane cholesterol decreased, confirming that cholesterol moved from the plasma membrane to the ER. Another family member, (cytosolic phospholipase A2, group IV), was also required for SAA-induced sPLA2 activation and cholesterol mobilization. SAA activated neutral sphingomyelinase and blocking this activity inhibited cholesterol trafficking. These studies show that SAA activated sPLA2 which activated neutral sphingomyelinase. As a result, sphingomyelin was cleaved, which liberated cholesterol for movement to the ER. Additional studies demonstrated that SAA repressed expression of SMC contractile markers including Acta2 and Myh11. Toll-like receptor 2 (TLR2) is an SAA receptor implicated in atherogenesis and it was hypothesized that TLR2 plays a role in SAA-mediated phenotype/gene changes. The TLR2 ligands, FSL and Pam3CSK4, down-regulated SMC contractile marker expression. Knockdown of TLR2 demonstrated that SAA-mediated phenotype modulation was TLR2-dependent. SAA, FSL, and Pam3CSK4 also induced mRNA expression of pro-inflammatory and adhesion genes, changes inhibited by TLR2 knockdown. SAA repressed activity of the αSMA promoter, demonstrating transcriptional regulation. Myocardin, a transcription factor required to drive expression of SMC contractile genes, was down-regulated by SAA and FSL. Myocardin overexpression abrogated SAA- and FSL-mediated repression of the αSMA and SM22α promoters. These studies demonstrate that SAA promoted a phenotypic switch through activation of TLR2 and down-regulation of myocardin expression. Taken together, novel SAA- and TLR2-mediated mechanisms of cholesterol trafficking and phenotypic modulation in SMCs are shown. Importantly, this work uncovers previously unknown effects of TLR2 signaling on vascular SMCs and provides a context by which TLR2 activation and lesion-associated SAA may promote atherosclerosis. / 2017-12-01T00:00:00Z

Das Chemokine SDF-1α und sein Rezeptor CXCR4 sind in eine Vielzahl biologischer Prozesse, wie der Organogenese, der Hämatopoese und der Immunantwort involviert. Die Entdeckung des alternativen SDF-1α-Rezeptors CXCR7 bewirkte eine erneute Untersuchung der Funktion des SDF-1-Systems in diesen Vorgängen. CXCR7 ist in der Lage, je nach Gewebe- oder Zelltyp, als \"Scavenger\"-Rezeptor, Modulator des CXCR4 oder selbstständig aktiver Rezeptor zu agieren. In dieser Arbeit wurde untersucht, inwiefern beide Rezeptoren im Verlauf der Entwicklung der Muskulatur exprimiert werden, welche Aufgabe sie dabei übernehmen und ob sich Rückschlüsse auf die Muskelregeneration daraus ableiten lassen. Hierfür erfolgten in vitro-Untersuchungen an C2C12-Zellen und die anschließende Analyse der Expression von CXCR4, CXCR7 und SDF-1α in der sich entwickelnden Gliedmaßenmuskulatur von Wildtyp- und mdx-Mäusen. Die Untersuchung von C2C12-Zellen zeigte in allen Differenzierungsstadien eine detektierbare Menge von CXCR4 und eine zunehmende Expression des CXCR7. Die Behandlung der Zellen mit SDF-1α führte zu einer Phosphorylierung von Erk1/2 und PKCζ/λ und hemmte gleichzeitig deren Differenzierung. Nach einer Blockierung des CXCR4 mit seinem pharmakologischen Antagonist AMD3100 oder nach Hemmung der Expression durch spezifische siRNA blieb die Aktivierung des Signalweges aus und der hemmende Einfluss des SDF-1α auf die Differenzierung verschwand vollständig. Im Gegensatz dazu blieben nach der pharmakologischen Blockierung oder durch siRNA vermittelten Expressionshemmung des CXCR7 alle SDF-1α induzierten Effekte vollständig erhalten. Eine Untersuchung des Signalweges am dritten Tag der Differenzierung zeigte keine Aktivierung von Erk1/2. Ebenso blieb Erk1/2 nach einer Hemmung der Expression des CXCR4 unphosphoryliert. Im Gegensatz dazu fand nach einer Hemmung der Expression des CXCR7 mit spezifischer siRNA erneut eine Aktivierung des Signalweges statt. Weiterhin konnte in vivo festgestellt werden, dass die Expression des CXCR4 in der Muskulatur während der embryonalen Entwicklung am höchsten ist und bereits kurz nach der Geburt stark abnimmt, wenn die sekundäre Muskelentwicklung abgeschlossen ist. Die Expression des CXCR7 hingegen steigt perinatal an und bleibt bis zum Erwachsenenalter bestehen. Zusammengefasst zeigen diese Ergebnisse, dass CXCR4 aktiv das Signalgeschehen von SDF-1α in der Myogenese vermittelt und somit zur Differenzierungshemmung von Myoblasten beiträgt. CXCR7 hingegen wirkt als passiver SDF-1α-Scavenger und induziert somit durch eine Modulierung der extrazellulären SDF-1α-Konzentration die Differenzierung. In Übereinstimmung mit der Rolle des SDF-1α-Systems bei der Muskelentwicklung, konnte eine kontinuierliche SDF-1α- Expression im Bindegewebe um pränatale und im Endomysium von postnatalen und adulten Muskelfasern festgestellt werden. Diese SDF-1α-Expression stieg ebenso wie die CXCR4-Expression bei der Analyse der Muskulatur von dystrophin-defizienten Mäusen an und zeigte somit, dass dieses System auch für die Proliferation von Muskelvorläuferzellen in der regenerativen Muskulatur eine wichtige Rolle spielt. Bemerkenswerter Weise hatte diese Muskeldystrophie keinen Einfluss auf die Expression des CXCR7 und beeinflusst vermutlich dessen Funktion über einen anderen Mechanismus. Durch die offensichtlich enge Kontrolle von Muskelentwicklung und Regeneration durch CXCR4, CXCR7 und deren Liganden SDF-1α, bilden diese ein vielversprechendes therapeutisches Ziel für bestimmte Muskelerkrankungen. / The chemokine, SDF-1α, and its receptor, CXCR4, are assumed to control a multitude of biological processes such as organogenesis, haematopoesis, and immune responses. The previous demonstration that SDF-1α additionally binds to the chemokine receptor, CXCR7, currently urges a re-evaluation of the function of the SDF-1 system in these processes. In fact, depending on the tissue and cell type, CXCR7 either acts as a scavenger receptor, a modulator of CXCR4 or an independent active receptor. This thesis is dedicated to answer the following questions: Are both SDF-1α receptors expressed during muscle development? What is the actual function of these receptors during myogenesis? Is there a role of the SDF-1 system in muscle regeneration? To adress these issues both in vitro studies with the myoblast cell line, C2C12, as well as in vivo analyses on the expression of CXCR4, CXCR7 and SDF-1α in developing and regenerating limb muscles have been performed. At all stages of differentiation, C2C12 cells exhibited measurable amounts of CXCR4. In addition, in the course of differentiation C2C12 cells showed increasing expression levels of CXCR7. Treatment of the cells with SDF-1α resulted in the phosphorylation of Erk1/2 and PKCζ/λ and subsequently blocked their myogenic differentiation. Following inactivation of CXCR4 either by its antagonist, AMD3100, or by specific siRNA, SDF-1α failed to activate both pathways and in addition no longer inhibited the myogenic differentiation of C2C12 cells. By contrast, inactivation of CXCR7 remained without effects on SDF-1α-induced cell signalling and resulting inhibitory effects on myogenic differentiation. Interestingly, SDF-1α also failed to activate Erk1/2 signalling in differentiated C2C12 cells. Cell signalling in differentiated C2C12 cells was, however, restored following inhibition of CXCR7 expression, but not following inhibition of CXCR4 expression. The in vivo analysis further revealed that in limb muscles expression of the CXCR4 is highest during embryonic development with a decrease in expression levels shortly after birth when secondary muscle development is completed. Vice versa, expression levels of CXCR7 increased perinatally and remained high into adulthood. In summary, these findings unravel that CXCR4 actively mediates SDF-1α-signalling during myogenesis. The findings further provide evidence that CXCR7 acts as a scavenger receptor during myogenesis which controls myogenic differentiation by modulating extracellular SDF-1α concentration. In further agreement with a major role of SDF-1α in muscle development, SDF-1α is continously expressed by the endomysium of postnatal and adult muscle fibers. Moreover, expression of SDF-1α as well as CXCR4 is massively increased in muscles of dystrophin-deficient mice further implying that the SDF-1 system plays an equally important role during muscle development and regeneration. The pivotal role of SDF-1α in muscle development and regeneration points to the SDF-1 system as a promising therapeutical target for certain muscle diseases.

Thesis (Ph. D.)--University of Virginia, 2007. / Title from title page. Includes bibliographical references. Also available online through Digital Dissertations.

Das Chemokine SDF-1α und sein Rezeptor CXCR4 sind in eine Vielzahl biologischer Prozesse, wie der Organogenese, der Hämatopoese und der Immunantwort involviert. Die Entdeckung des alternativen SDF-1α-Rezeptors CXCR7 bewirkte eine erneute Untersuchung der Funktion des SDF-1-Systems in diesen Vorgängen. CXCR7 ist in der Lage, je nach Gewebe- oder Zelltyp, als \'Scavenger\'-Rezeptor, Modulator des CXCR4 oder selbstständig aktiver Rezeptor zu agieren. In dieser Arbeit wurde untersucht, inwiefern beide Rezeptoren im Verlauf der Entwicklung der Muskulatur exprimiert werden, welche Aufgabe sie dabei übernehmen und ob sich Rückschlüsse auf die Muskelregeneration daraus ableiten lassen. Hierfür erfolgten in vitro-Untersuchungen an C2C12-Zellen und die anschließende Analyse der Expression von CXCR4, CXCR7 und SDF-1α in der sich entwickelnden Gliedmaßenmuskulatur von Wildtyp- und mdx-Mäusen. Die Untersuchung von C2C12-Zellen zeigte in allen Differenzierungsstadien eine detektierbare Menge von CXCR4 und eine zunehmende Expression des CXCR7. Die Behandlung der Zellen mit SDF-1α führte zu einer Phosphorylierung von Erk1/2 und PKCζ/λ und hemmte gleichzeitig deren Differenzierung. Nach einer Blockierung des CXCR4 mit seinem pharmakologischen Antagonist AMD3100 oder nach Hemmung der Expression durch spezifische siRNA blieb die Aktivierung des Signalweges aus und der hemmende Einfluss des SDF-1α auf die Differenzierung verschwand vollständig. Im Gegensatz dazu blieben nach der pharmakologischen Blockierung oder durch siRNA vermittelten Expressionshemmung des CXCR7 alle SDF-1α induzierten Effekte vollständig erhalten. Eine Untersuchung des Signalweges am dritten Tag der Differenzierung zeigte keine Aktivierung von Erk1/2. Ebenso blieb Erk1/2 nach einer Hemmung der Expression des CXCR4 unphosphoryliert. Im Gegensatz dazu fand nach einer Hemmung der Expression des CXCR7 mit spezifischer siRNA erneut eine Aktivierung des Signalweges statt. Weiterhin konnte in vivo festgestellt werden, dass die Expression des CXCR4 in der Muskulatur während der embryonalen Entwicklung am höchsten ist und bereits kurz nach der Geburt stark abnimmt, wenn die sekundäre Muskelentwicklung abgeschlossen ist. Die Expression des CXCR7 hingegen steigt perinatal an und bleibt bis zum Erwachsenenalter bestehen. Zusammengefasst zeigen diese Ergebnisse, dass CXCR4 aktiv das Signalgeschehen von SDF-1α in der Myogenese vermittelt und somit zur Differenzierungshemmung von Myoblasten beiträgt. CXCR7 hingegen wirkt als passiver SDF-1α-Scavenger und induziert somit durch eine Modulierung der extrazellulären SDF-1α-Konzentration die Differenzierung. In Übereinstimmung mit der Rolle des SDF-1α-Systems bei der Muskelentwicklung, konnte eine kontinuierliche SDF-1α- Expression im Bindegewebe um pränatale und im Endomysium von postnatalen und adulten Muskelfasern festgestellt werden. Diese SDF-1α-Expression stieg ebenso wie die CXCR4-Expression bei der Analyse der Muskulatur von dystrophin-defizienten Mäusen an und zeigte somit, dass dieses System auch für die Proliferation von Muskelvorläuferzellen in der regenerativen Muskulatur eine wichtige Rolle spielt. Bemerkenswerter Weise hatte diese Muskeldystrophie keinen Einfluss auf die Expression des CXCR7 und beeinflusst vermutlich dessen Funktion über einen anderen Mechanismus. Durch die offensichtlich enge Kontrolle von Muskelentwicklung und Regeneration durch CXCR4, CXCR7 und deren Liganden SDF-1α, bilden diese ein vielversprechendes therapeutisches Ziel für bestimmte Muskelerkrankungen. / The chemokine, SDF-1α, and its receptor, CXCR4, are assumed to control a multitude of biological processes such as organogenesis, haematopoesis, and immune responses. The previous demonstration that SDF-1α additionally binds to the chemokine receptor, CXCR7, currently urges a re-evaluation of the function of the SDF-1 system in these processes. In fact, depending on the tissue and cell type, CXCR7 either acts as a scavenger receptor, a modulator of CXCR4 or an independent active receptor. This thesis is dedicated to answer the following questions: Are both SDF-1α receptors expressed during muscle development? What is the actual function of these receptors during myogenesis? Is there a role of the SDF-1 system in muscle regeneration? To adress these issues both in vitro studies with the myoblast cell line, C2C12, as well as in vivo analyses on the expression of CXCR4, CXCR7 and SDF-1α in developing and regenerating limb muscles have been performed. At all stages of differentiation, C2C12 cells exhibited measurable amounts of CXCR4. In addition, in the course of differentiation C2C12 cells showed increasing expression levels of CXCR7. Treatment of the cells with SDF-1α resulted in the phosphorylation of Erk1/2 and PKCζ/λ and subsequently blocked their myogenic differentiation. Following inactivation of CXCR4 either by its antagonist, AMD3100, or by specific siRNA, SDF-1α failed to activate both pathways and in addition no longer inhibited the myogenic differentiation of C2C12 cells. By contrast, inactivation of CXCR7 remained without effects on SDF-1α-induced cell signalling and resulting inhibitory effects on myogenic differentiation. Interestingly, SDF-1α also failed to activate Erk1/2 signalling in differentiated C2C12 cells. Cell signalling in differentiated C2C12 cells was, however, restored following inhibition of CXCR7 expression, but not following inhibition of CXCR4 expression. The in vivo analysis further revealed that in limb muscles expression of the CXCR4 is highest during embryonic development with a decrease in expression levels shortly after birth when secondary muscle development is completed. Vice versa, expression levels of CXCR7 increased perinatally and remained high into adulthood. In summary, these findings unravel that CXCR4 actively mediates SDF-1α-signalling during myogenesis. The findings further provide evidence that CXCR7 acts as a scavenger receptor during myogenesis which controls myogenic differentiation by modulating extracellular SDF-1α concentration. In further agreement with a major role of SDF-1α in muscle development, SDF-1α is continously expressed by the endomysium of postnatal and adult muscle fibers. Moreover, expression of SDF-1α as well as CXCR4 is massively increased in muscles of dystrophin-deficient mice further implying that the SDF-1 system plays an equally important role during muscle development and regeneration. The pivotal role of SDF-1α in muscle development and regeneration points to the SDF-1 system as a promising therapeutical target for certain muscle diseases.