Legeleistungseinbußen – vor allem mit verminderter Eischalenqualität – stellen in einem Legehennenbetrieb hohe wirtschaftliche Verluste dar. Impfungen gegen entsprechende Erreger, u.a. gegen das aviäre Metapneumovirus (aMPV), sind daher weit verbreitet. AMPV ist seit den 70er Jahren als Auslöser der Rhinotracheitis der Puten (Turkey Rhinotracheitis; TRT) und des sogenannten Swollen Head Syndroms (SHS) der Hühner bekannt. Jedoch liegen nur wenige epidemiologische Studien zu der Verbreitung des Virus und dessen Subtypen in Legehennenbetrieben vor. Ziel der vorliegenden Studie war es daher, die Verbreitung des aMPV, vor allem der Subtypen A und B, zu unterschiedlichen Zeiten der Legeperiode zu untersuchen, um ein besseres Verständnis über den Zeitpunkt der Erstinfektionen sowie evtl. Re- oder Neuinfektionen zu erhalten. Dafür wurden erstmals 18 Legehennenherden in Sachsen alle drei Monate über die gesamte Legeperiode auf das Vorkommen von aMPV-RNA und aMPV-spezifischer Antikörper untersucht. Verschiedene Haltungssysteme wurden berücksichtigt, um ein unterschiedliches seuchenhygienisches Risiko unter Praxisbedingungen bewerten zu können. Pro Herde wurden von je zehn Hühnern Trachealtupfer und Serumproben entnommen. Die Tupferproben wurden mittels duplex nested RT-PCR untersucht, die Serumproben mittels zweier kommerzieller ELISA-Tests. In jeder Herde gelang der aMPV-RNA-Nachweis mindestens einmal zu unterschiedlichen Zeitpunkten. Bereits bei der Einstallung konnten in 17 Herden aMPV-spezifische Antikörper und/oder aMPV-RNA nachgewiesen werden. Diese Ergebnisse zeigen die hohe Verbreitungsrate des aMPV in Legehennenbetrieben. Bereits in der Aufzucht fand in der Mehrzahl der Herden eine aMPV-Infektion statt; während der Legeperiode kam es zu häufigen Re- oder Neuinfektionen bzw. zu einer langen Persistenz des Virus. Subtyp A kam alleine (51%) mehr als doppelt so häufig vor wie ausschließlich Subtyp B (22%). Doppelinfektionen mit den Subtypen A und B (27%) wurden ungefähr so häufig gefunden wie eine Infektion ausschließlich mit Subtyp B. Ein Wechsel der Subtypen A und B während einer Legeperiode wurde am häufigsten beobachtet: zehn der 18 Herden (56%) zeigten diesen Verlauf. Ausschließlich Subtyp A in allen positiven Entnahmen pro Betrieb wurde in vier von 18 Herden gefunden, ausschließlich Subtyp B in drei von 18 Herden, Subtyp A gemeinsam mit Subtyp B in einer von 18 Herden. Dies verdeutlicht die Dominanz des Subtyps A in Legehennenbetrieben. Obwohl drei Herden während der Aufzucht mit einer Subtyp B-Vakzine geimpft wurden, gelang der aMPV-RNA Nachweis in bis zu vier Probenentnahmen. Der Subtyp A dominierte auch in den geimpften Herden. Neben dem Subtyp B Feldvirus wurde in einer Herde zum Zeitpunkt der Einstallung auch ein Subtyp B ähnlich dem Impfstamm nachgewiesen. Es ist daher davon auszugehen, dass trotz bekannter Kreuzimmunität eine Impfung nicht vor Infektionen schützt, aber die Persistenz von Subtyp B vermindert. Die Analyse der Serumproben mit zwei kommerziellen ELISA-Tests ergab zum Teil konträre Ergebnisse. Da die Diagnose einer aMPV-Infektion häufig nur über diese Methode gestellt wird, ist dies von praktischer Relevanz. Eine Evaluierung des ELISA-Tests mit der höchsten Spezifität und Sensitivität sollte daher folgen.

Este estudo teve como objetivo detectar a presença do vírus da raiva em diferentes órgãos de morcegos do gênero Artibeus empregando as técnicas moleculares como RT-PCR, hnRT-PCR e Real Time RT-PCR. De aproximadamente 4000 espécimes de morcegos recebidas no Instituto Pasteur para o diagnóstico da raiva, foram selecionados 30 morcegos do gênero Artibeus, com resultados positivos para raiva pelas técnicas tradicionais de IFD e inoculação em células N2A utilizando suspensões feitas a partir do SNC. Para as técnicas moleculares, foram retirados glândulas salivares, bexigas urinárias, rins, pulmões e conteúdos fecais e ainda foram lavadas as calotas cranianas dos espécimes. Os órgãos e conteúdos fecais foram diluídos a 1:10 (P/V) e as bexigas urinárias a 1:20 (P/V). As suspensões foram inoculadas em células N2A para o isolamento viral. Foi realizada a extração do RNA total usando o TRIzol®, foram realizadas a transcrição reversa seguida da PCR e hnRT-PCR com utilização de primers específicos para o gene codificante da proteína N. A partir do produto da transcrição reversa foi realizada a técnica de Real Time RT-PCR, utilizando primers e sonda específicos para variante antigênica 3. Das 30 suspensões de lavado cerebral, 28 (93,33%) resultaram positivos, na inoculação em cultura de células, seguido de glândulas salivares (36,67%), bexigas (16,67%) e conteúdos fecais (3,33%). Os resultados encontrados da sensibilidade nas técnicas de RT-PCR, hnRT-PCR e Real Time RT-PCR foram 56,25%, 82,57% e 82,19% quando avaliadas as 180 amostras analisadas. A comparação das técnicas de hnRT-PCR e Real Time RT-PCR feita pelo teste exato de Fisher quanto a proporção de positivos detectados mostrou que para o lavado cerebral, órgãos e conteúdos fecais a proporção foi igual (P>0,05). Em relação à positividade os resultados encontrados nas técnicas de hnRT-PCR e Real Time RT-PCR foram 100% em lavado cerebral; 90% e 93,33% em glândulas salivares; 83,33% e 90% em bexigas; 80% e 93,33% em rins; 76,67% e 50% em pulmões e 43,33% em ambas as técnicas em conteúdos fecais. Esses resultados sugerem que tanto as técnicas de hnRT-PCR como Real Time RT-PCR podem ser utilizadas como métodos complementares para o diagnóstico da raiva e são sensíveis o bastante para o uso em estudos de patogênese. A técnica de Real Time RT-PCR realizada neste estudo se mostrou eficiente em detectar o RABV em diferentes órgãos e tecidos extraneurais com a vantagem de ser uma técnica mais rápida e sensível. / This study was aimed to detect the presence of rabies virus in different organs of the genus Artibeus bats using molecular techniques such as RT-PCR, hnRT-PCR, and the Real Time RT-PCR. From about 4,000 specimens of bats received for rabies diagnosis at the Pasteur Institute, 30 bats of the genus Artibeus were then selected. The selected bats presented positive results by the traditional DFA and N2A-cells inoculation test using brain tissue suspensions. Samples of salivary glands, urinary bladders, kidneys, lungs, and fecal contents and washings of the skulls were collected for the molecular techniques testing. The organs and the fecal contents were diluted at 1:10 (w/v) and the urinary bladder, at 1:20 (w/v) and these suspensions were inoculated into N2A cells for viral isolation. The extraction of the total RNA was performed by using TRIzol® and followed by the reverse transcription and the PCR and the hnRT-PCR were performed by using specific primers for the gene encoding the protein N. The product obtained by the reverse transcription technique was submitted to the Real Time RT-PCR technique, using primers and probe specific for antigenic variant 3 of the rabies virus. Of the 30 suspensions of the brain washings, 28 (93.33%) were positive in N2A cell culture inoculation, followed by the suspensions of the salivary glands (36.67%), bladders (16.67%) and fecal contents (3.33%). For the 180 samples evaluated, the results of sensitivity found for the RT-PCR, hnRT-PCR and Real Time RT-PCR techniques were 56.25%, 82.57%, and 82.19%, respectively. A comparison of hnRT-PCR and Real Time RT-PCR techniques performed by Fisher\'s exact test showed that the proportion of positives detected by the brain washings, organs and of the fecal content was non-significant (P> 0.05). Regarding the results found in hnRT-PCR and Real Time RT-PCR techniques, 100% positives were in brain washing, 90% and 93.33% in salivary glands, 83.33% and 90% in bladders, 80% and 93.33% in kidneys, 76.67% and 50% in lungs and 43.33% for both techniques on fecal contents. These results suggest that both hnRT-PCR and Real-Time PCR techniques can be used as complementary methods for the diagnosis of rabies and are sensitive enough for use in pathogenesis studies. The Real Time RT-PCR technique performed in this study proved to be faster and more sensitive and effective in detecting RABV in different organs and extra neural tissues of bats.

Este estudo teve como objetivo detectar a presença do vírus da raiva em diferentes órgãos de morcegos do gênero Artibeus empregando as técnicas moleculares como RT-PCR, hnRT-PCR e Real Time RT-PCR. De aproximadamente 4000 espécimes de morcegos recebidas no Instituto Pasteur para o diagnóstico da raiva, foram selecionados 30 morcegos do gênero Artibeus, com resultados positivos para raiva pelas técnicas tradicionais de IFD e inoculação em células N2A utilizando suspensões feitas a partir do SNC. Para as técnicas moleculares, foram retirados glândulas salivares, bexigas urinárias, rins, pulmões e conteúdos fecais e ainda foram lavadas as calotas cranianas dos espécimes. Os órgãos e conteúdos fecais foram diluídos a 1:10 (P/V) e as bexigas urinárias a 1:20 (P/V). As suspensões foram inoculadas em células N2A para o isolamento viral. Foi realizada a extração do RNA total usando o TRIzol®, foram realizadas a transcrição reversa seguida da PCR e hnRT-PCR com utilização de primers específicos para o gene codificante da proteína N. A partir do produto da transcrição reversa foi realizada a técnica de Real Time RT-PCR, utilizando primers e sonda específicos para variante antigênica 3. Das 30 suspensões de lavado cerebral, 28 (93,33%) resultaram positivos, na inoculação em cultura de células, seguido de glândulas salivares (36,67%), bexigas (16,67%) e conteúdos fecais (3,33%). Os resultados encontrados da sensibilidade nas técnicas de RT-PCR, hnRT-PCR e Real Time RT-PCR foram 56,25%, 82,57% e 82,19% quando avaliadas as 180 amostras analisadas. A comparação das técnicas de hnRT-PCR e Real Time RT-PCR feita pelo teste exato de Fisher quanto a proporção de positivos detectados mostrou que para o lavado cerebral, órgãos e conteúdos fecais a proporção foi igual (P>0,05). Em relação à positividade os resultados encontrados nas técnicas de hnRT-PCR e Real Time RT-PCR foram 100% em lavado cerebral; 90% e 93,33% em glândulas salivares; 83,33% e 90% em bexigas; 80% e 93,33% em rins; 76,67% e 50% em pulmões e 43,33% em ambas as técnicas em conteúdos fecais. Esses resultados sugerem que tanto as técnicas de hnRT-PCR como Real Time RT-PCR podem ser utilizadas como métodos complementares para o diagnóstico da raiva e são sensíveis o bastante para o uso em estudos de patogênese. A técnica de Real Time RT-PCR realizada neste estudo se mostrou eficiente em detectar o RABV em diferentes órgãos e tecidos extraneurais com a vantagem de ser uma técnica mais rápida e sensível. / This study was aimed to detect the presence of rabies virus in different organs of the genus Artibeus bats using molecular techniques such as RT-PCR, hnRT-PCR, and the Real Time RT-PCR. From about 4,000 specimens of bats received for rabies diagnosis at the Pasteur Institute, 30 bats of the genus Artibeus were then selected. The selected bats presented positive results by the traditional DFA and N2A-cells inoculation test using brain tissue suspensions. Samples of salivary glands, urinary bladders, kidneys, lungs, and fecal contents and washings of the skulls were collected for the molecular techniques testing. The organs and the fecal contents were diluted at 1:10 (w/v) and the urinary bladder, at 1:20 (w/v) and these suspensions were inoculated into N2A cells for viral isolation. The extraction of the total RNA was performed by using TRIzol® and followed by the reverse transcription and the PCR and the hnRT-PCR were performed by using specific primers for the gene encoding the protein N. The product obtained by the reverse transcription technique was submitted to the Real Time RT-PCR technique, using primers and probe specific for antigenic variant 3 of the rabies virus. Of the 30 suspensions of the brain washings, 28 (93.33%) were positive in N2A cell culture inoculation, followed by the suspensions of the salivary glands (36.67%), bladders (16.67%) and fecal contents (3.33%). For the 180 samples evaluated, the results of sensitivity found for the RT-PCR, hnRT-PCR and Real Time RT-PCR techniques were 56.25%, 82.57%, and 82.19%, respectively. A comparison of hnRT-PCR and Real Time RT-PCR techniques performed by Fisher\'s exact test showed that the proportion of positives detected by the brain washings, organs and of the fecal content was non-significant (P> 0.05). Regarding the results found in hnRT-PCR and Real Time RT-PCR techniques, 100% positives were in brain washing, 90% and 93.33% in salivary glands, 83.33% and 90% in bladders, 80% and 93.33% in kidneys, 76.67% and 50% in lungs and 43.33% for both techniques on fecal contents. These results suggest that both hnRT-PCR and Real-Time PCR techniques can be used as complementary methods for the diagnosis of rabies and are sensitive enough for use in pathogenesis studies. The Real Time RT-PCR technique performed in this study proved to be faster and more sensitive and effective in detecting RABV in different organs and extra neural tissues of bats.

Legeleistungseinbußen – vor allem mit verminderter Eischalenqualität – stellen in einem Legehennenbetrieb hohe wirtschaftliche Verluste dar. Impfungen gegen entsprechende Erreger, u.a. gegen das aviäre Metapneumovirus (aMPV), sind daher weit verbreitet. AMPV ist seit den 70er Jahren als Auslöser der Rhinotracheitis der Puten (Turkey Rhinotracheitis; TRT) und des sogenannten Swollen Head Syndroms (SHS) der Hühner bekannt. Jedoch liegen nur wenige epidemiologische Studien zu der Verbreitung des Virus und dessen Subtypen in Legehennenbetrieben vor. Ziel der vorliegenden Studie war es daher, die Verbreitung des aMPV, vor allem der Subtypen A und B, zu unterschiedlichen Zeiten der Legeperiode zu untersuchen, um ein besseres Verständnis über den Zeitpunkt der Erstinfektionen sowie evtl. Re- oder Neuinfektionen zu erhalten. Dafür wurden erstmals 18 Legehennenherden in Sachsen alle drei Monate über die gesamte Legeperiode auf das Vorkommen von aMPV-RNA und aMPV-spezifischer Antikörper untersucht. Verschiedene Haltungssysteme wurden berücksichtigt, um ein unterschiedliches seuchenhygienisches Risiko unter Praxisbedingungen bewerten zu können. Pro Herde wurden von je zehn Hühnern Trachealtupfer und Serumproben entnommen. Die Tupferproben wurden mittels duplex nested RT-PCR untersucht, die Serumproben mittels zweier kommerzieller ELISA-Tests. In jeder Herde gelang der aMPV-RNA-Nachweis mindestens einmal zu unterschiedlichen Zeitpunkten. Bereits bei der Einstallung konnten in 17 Herden aMPV-spezifische Antikörper und/oder aMPV-RNA nachgewiesen werden. Diese Ergebnisse zeigen die hohe Verbreitungsrate des aMPV in Legehennenbetrieben. Bereits in der Aufzucht fand in der Mehrzahl der Herden eine aMPV-Infektion statt; während der Legeperiode kam es zu häufigen Re- oder Neuinfektionen bzw. zu einer langen Persistenz des Virus. Subtyp A kam alleine (51%) mehr als doppelt so häufig vor wie ausschließlich Subtyp B (22%). Doppelinfektionen mit den Subtypen A und B (27%) wurden ungefähr so häufig gefunden wie eine Infektion ausschließlich mit Subtyp B. Ein Wechsel der Subtypen A und B während einer Legeperiode wurde am häufigsten beobachtet: zehn der 18 Herden (56%) zeigten diesen Verlauf. Ausschließlich Subtyp A in allen positiven Entnahmen pro Betrieb wurde in vier von 18 Herden gefunden, ausschließlich Subtyp B in drei von 18 Herden, Subtyp A gemeinsam mit Subtyp B in einer von 18 Herden. Dies verdeutlicht die Dominanz des Subtyps A in Legehennenbetrieben. Obwohl drei Herden während der Aufzucht mit einer Subtyp B-Vakzine geimpft wurden, gelang der aMPV-RNA Nachweis in bis zu vier Probenentnahmen. Der Subtyp A dominierte auch in den geimpften Herden. Neben dem Subtyp B Feldvirus wurde in einer Herde zum Zeitpunkt der Einstallung auch ein Subtyp B ähnlich dem Impfstamm nachgewiesen. Es ist daher davon auszugehen, dass trotz bekannter Kreuzimmunität eine Impfung nicht vor Infektionen schützt, aber die Persistenz von Subtyp B vermindert. Die Analyse der Serumproben mit zwei kommerziellen ELISA-Tests ergab zum Teil konträre Ergebnisse. Da die Diagnose einer aMPV-Infektion häufig nur über diese Methode gestellt wird, ist dies von praktischer Relevanz. Eine Evaluierung des ELISA-Tests mit der höchsten Spezifität und Sensitivität sollte daher folgen.

Várias zoonoses virais acometem equídeos causando quadros neurológicos, entre as quais a raiva e as encefalites equinas do Leste (EEE) e Oeste (WEE). O diagnóstico clínico geralmente não é conclusivo, o que torna imprescindível o diagnóstico laboratorial. Dados do Laboratório de Diagnóstico de Raiva do Instituto Pasteur de São Paulo, entre os anos 2000 e 2010, mostram que aproximadamente 75% das amostras enviadas foram negativas para raiva, ressaltando a relevância da realização de um diagnóstico diferencial para as encefalites equinas causadas por alfavírus. Os objetivos do estudo foram testar a adequação do uso de multiplex hemi-nested RT-PCR para o diagnóstico de raiva, EEE e WEE em amostras de sistema nervoso central de equídeos e realizar uma análise de custo das reações de cada técnica. Foram utilizados os primers 21G, 304 e 504 dirigidos ao gene N do vírus da raiva, e os primers cM3W, M2W, nEEE e nWEE dirigidos ao gene NSP1 dos vírus da EEE e WEE. Procedeu-se a um estudo preliminar dos primers e de seu uso em uma hemi-nested RT-PCR, avaliando a temperatura ótima de anelamento, a sensibilidade e especificidade analíticas e a reprodutibilidade da técnica em amostras de campo positivas para raiva e para EEE. A partir do protocolo estabelecido na reação de hemi-nested RT-PCR, realizaram-se variações de concentração de reagentes no protocolo para a reação de multiplex hemi-nested RT-PCR. Após o estabelecimento do protocolo para esta reação, os mesmos testes para verificação da sensibilidade e especificidade analíticas e da reprodutibilidade foram realizados, comparando-se os resultados com os obtidos pela hemi-nested RT-PCR. No teste de limiar de detecção, a sensibilidade analítica foi semelhante para as duas técnicas, obtendo-se 10&#45;1,7 para os três vírus padrão CVS, EEEV e WEEV. No teste de limiar de detecção utilizando uma amostra com os três vírus verificou-se uma alta especificidade dos primers, sendo que na reação de multiplex hemi-nested RT-PCR foi possível detectar simultaneamente os três vírus padrão. Não houve diferença nas proporções de amostras detectadas como positivas para raiva obtidas pelas duas técnicas, analisando-se pelo teste exato de Fisher (P=1,0000). No entando, para amostras de campo positivas para EEE, a proporção de amostras detectadas como positivas pela hemi-nested RT-PCR foi maior do que a proporção obtida pela multiplex hemi-nested RT-PCR (P<0,0001). Apesar de não ter sido possível o uso de amostras de campo positivas para WEE nesse estudo, os resultados sugerem que seria possível a detecção pela multiplex hemi-nested RT-PCR. Estes dados sugerem que a técnica de multiplex hemi-nested RT-PCR poderia ser aplicada para detecção de raiva e WEE, mas com limitações para a detecção de EEE. Pela análise de custo dos reagentes, o valor de uma reação de multiplex hemi-nested RT-PCR é semelhante ao de uma hemi-nested RT-PCR, podendo representar uma economia de pelo menos 49,17%. / Several viral zoonoses affect the equids causing neurological diseases, including rabies and Eastern and Western equine encephalitides (EEE and WEE). Clinical diagnosis is often not conclusive, in a way that laboratory diagnosis is essential. Data from the Laboratory of Rabies Diagnosis at the Pasteur Institute of São Paulo, between 2000 and 2010, demonstrate that approximately 75% of submitted equid samples were negative for rabies, emphasizing the importance of achieving a differential diagnosis for equine encephalitis caused by alphaviruses. The aims of this study were to test the suitability of using multiplex hemi-nested RT-PCR for the diagnosis of rabies, EEE and WEE in equids central nervous system samples and to perform a cost analysis of the reactions of each technique. We used the primers 21G, 304 and 504 directed to the N gene of rabies virus, and the primers cM3W, M2W, nEEE and nWEE directed the NSP1 gene of WEE and EEE viruses. A preliminary study of the primers was carried out, as well as their use in a hemi-nested RT-PCR, evaluating the optimal annealing temperature, the analytical sensitivity and specificity and the reproducibility of the technique in positive field samples for rabies and EEE. From the protocol established for the hemi-nested RT-PCR, variations in reagents concentrations for the multiplex hemi-nested RT-PCR protocol were perfomed. After establishing the protocol for this reaction, the same tests to verify the analytical sensitivity and specificity and reproducibility were performed and the results compared to those obtained by hemi-nested RT-PCR. In the detection threshold test, the analytical sensitivity was similar for both techniques, resulting in 10&#45;1.7 for the three virus standard CVS, and EEEV WEEV. In the detection threshold test using a sample with the three viruses, a high specificity of the primers was verified and the multiplex hemi-nested RT-PCR was able to detect the three viruses simultaneously. There was no difference in the proportions of samples detected as positive for rabies obtained by both techniques, according to the Fisher exact test (P = 1.0000). However, for EEE positive field samples, the proportion of samples detected as positive by the hemi-nested RT-PCR was higher than the proportion obtained by multiplex hemi-nested RT-PCR (P <0.0001). Although it was not possible to use WEE positive field samples in this study, the results suggest that its detection would be possible by multiplex hemi-nested RT-PCR. Thus, data suggest that the multiplex hemi-nested RT-PCR technique could be applied to detect rabies and WEE, but with limitations for the EEE detection. For the analysis of reagent costs, the cost of one multiplex hemi-nested RT-PCR is similar to one hemi-nested RT-PCR, and may represent a saving of 49,17% at least.

Várias zoonoses virais acometem equídeos causando quadros neurológicos, entre as quais a raiva e as encefalites equinas do Leste (EEE) e Oeste (WEE). O diagnóstico clínico geralmente não é conclusivo, o que torna imprescindível o diagnóstico laboratorial. Dados do Laboratório de Diagnóstico de Raiva do Instituto Pasteur de São Paulo, entre os anos 2000 e 2010, mostram que aproximadamente 75% das amostras enviadas foram negativas para raiva, ressaltando a relevância da realização de um diagnóstico diferencial para as encefalites equinas causadas por alfavírus. Os objetivos do estudo foram testar a adequação do uso de multiplex hemi-nested RT-PCR para o diagnóstico de raiva, EEE e WEE em amostras de sistema nervoso central de equídeos e realizar uma análise de custo das reações de cada técnica. Foram utilizados os primers 21G, 304 e 504 dirigidos ao gene N do vírus da raiva, e os primers cM3W, M2W, nEEE e nWEE dirigidos ao gene NSP1 dos vírus da EEE e WEE. Procedeu-se a um estudo preliminar dos primers e de seu uso em uma hemi-nested RT-PCR, avaliando a temperatura ótima de anelamento, a sensibilidade e especificidade analíticas e a reprodutibilidade da técnica em amostras de campo positivas para raiva e para EEE. A partir do protocolo estabelecido na reação de hemi-nested RT-PCR, realizaram-se variações de concentração de reagentes no protocolo para a reação de multiplex hemi-nested RT-PCR. Após o estabelecimento do protocolo para esta reação, os mesmos testes para verificação da sensibilidade e especificidade analíticas e da reprodutibilidade foram realizados, comparando-se os resultados com os obtidos pela hemi-nested RT-PCR. No teste de limiar de detecção, a sensibilidade analítica foi semelhante para as duas técnicas, obtendo-se 10&#45;1,7 para os três vírus padrão CVS, EEEV e WEEV. No teste de limiar de detecção utilizando uma amostra com os três vírus verificou-se uma alta especificidade dos primers, sendo que na reação de multiplex hemi-nested RT-PCR foi possível detectar simultaneamente os três vírus padrão. Não houve diferença nas proporções de amostras detectadas como positivas para raiva obtidas pelas duas técnicas, analisando-se pelo teste exato de Fisher (P=1,0000). No entando, para amostras de campo positivas para EEE, a proporção de amostras detectadas como positivas pela hemi-nested RT-PCR foi maior do que a proporção obtida pela multiplex hemi-nested RT-PCR (P<0,0001). Apesar de não ter sido possível o uso de amostras de campo positivas para WEE nesse estudo, os resultados sugerem que seria possível a detecção pela multiplex hemi-nested RT-PCR. Estes dados sugerem que a técnica de multiplex hemi-nested RT-PCR poderia ser aplicada para detecção de raiva e WEE, mas com limitações para a detecção de EEE. Pela análise de custo dos reagentes, o valor de uma reação de multiplex hemi-nested RT-PCR é semelhante ao de uma hemi-nested RT-PCR, podendo representar uma economia de pelo menos 49,17%. / Several viral zoonoses affect the equids causing neurological diseases, including rabies and Eastern and Western equine encephalitides (EEE and WEE). Clinical diagnosis is often not conclusive, in a way that laboratory diagnosis is essential. Data from the Laboratory of Rabies Diagnosis at the Pasteur Institute of São Paulo, between 2000 and 2010, demonstrate that approximately 75% of submitted equid samples were negative for rabies, emphasizing the importance of achieving a differential diagnosis for equine encephalitis caused by alphaviruses. The aims of this study were to test the suitability of using multiplex hemi-nested RT-PCR for the diagnosis of rabies, EEE and WEE in equids central nervous system samples and to perform a cost analysis of the reactions of each technique. We used the primers 21G, 304 and 504 directed to the N gene of rabies virus, and the primers cM3W, M2W, nEEE and nWEE directed the NSP1 gene of WEE and EEE viruses. A preliminary study of the primers was carried out, as well as their use in a hemi-nested RT-PCR, evaluating the optimal annealing temperature, the analytical sensitivity and specificity and the reproducibility of the technique in positive field samples for rabies and EEE. From the protocol established for the hemi-nested RT-PCR, variations in reagents concentrations for the multiplex hemi-nested RT-PCR protocol were perfomed. After establishing the protocol for this reaction, the same tests to verify the analytical sensitivity and specificity and reproducibility were performed and the results compared to those obtained by hemi-nested RT-PCR. In the detection threshold test, the analytical sensitivity was similar for both techniques, resulting in 10&#45;1.7 for the three virus standard CVS, and EEEV WEEV. In the detection threshold test using a sample with the three viruses, a high specificity of the primers was verified and the multiplex hemi-nested RT-PCR was able to detect the three viruses simultaneously. There was no difference in the proportions of samples detected as positive for rabies obtained by both techniques, according to the Fisher exact test (P = 1.0000). However, for EEE positive field samples, the proportion of samples detected as positive by the hemi-nested RT-PCR was higher than the proportion obtained by multiplex hemi-nested RT-PCR (P <0.0001). Although it was not possible to use WEE positive field samples in this study, the results suggest that its detection would be possible by multiplex hemi-nested RT-PCR. Thus, data suggest that the multiplex hemi-nested RT-PCR technique could be applied to detect rabies and WEE, but with limitations for the EEE detection. For the analysis of reagent costs, the cost of one multiplex hemi-nested RT-PCR is similar to one hemi-nested RT-PCR, and may represent a saving of 49,17% at least.