Submitted by Priscila Nascimento (pnascimento@icict.fiocruz.br) on 2012-11-16T12:24:56Z No. of bitstreams: 1 rafael-lawson-ferreira.pdf: 3259100 bytes, checksum: 120506960b3b1958e6509f56db6fef38 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-11-16T12:24:56Z (GMT). No. of bitstreams: 1 rafael-lawson-ferreira.pdf: 3259100 bytes, checksum: 120506960b3b1958e6509f56db6fef38 (MD5) Previous issue date: 2007 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto de Tecnologia em Imunobiológicos. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil. / O Instituto de Tecnologia em Imunobiológicos - Bio-Manguinhos/ FIOCRUZ (BM) é um importante centro de produção de imunobiológicosna América Latina. Dentre as vacinas produzidas em Bio-Manguinhos, sob condiçõesde boas práticas de fabricação, a vacina contra Febre Amarela (VcFA), produzida a partir de ovos embrionados SPF, é certificada pela Agência Nacional de Vigilância Sanitária e Organização Mundial de Saúde para suprir a demanda do Ministério da Saúde e das Agências das Nações Unidas. Para garantir a segurança da vacina assim como a ausência de agentes adventícios, testes de Controlede Qualidade (CQ) devem ser realizados na matéria-prima e nas diferentes etapasda produção. Por recomendação da Organização Mundial de Saúde, em vacinas produzidas para o uso humano deve ser demonstrada a ausência de M. oralee M. pneumoniaee quando material de origem aviária é utilizado durante a produção, ausência de M. gallisepticume M. synoviae. Da mesma forma como o desenvolvimento de novos produtos tem evoluído, o CQ deve seguir estas novasabordagens cujos benefícios imediatos seriam a rapidez na liberação de resultados, maior sensibilidade e especificidade. O micoplasma é um importante agenteadventício amplamente encontrado em diferentes tipos de substratos biológicos, porém é um microrganismo fastidioso e de difícil detecção pelo exame direto (cultura do microrganismo) o qual requer um longo prazo para obtenção de resultados, cerca de 35 dias. Em nosso trabalho selecionamos o par de oligonucleotídeos iniciadores GPO-1 e MGSO com o objetivo de estabelecer um teste para detecção de micoplasmas por PCR no CQ da VcFA. Os oligonucleotídeos selecionados amplificam fragmentos de aproximadamente 700 pb na região do gene do rDNA 16S. Foram testadas diferentes metodologias de extração de DNA, como fervura, fenol/clorofórmio e kits comerciais avaliando a adaptabilidade da técnica para os diferentes produtos intermediários. A metodologia proposta, neste trabalho, foi capaz de detectar M. pneumoniaeem concentrações entre 6,25 e 3,125 UFC/mL e M. synoviaeentre 12,5 e 6,25 UFC/mL, em produtos intermediários intencionalmente contaminados, em concentrações inferiores do que as preconizadas pela OMS. Além disso, os oligonucleotídeos selecionados demonstraram especificidade pelas espécies de micoplasmas utilizadas, não apresentando amplificação quando o DNA de outras espécies bacterianas foi utilizado. Paralelamente, foi realizado um ensaio de polimorfismo do comprimento dos fragmentos da restrição (RFLP) para identificação da espécie de micoplasma, onde selecionamos as enzimas de restrição MboI e HinfI, capazes de diferenciar as três espécies de micoplasmas de referência utilizadas (M. gallisepticum, M. pneumoniaee M. synoviae). / The Institute of Technology in Immunobiologicals - Bio-Manguinhos/ FIOCRUZ is an important immunobiological production center in Latin America. Among the vaccines produced in Bio-Manguinhos under good manufacturingpractice, the vaccine against Yellow Fever (YF-Vaccine), produced in SPF embrionated eggs, is certified by the Brazilian National Surveillance Agency and World Health Organization to achieve the demand of the Brazilian Ministry of Health and the United Nations Agencies. In order to guarantee the safety of the vaccine as well as the absence of contaminant agents, tests of Quality Control (QC) must be done along its production. By advice of WHO, on vaccines produced for human use, there must be demonstrated the absence of M. oraleand M. pneumoniae. When poultry material is used during the production, absence of M. gallisepticumand M. synoviae is also required. Mycoplasma is a fastidious microorganism of difficult detection through culturing, which requires a long term for conclusive results, about 35 days. We selected the primer pair GPO-1 and MGSO to establish a mycoplasma detection through PCR in YF-Vaccine. The selected oligonucleotides amplify fragments of roughly 700 bp in the 16S rRNA gene region. Different methodologies of DNA extraction were performed, such as boiling, phenol/chloroform and commercial kits, thus, evaluating the adaptability of each method for the intermediary products. The proposed methodology in this study was capable to detect M. pneumoniaein concentration between 6,25 and 3,125 CFU/mL and M. synoviae,between 12,5 and 6,25 CFU/mL, in spiked intermediate products which constitute lower detection limits throw thosestipulated by WHO. In addition, selected oligonucleotides demonstrated specificity to the Mycoplasma species used in this work, not presenting amplification productswhen other bacteria species was used. Three reference mycoplasmas species (M. gallisepticum, M. pneumoniaeand M. synoviae) could be differentiated based on restriction fragments length polymorphism (RFLP) after digestion of the amplification products by HinfI and MboI.

[ES] La presente tesis doctoral titulada "New nanostructured suports with signal amplification features for the detection of molecules and biomolecules of interest" se centra en el diseño y preparación de nuevos materiales híbridos orgánicos-inorgánicos constituidos por puertas moleculares soportadas sobre alúmina mesoporosa con el objetivo de desarrollar nuevos sistemas sensores con aplicaciones potenciales en el campo de la diagnosis y del control alimentario. En el primer capítulo de la tesis se introducen los conceptos en los que están basados los estudios realizados y los materiales preparados. A continuación, en el segundo capítulo se describen los objetivos generales de la tesis que serán abordados en los siguientes apartados. En el tercer capítulo se presenta el diseño y optimización de un nanodispositivo para la detección de la bacteria Mycoplasma fermentans. En primer lugar, los poros de una placa de alúmina mesoporosa se cargan con un indicador fluorescente (rodamina B). Seguidamente, la superficie es funcionalizada con una secuencia de ADN complementaria a una región altamente conservada de la subunidad ribosomal 16S de la bacteria Mycoplasma fermentans. El impedimento estérico generado por las secuencias de ADN ancladas al exterior de los poros impide la salida del indicador encapsulado. Únicamente en presencia de DNA de la bacteria Mycoplasma fermentans, se produce la apertura de los poros permitiéndose la difusión de la carga (rodamina B) que es posteriormente medida mediante espectroscopía de fluorescencia. En el capítulo cuatro se diseña de un nanodispositivo capaz de detectar de forma rápida, sensible y selectiva la bacteria Staphylococcus aureus. Para la preparación del material sensor, un soporte de alúmina mesoporosa es, en primer lugar, cargado con el indicador fluorescente rodamina B. A continuación, los poros del soporte son tapados mediante el anclaje de un aptámero que reconoce de forma específica la bacteria. Solamente en presencia de Staphylococcus aureus se produce la liberación del indicador encapsulado, que es posteriormente medido mediante espectroscopía de fluorescencia. Además, la respuesta obtenida es específica para Staphylococcus aureus. Este sistema ha sido ensayado en muestras reales. En el sexto capítulo, diseña un nanodispositivo híbrido orgánico-inorgánico consistente en un material de alúmina mesoporosa cubierto con una secuencia de ADN específica para la detección de ADN del hongo Pneumocystis jirovecii. En este caso, el soporte de alúmina cargado con rodamina B se recubre con una secuencia de ADN específica para el reconocimiento de este hongo. En presencia del organismo, la horquilla hibrida con el ADN del hongo, lo que resulta en una conformación triplex con elevada afinidad y estabilidad que induce, al mismo tiempo, el desplazamiento de este complejo de la superficie. Como consecuencia de este reconocimiento la carga se libera y es cuantificada mediante espectroscopía de fluorescencia. El sistema ha sido satisfactoriamente validado. En el séptimo capítulo, se diseña un sistema sensor con la capacidad de detectar gluten de forma rápida y sencilla en extractos de alimentos procesados y no procesados. Para ello, un soporte de alúmina mesoporosa se carga con rodamina B y los poros se recubren con un aptámero específicamente diseñado para la detección de la proteína gliadina, que constituye el 50 % del total del clúster de elementos que forman el gluten. La elevada afinidad y especificidad entre el aptámero y la proteína en cuestión hacen que en presencia de ésta se produzca un desplazamiento de la puerta molecular que permite la difusión del colorante encapsulado que es finalmente monitorizado mediante espectroscopía de fluorescencia. Finalmente, en el capítulo octavo se discuten de forma conjunta los resultados obtenidos en los capítulos anteriores y la potencial aplicación de los sistemas desarrollados en el actual sistem / [CA] La present tesi doctoral, titulada "New nanostructured supports with signal amplification features for the detection of molecules and biomolecules of interest", es centra en el disseny i preparació de nous materials híbrids orgànics-inorgànics constituïts per portes moleculars suportades sobre alúmina mesoporosa amb l'objectiu de desenvolupar nous sistemes sensors amb potencials aplicacions en el camp de la diagnosi i del control alimentari. En el primer capítol de la tesi s'introdueixen els conceptes en què estan basats els estudis realitzats i els materials preparats. A continuació, en el segon capítol es descriuen els objectius generals de la tesi que seran abordats en els següents apartats. En el tercer capítol es presenta el disseny i optimització d'un nanodispositiu per a la detecció de la bactèria Mycoplasma fermentans. Primerament, els porus d'una placa d'alúmina mesoporosa són carregats amb un indicador fluorescent (rodamina B). Seguidament, la superfície és funcionalitzada amb una seqüència d'ADN complementaria a una regió altament conservada de la subunitat ribosomal 16S de la bactèria Mycoplasma fermentans. L'impediment estèric generat per les seqüències d'ADN ancorades a l'exterior dels porus impedeix l'alliberament de l'indicador encapsulat. Únicament en presencia d'ADN de la bactèria Mycoplasma fermentans, es produeix l'obertura dels porus permetent la difusió de la càrrega (rodamina B) que és posteriorment mesurada mitjançant fluorescència. En el capítol quatre es dissenya un nanodispositiu capaç de detectar de forma ràpida, sensible i selectiva la bactèria Staphylococcus aureus. Per a la preparació del material sensor, el suport d'alúmina mesoporosa és, primerament, carregat amb l'indicador fluorescent rodamina B. A continuació, els porus del suport són tapats mitjançant l'ancoratge d'un aptàmer que reconeix de forma específica a la bactèria. Solament en presència de Staphylococcus aureus es produeix l'alliberament de l'indicador encapsulat, que és posteriorment mesurat mitjançant espectroscòpia de fluorescència. A més a més, la resposta obtinguda és específica per Staphylococcus aureus. Aquest sistema ha sigut validat amb mostres reals de pacients. En el sisè capítol, es dissenya un nanodispositiu híbrid orgànic-inorgànic consistent en un material d'alúmina mesoporosa cobert amb una seqüència d'ADN específica per a la detecció de l'ADN del fong Pneumocystis jirovecii. En aquest cas, el suport d'alúmina carregat amb l'indicador fluorescent rodamina B és recobert amb una seqüència d'ADN específica per al reconeixement d'aquest fong. En presència de l'organisme, la forquilla hibrida amb l'ADN del fong, resultant en una conformació triplex amb elevada afinitat i estabilitat, que indueix, al mateix temps, el desplaçament d'aquest complex de la superfície. Com a conseqüència d'aquest reconeixement la càrrega és alliberada i quantificada mitjançant espectroscòpia de fluorescència. El sistema ha sigut validat com a mètode diagnòstic mitjançant l'anàlisi de mostres reals de pacients. En el seté capítol, es dissenya un sistema sensor amb la capacitat de detectar gluten de forma ràpida i senzilla en extractes d'aliments processats i no processats. Per a això, un suport d'alúmina mesoporosa es carrega amb indicador fluorescent rodamina B i posteriorment és recobert amb un aptàmer específicament dissenyat per a la detecció de la proteïna gliadina, que constitueix el 50 % del total del clúster d'elements que formen el gluten. L'elevada afinitat i especificitat entre l'aptàmer i la proteïna en qüestió fa que en presència d'aquesta es produesca un desplaçament de la porta molecular que permet la difusió de la càrrega encapsulada i que serà finalment monitoritzada mitjançant espectroscòpia de fluorescència. Finalment, en el capítol vuité es discuteixen de manera conjunta els result / [EN] The PhD thesis hereby presented and entitled "New nanostructured supports with signal amplification features for the detection of molecules and biomolecules of interest", focuses in the design and preparation of new hybrid organic-inorganic materials constituted by molecular gates supported over mesoporous alumina with the aim of developing new sensor probes of potential applications in the fields of diagnosis and food control. In the first chapter, the concepts in which studies and prepared materials are based, are introduced. Next, the second chapter describes the general objectives of this thesis, which will be approached in the following sections. In the third chapter, it is presented in detail the design and optimization process of a nanodevice applied for the detection of Mycoplasma fermentans bacterium. First of all, mesoporous alumina porous films are charged with a fluorescent indicator (rhodamine B). Then, the surface is functionalized with a DNA sequence complementary to a highly conserved region of the 16S ribosomal subunit of the bacterium Mycoplasma fermentans. Steric hindrance generated by DNA sequences on the surface inhibits the release of the encapsulated indicator. Only in the presence of bacterium Mycoplasma fermentans DNA, molecular gates open, allowing payload diffusion to the solution, which is measured by fluorescence spectroscopy. In chapter four, it is carried out the design and optimization of a nanodevice able to detect Staphylococcus aureus bacterium in a fast, sensitive and selective way. For the sensor preparation, alumina mesoporous support is, first, loaded with the rhodamine B fluorescent dye. Then, the mesoporous are blocked through the attachment of an aptamer that recognises specifically this bacterium. Exclusively in the presence of Staphylococcus aureus it is accomplished the release of the encapsulated dye, which is later monitored by fluorescence spectroscopy. The response obtained is specific for Staphylococcus aureus. This system has been validated in real samples. In the sixth chapter, it is detailed the design and optimization process of a hybrid organic-inorganic nanodevice based on a capped mesoporous alumina material for the detection of Pneumocystis jirovecii fungus DNA. In this case, the mesoporous alumina support is loaded with a fluorescent dye and decorated with a specific oligonucleotide sequence designed for the recognition of Pneumocystis fungus. In the presence of the target organism, the fork-like oligonucleotide hybridises with the DNA of the fungus, which results in the adoption of a triplex conformation with high affinity and stability that induces, at the same time, the displacement of this complex from the surface. Consequently, the payload diffused to the solution is quantified through fluorescence spectroscopy. The system has been successfully validated. In the seventh chapter, it was developed a sensor system for gluten detection, in a quick and easy way, in processed and non-processed food extracts. For this, a mesoporous alumina support is loaded with the fluorescent dye rhodamine B, and later was functionalized with an aptamer specifically designed for the detection of gliadin, a protein that constitutes 50 % of average cluster elements that forms gluten. The protein-aptamer high affinity and specificity induce the displacement of the capping aptamer and cargo delivery, which is monitored through fluorescence spectroscopy. Finally, in the eighth chapter, the results obtained in the previous chapters and the potential application of the systems developed as health and food control system are discussed. / We thank the Spanish Government projects MAT2015-64139-C4-1-R, AGL2015-70235-C2-2-R, and TEC2015-71324-R (MINECO/FEDER, UE), the Generalitat Valenciana (project PROMETEOII/2014/047), the Catalan authority (project AGAUR 2014SGR1344), and ICREA under the 2014 ICREA Academia Award for support. This study was supported by the Spanish Government projects RTI2018-100910-B-C41 and SAF2017-82251-R (MCUI/AEI/FEDER, UE), the Generalitat Valenciana (project PROMETEO/2018/024), the Universitat Politècnica de València−Instituto de Investigación Sanitaria La Fe (B02-MIRSA project), CIBER-BBN (NANOPATH and valorization project CANDI-EYE) and co-financed by the EU through the Valencian Community ERDF PO 2014-2020. This research was funded by the Spanish Government, projects RTI2018-100910-B-C41 (MCUI/AEI/FEDER, UE) and CTQ2017-84415-R / Pla Blasco, L. (2021). New nanostructured supports with signal amplification features for the detection of molecules and biomolecules of interest [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/166500