Memoria para optar al título de Químico Farmacéutico / No autorizada por el autor para ser publicada a texto completo en el Portal de Tesis Electrónicas / Las arañas del género Loxosceles son un grupo numeroso de especies repartidas por todo el mundo, encontrándose en Chile únicamente la Loxosceles laeta. Se conocen popularmente como arañas de rincón, viven exclusivamente junto al hombre y lo muerden solo si se ven amenazadas. La mordedura de la araña provoca en el hombre una condición clínica denominada loxoscelismo, que puede ser de compromiso cutáneo con necrosis de la piel afectada (loxoscelismo cutáneo) o de compromiso sistémico con hemólisis generalizada, pudiendo provocar la muerte por falla renal severa (loxoscelismo viscerocutáneo). El veneno está compuesto por toxinas proteicas de bajo peso molecular, siendo solo una de ellas, la esfingomielinasa D (SMD) o fosfolipasa D, capaz de emular los efectos nocivos del veneno completo. Los tratamientos para el loxoscelismo se basan en medidas de sostén y pese a que existe un antisuero equino disponible en el país, no se usa debido al riesgo de provocar reacción anafiláctica y a su eficacia no comprobada. Tal como los anticuerpos, los aptámeros son moléculas de RNA o DNA capaces de unirse fuerte y específicamente a su molécula blanco. Los aptámeros capaces de bloquear la SMD se presentan como una alternativa segura y eficaz para tratar el loxoscelismo: no son inmunogénicos, son muy específicos, económicos y fáciles de obtener a través de la selección iterativa (SELEX) de un universo de moléculas de RNA o DNA de secuencia aleatoria. En este trabajo se sintetizó de novo el cDNA de la SMD isoforma Ll1 de la Loxosceles laeta mediante polimerización por PCR de oligonucleótidos que se sobrelapan, se clonó en un vector bacteriano de expresión y se generó la proteína recombinante (34,1 kDa) en Escherichia coli. Con la proteína purificada se realizaron dos procesos de selección iterativa por afinidad partiendo de 3,6x1013 moléculas de RNA de 107 nucleótidos siendo los 60 centrales aleatorios. Los procesos, de 10 y 12 ciclos, se efectuaron a relaciones molares de proteína:RNA de 1:5 y 1:10, respectivamente, obteniendo conjuntos de RNAs con hasta ~40% (ciclo 10, 1:5) y ~25% (ciclo 8, 1:10) de capacidad inhibitoria de la actividad esfingomielinásica. Este trabajo es el primer acercamiento a la obtención de aptámeros individuales que constituyan la base molecular de un medicamento biotecnológico de RNA y de un método diagnóstico para el envenenamiento por Loxosceles laeta, araña endémica del país y el animal ponzoñoso de mayor importancia clínica en Chile. / Spiders of the genus Loxosceles are a large group of species spread worldwide, Loxosceles laeta being the only species found in Chile. It is commonly known as brown spider, it lives exclusively with man and only bites when threatened. The spider bite causes a clinical condition called loxoscelism characterized by cutaneous necrosis of the affected site (cutaneous loxoscelism) or systemic involvement with hemolysis, that can cause death due to severe kidney failure (viscerocutaneous loxoscelism). The venom toxins are low molecular weight proteins, only one of which is capable of emulating the harmful effects of whole venom: sphingomyelinase D (SMD) or phospholipase D. Treatment for loxoscelism is based solely on supportive measures. Although an equine antiserum is available in Chile it is not used because of the risk of anaphylactic reactions and unproven efficacy. Similarly to antibodies, aptamers are RNA or DNA molecules capable of binding strongly and specifically to their target. Thus, aptamers which bind to SMD and block it may provide a safe and effective alternative for treating loxoscelism: they are not immunogenic, are highly specific, economic and easy to obtain through iterative selection (SELEX) from a universe of RNA or DNA molecules of random sequence. In this work the cDNA of the LI1 isoform of Loxosceles laeta sphingomyelinase D was synthesized de novo by PCR polymerization of overlapping oligonucleotides, cloned in a bacterial expression vector, and used to generate the recombinant protein (34.1 kDa) in Escherichia coli. Two iterative selection processes were performed with the purified protein, selecting aptamers by affinity for SMD-Ll1 from a pool of 3.6x1013 RNA molecules of 107 nucleotides having a core of 60 nucleotides of random sequence. Each selection process was performed with a protein to RNA ratio of either 1:5 (10 cycles) or 1:10 (12 cycles). The ability of these RNA pools to inhibit SMD-Ll1 sphingomyelinase activity reached ~40% (cycle 10, 1:5) and ~25% (cycle 8, 1:10). This work is the first biotechnological approach to obtain RNA aptamers with therapeutic and diagnostic potential for loxoscelism, disease caused by the poisonous animal having the greatest medical relevance in Chile / Fondecyt 1100209

Objetivo: Seleccionar e identificar aptámeros de ADN capaces de reconocer con alta afinidad y de forma específica péptidos de proteínas de membrana de Leishmania braziliensis. Diseño: El presente estudio es un estudio experimental in vitro que involucra las áreas de biomedicina y biotecnología debido a que se usará péptidos sintéticos para evaluar la afinidad de unión a los aptámeros seleccionados usando la plataforma ELONA.

The present study focuses on the initiation phase of protein synthesis and the generation of aptamers as candidates to reduce the physiological function of the isolated N terminal domain (NTD) of initiation factor 3 (IF-3). Through molecular biology techniques, the correct cloning of the gene coding for IF-3 NTD in plasmid pET24a was verified. This plasmid was used to transform the bacterial model organism Escherichia coli BL21 and thus the massive production of the IF-3 NTD was assessed. Using affinity chromatography techniques, the NTD of the IF-3 was isolated, obtaining high purity degrees and production yields. The purified NTD was used to generate aptamers with the SELEX technique (Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment). Five molecules with binding potential to the NTD of IF-3 were found. The present investigation provides the bases to study the interaction of the NTD of IF-3 with the aptamers in cell-free system and thus to evaluate their inhibitory potential. It is expected that these molecules behave as potential new drugs, and therefore they might contribute to cope for the need of new antibiotics. / Tesis

Introduction: The initiation factor IF2 has different functions in the initiation of protein translation. Its C-terminal domain interacts strongly with fMet-tRNA. The main objective of this study is to isolate a specific aptamer for IF2 CTD Escherichia coli and Geobacillus stearothermophilus. Methods: A protein expression system based on E. coli BL21 was used. E. coli BL21 was transformed with InfB CTD sequence. Protein induction was performed under different temperatures and IPTG concentration. His-tagged affinity chromatography was used for protein purification since a hexa-His coding sequence was added to the InfB genes. Results: IF2 CTD was purified in high yields and purity. E. coli IF2 fragment protein concentration (558.0 ng/uL) was three times larger than that of G. stearothemophilus (144.6 ng/uL). Purity of both proteins were >95%. A specific aptamer for IF2 CTD G. stearothermophilus was obtained through SELEX. Conclusion: A rapid and efficient protocol for IF2 CTD protein purification has been developed, allowing the production of thermophilic and mesophilic IF2 fragments. The obtained aptamer may serve as a novel antibiotic mechanism in further studies. / Tesis

[ES] La presente tesis doctoral titulada "New nanostructured suports with signal amplification features for the detection of molecules and biomolecules of interest" se centra en el diseño y preparación de nuevos materiales híbridos orgánicos-inorgánicos constituidos por puertas moleculares soportadas sobre alúmina mesoporosa con el objetivo de desarrollar nuevos sistemas sensores con aplicaciones potenciales en el campo de la diagnosis y del control alimentario. En el primer capítulo de la tesis se introducen los conceptos en los que están basados los estudios realizados y los materiales preparados. A continuación, en el segundo capítulo se describen los objetivos generales de la tesis que serán abordados en los siguientes apartados. En el tercer capítulo se presenta el diseño y optimización de un nanodispositivo para la detección de la bacteria Mycoplasma fermentans. En primer lugar, los poros de una placa de alúmina mesoporosa se cargan con un indicador fluorescente (rodamina B). Seguidamente, la superficie es funcionalizada con una secuencia de ADN complementaria a una región altamente conservada de la subunidad ribosomal 16S de la bacteria Mycoplasma fermentans. El impedimento estérico generado por las secuencias de ADN ancladas al exterior de los poros impide la salida del indicador encapsulado. Únicamente en presencia de DNA de la bacteria Mycoplasma fermentans, se produce la apertura de los poros permitiéndose la difusión de la carga (rodamina B) que es posteriormente medida mediante espectroscopía de fluorescencia. En el capítulo cuatro se diseña de un nanodispositivo capaz de detectar de forma rápida, sensible y selectiva la bacteria Staphylococcus aureus. Para la preparación del material sensor, un soporte de alúmina mesoporosa es, en primer lugar, cargado con el indicador fluorescente rodamina B. A continuación, los poros del soporte son tapados mediante el anclaje de un aptámero que reconoce de forma específica la bacteria. Solamente en presencia de Staphylococcus aureus se produce la liberación del indicador encapsulado, que es posteriormente medido mediante espectroscopía de fluorescencia. Además, la respuesta obtenida es específica para Staphylococcus aureus. Este sistema ha sido ensayado en muestras reales. En el sexto capítulo, diseña un nanodispositivo híbrido orgánico-inorgánico consistente en un material de alúmina mesoporosa cubierto con una secuencia de ADN específica para la detección de ADN del hongo Pneumocystis jirovecii. En este caso, el soporte de alúmina cargado con rodamina B se recubre con una secuencia de ADN específica para el reconocimiento de este hongo. En presencia del organismo, la horquilla hibrida con el ADN del hongo, lo que resulta en una conformación triplex con elevada afinidad y estabilidad que induce, al mismo tiempo, el desplazamiento de este complejo de la superficie. Como consecuencia de este reconocimiento la carga se libera y es cuantificada mediante espectroscopía de fluorescencia. El sistema ha sido satisfactoriamente validado. En el séptimo capítulo, se diseña un sistema sensor con la capacidad de detectar gluten de forma rápida y sencilla en extractos de alimentos procesados y no procesados. Para ello, un soporte de alúmina mesoporosa se carga con rodamina B y los poros se recubren con un aptámero específicamente diseñado para la detección de la proteína gliadina, que constituye el 50 % del total del clúster de elementos que forman el gluten. La elevada afinidad y especificidad entre el aptámero y la proteína en cuestión hacen que en presencia de ésta se produzca un desplazamiento de la puerta molecular que permite la difusión del colorante encapsulado que es finalmente monitorizado mediante espectroscopía de fluorescencia. Finalmente, en el capítulo octavo se discuten de forma conjunta los resultados obtenidos en los capítulos anteriores y la potencial aplicación de los sistemas desarrollados en el actual sistem / [CA] La present tesi doctoral, titulada "New nanostructured supports with signal amplification features for the detection of molecules and biomolecules of interest", es centra en el disseny i preparació de nous materials híbrids orgànics-inorgànics constituïts per portes moleculars suportades sobre alúmina mesoporosa amb l'objectiu de desenvolupar nous sistemes sensors amb potencials aplicacions en el camp de la diagnosi i del control alimentari. En el primer capítol de la tesi s'introdueixen els conceptes en què estan basats els estudis realitzats i els materials preparats. A continuació, en el segon capítol es descriuen els objectius generals de la tesi que seran abordats en els següents apartats. En el tercer capítol es presenta el disseny i optimització d'un nanodispositiu per a la detecció de la bactèria Mycoplasma fermentans. Primerament, els porus d'una placa d'alúmina mesoporosa són carregats amb un indicador fluorescent (rodamina B). Seguidament, la superfície és funcionalitzada amb una seqüència d'ADN complementaria a una regió altament conservada de la subunitat ribosomal 16S de la bactèria Mycoplasma fermentans. L'impediment estèric generat per les seqüències d'ADN ancorades a l'exterior dels porus impedeix l'alliberament de l'indicador encapsulat. Únicament en presencia d'ADN de la bactèria Mycoplasma fermentans, es produeix l'obertura dels porus permetent la difusió de la càrrega (rodamina B) que és posteriorment mesurada mitjançant fluorescència. En el capítol quatre es dissenya un nanodispositiu capaç de detectar de forma ràpida, sensible i selectiva la bactèria Staphylococcus aureus. Per a la preparació del material sensor, el suport d'alúmina mesoporosa és, primerament, carregat amb l'indicador fluorescent rodamina B. A continuació, els porus del suport són tapats mitjançant l'ancoratge d'un aptàmer que reconeix de forma específica a la bactèria. Solament en presència de Staphylococcus aureus es produeix l'alliberament de l'indicador encapsulat, que és posteriorment mesurat mitjançant espectroscòpia de fluorescència. A més a més, la resposta obtinguda és específica per Staphylococcus aureus. Aquest sistema ha sigut validat amb mostres reals de pacients. En el sisè capítol, es dissenya un nanodispositiu híbrid orgànic-inorgànic consistent en un material d'alúmina mesoporosa cobert amb una seqüència d'ADN específica per a la detecció de l'ADN del fong Pneumocystis jirovecii. En aquest cas, el suport d'alúmina carregat amb l'indicador fluorescent rodamina B és recobert amb una seqüència d'ADN específica per al reconeixement d'aquest fong. En presència de l'organisme, la forquilla hibrida amb l'ADN del fong, resultant en una conformació triplex amb elevada afinitat i estabilitat, que indueix, al mateix temps, el desplaçament d'aquest complex de la superfície. Com a conseqüència d'aquest reconeixement la càrrega és alliberada i quantificada mitjançant espectroscòpia de fluorescència. El sistema ha sigut validat com a mètode diagnòstic mitjançant l'anàlisi de mostres reals de pacients. En el seté capítol, es dissenya un sistema sensor amb la capacitat de detectar gluten de forma ràpida i senzilla en extractes d'aliments processats i no processats. Per a això, un suport d'alúmina mesoporosa es carrega amb indicador fluorescent rodamina B i posteriorment és recobert amb un aptàmer específicament dissenyat per a la detecció de la proteïna gliadina, que constitueix el 50 % del total del clúster d'elements que formen el gluten. L'elevada afinitat i especificitat entre l'aptàmer i la proteïna en qüestió fa que en presència d'aquesta es produesca un desplaçament de la porta molecular que permet la difusió de la càrrega encapsulada i que serà finalment monitoritzada mitjançant espectroscòpia de fluorescència. Finalment, en el capítol vuité es discuteixen de manera conjunta els result / [EN] The PhD thesis hereby presented and entitled "New nanostructured supports with signal amplification features for the detection of molecules and biomolecules of interest", focuses in the design and preparation of new hybrid organic-inorganic materials constituted by molecular gates supported over mesoporous alumina with the aim of developing new sensor probes of potential applications in the fields of diagnosis and food control. In the first chapter, the concepts in which studies and prepared materials are based, are introduced. Next, the second chapter describes the general objectives of this thesis, which will be approached in the following sections. In the third chapter, it is presented in detail the design and optimization process of a nanodevice applied for the detection of Mycoplasma fermentans bacterium. First of all, mesoporous alumina porous films are charged with a fluorescent indicator (rhodamine B). Then, the surface is functionalized with a DNA sequence complementary to a highly conserved region of the 16S ribosomal subunit of the bacterium Mycoplasma fermentans. Steric hindrance generated by DNA sequences on the surface inhibits the release of the encapsulated indicator. Only in the presence of bacterium Mycoplasma fermentans DNA, molecular gates open, allowing payload diffusion to the solution, which is measured by fluorescence spectroscopy. In chapter four, it is carried out the design and optimization of a nanodevice able to detect Staphylococcus aureus bacterium in a fast, sensitive and selective way. For the sensor preparation, alumina mesoporous support is, first, loaded with the rhodamine B fluorescent dye. Then, the mesoporous are blocked through the attachment of an aptamer that recognises specifically this bacterium. Exclusively in the presence of Staphylococcus aureus it is accomplished the release of the encapsulated dye, which is later monitored by fluorescence spectroscopy. The response obtained is specific for Staphylococcus aureus. This system has been validated in real samples. In the sixth chapter, it is detailed the design and optimization process of a hybrid organic-inorganic nanodevice based on a capped mesoporous alumina material for the detection of Pneumocystis jirovecii fungus DNA. In this case, the mesoporous alumina support is loaded with a fluorescent dye and decorated with a specific oligonucleotide sequence designed for the recognition of Pneumocystis fungus. In the presence of the target organism, the fork-like oligonucleotide hybridises with the DNA of the fungus, which results in the adoption of a triplex conformation with high affinity and stability that induces, at the same time, the displacement of this complex from the surface. Consequently, the payload diffused to the solution is quantified through fluorescence spectroscopy. The system has been successfully validated. In the seventh chapter, it was developed a sensor system for gluten detection, in a quick and easy way, in processed and non-processed food extracts. For this, a mesoporous alumina support is loaded with the fluorescent dye rhodamine B, and later was functionalized with an aptamer specifically designed for the detection of gliadin, a protein that constitutes 50 % of average cluster elements that forms gluten. The protein-aptamer high affinity and specificity induce the displacement of the capping aptamer and cargo delivery, which is monitored through fluorescence spectroscopy. Finally, in the eighth chapter, the results obtained in the previous chapters and the potential application of the systems developed as health and food control system are discussed. / We thank the Spanish Government projects MAT2015-64139-C4-1-R, AGL2015-70235-C2-2-R, and TEC2015-71324-R (MINECO/FEDER, UE), the Generalitat Valenciana (project PROMETEOII/2014/047), the Catalan authority (project AGAUR 2014SGR1344), and ICREA under the 2014 ICREA Academia Award for support. This study was supported by the Spanish Government projects RTI2018-100910-B-C41 and SAF2017-82251-R (MCUI/AEI/FEDER, UE), the Generalitat Valenciana (project PROMETEO/2018/024), the Universitat Politècnica de València−Instituto de Investigación Sanitaria La Fe (B02-MIRSA project), CIBER-BBN (NANOPATH and valorization project CANDI-EYE) and co-financed by the EU through the Valencian Community ERDF PO 2014-2020. This research was funded by the Spanish Government, projects RTI2018-100910-B-C41 (MCUI/AEI/FEDER, UE) and CTQ2017-84415-R / Pla Blasco, L. (2021). New nanostructured supports with signal amplification features for the detection of molecules and biomolecules of interest [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/166500 / TESIS

[ES] Los biosensores son dispositivos analíticos con aplicabilidad en diferentes campos y con numerosas ventajas frente a otros métodos analíticos convencionales, como son el uso de pequeños volúmenes de muestra y reactivos, su sensibilidad y su rápida respuesta, sin necesidad de pretratamiento de la muestra, equipos caros o personal especializado. Sin embargo, se trata de un campo de investigación relativamente nuevo en el que todavía queda mucho camino por andar. Esta Tesis doctoral pretende aportar un granito de arena a este campo de conocimiento mediante el estudio del potencial de diferentes materiales porosos como transductores para el desarrollo de biosensores ópticos con respuesta en tiempo real y sin marcajes. Los materiales propuestos van desde aquellos artificialmente sintetizados, como silicio poroso (SiP), nanofibras (NFs) poliméricas o membranas poliméricas comerciales, hasta materiales naturales con propiedades fotónicas que todavía no habían sido explotadas para el sensado, como son los exoesqueletos de biosílice de diatomeas. Todos ellos tienen en común la simplicidad en su obtención, evitando costosos y laboriosos procesos de nanofabricación. Para su estudio, se analizará su respuesta óptica y, en aquellos casos en los que ésta permita llevar a cabo experimentos de detección, se desarrollarán estrategias para su biofuncionalización y su implementación en experimentos de biosensado. En el caso del SiP y las NFs se han optimizado los parámetros de fabricación para obtener una respuesta óptica adecuada que permita su interrogación. A continuación, se ha llevado a cabo su biofuncionalización empleando métodos covalentes y no covalentes, así como diferentes bioreceptores (aptámeros de ADN y anticuerpos) para estudiar su potencial y sus limitaciones como biosensores. En el caso de las membranas comerciales y el exoesqueleto de sílice de diatomeas, se ha caracterizado su respuesta óptica y se han llevado a cabo experimentos de sensado de índice de refracción para estudiar su sensibilidad. Así mismo, se ha desarrollado un método de funcionalización de la superficie del exoesqueleto de diatomeas basado en el uso de polielectrolitos catiónicos. Como resultado, se ha demostrado el potencial tanto de NFs para el desarrollo de biosensores, como el de membranas comerciales para sensores cuya aplicación no requiera una elevada sensibilidad pero sí un bajo coste. Además, se ha puesto de manifiesto el gran potencial del exoesqueleto de diatomeas para el desarrollo de sensores basados en su respuesta óptica. Por el contrario, las limitaciones encontradas en el desarrollo de biosensores basados en SiP han evidenciado la necesidad de un estudio riguroso y la optimización de la estructura de materiales porosos previamente a ser usados en (bio)sensado. / [CA] Els biosensors són dispositius analítics amb aplicabilitat en diferents camps i amb nombrosos avantatges enfront d'altres mètodes analítics convencionals, com són l'ús de xicotets volums de mostra i reactius, la seua sensibilitat i la seua ràpida resposta, sense necessitat de pretractament de la mostra, equips cars o personal especialitzat. No obstant això, es tracta d'un camp d'investigació relativament nou en el qual encara queda molt camí per fer. Aquesta Tesi doctoral pretén aportar el seu òbol a aquest camp de coneixement mitjançant l'estudi del potencial de diferents materials porosos com a transductors per al desenvolupament de biosensors òptics amb resposta en temps real i sense marcatges. Els materials proposats van des d'aquells artificialment sintetitzats, com a silici porós (SiP), nanofibras (NFs) polimèriques o membranes polimèriques comercials, fins a materials naturals amb propietats fotòniques que encara no havien sigut explotades per al sensat, com són els exoesquelets de biosílice de diatomees. Tots ells tenen en comú la simplicitat en la seua obtenció, evitant costosos i laboriosos processos de nanofabricació. Per al seu estudi, s'analitzarà la seua resposta òptica i, en aquells casos en els quals aquesta permeta dur a terme experiments de detecció, es desenvoluparan estratègies per a la seua biofuncionalizació i la seua implementació en experiments de biosensat. En el cas del SiP i les NFs s'han optimitzat els paràmetres de fabricació per a obtenir una resposta òptica adequada que permeta la seua interrogació. A continuació, s'ha dut a terme la seua biofuncionalizació emprant mètodes covalents i no covalents, així com diferents bioreceptors (aptàmers d'ADN i anticossos) per a estudiar el seu potencial i les seues limitacions com a biosensors. En el cas de les membranes comercials i l'exoesquelet de sílice de diatomees, s'ha caracteritzat la seua resposta òptica i s'han dut a terme experiments de sensat d'índex de refracció per a estudiar la seua sensibilitat. Així mateix, s'ha desenvolupat un mètode de funcionalizació de la superfície de l'exoesquelet de diatomees basat en l'ús de polielectròlits catiònics. Com a resultat, s'ha demostrat el potencial tant de NFs per al desenvolupament de biosensors, com el de membranes comercials per a sensors amb una aplicació que no requerisca una elevada sensibilitat però sí un baix cost. A més, s'ha posat de manifest el gran potencial de l'exoesquelet de diatomees per al desenvolupament de sensors basats en la seua resposta òptica. Per contra, les limitacions trobades en el desenvolupament de biosensors basats en SiP han evidenciat la necessitat d'un estudi rigorós i l'optimització de l'estructura dels materials porosos prèviament a ser usats en (bio)sensat. / [EN] Biosensors are analytical devices with application in diverse fields and with several advantages relative to other conventional methods, such as the use of small volumes of sample and reagents, their sensitivity and their fast response, without the need of the sample pretreatment, expensive equipments or specialised technicians. Nevertheless, this is a relatively new research field in which there is a long way to go yet. This doctoral Thesis aims at doing its bit to this field of knowledge by studying the potential of different porous materials as transducers for the development of real-time and label-free optical biosensors. The proposed materials range from those artificially synthesised, such as porous silicon (pSi), polymeric nanofibres (NFs) or commercial polymeric membranes, to natural materials with photonic properties that had not been exploited for sensing yet, such as biosilica exoskeletons of diatoms. All of them have in common its simple production, avoiding expensive and laborious nanofabrication processes. For their study, their optical response will be analysed and, in those cases in which such optical response allows performing detection experiments, strategies for their biofunctionalisation and their implementation in biosensing experiments will be developed as well. Regarding pSi and NFs, the fabrication parameters were optimised to get a suitable optical response for their interrogation. Afterwards, their surface functionalisation was carried out by covalent and non-covalent methods, as well as different bioreceptors (DNA aptamers and antibodies), to study their potential and their constraints as biosensors. Concerning commercial membranes and the biosilica exoskeleton of diatoms, their optical response was characterised and refractive index sensing experiments were carried out to study their sensitivity. Additionally, a biofunctionalisation method for the surface of the diatoms exoskeleton was developed based on the use of cationic polyelectrolytes. As a result, it was demonstrated the potential of NFs for the development of biosensors, as well as the potential of commercial membranes for developing sensors for an application that does not require a high sensitivity but a low cost. Furthermore, the great potential of biosilica exoskeleton of diatoms for the development of sensors based on their optical response has been revealed. By contrast, the constraints found in the development of pSi illustrate the importance of an accurate study and optimisation of porous materials structure before using them for (bio)sensing. / Martínez Pérez, P. (2021). Development and Optimization of Experimental Biosensing Protocols Using Porous Optical Transducers [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/172541 / TESIS