Les malalties neurodegeneratives es desenvolupen gràcies a diferents mecanismes moleculars, que produeixen agregació de proteïnes mal plegades en diverses àrees cerebrals. D'una banda, l'α-sinucleïna es troba als cossos de Lewy presents a la malaltia de Parkinson i a les demències amb cossos de Lewy (DCL: DCL de tipus pur, DCLp; DCL de tipus comuna, DCLc) i a les inclusions citoplasmàtiques glials, que són la característica neuropatològica de l'atròfia multisistèmica (AMS). D'altra banda, les plaques senils formades principalment per β-amiloide i cabdells neurofibril·lars amb tau hiperfosforilada són la peculiaritat principal de la malaltia d'Alzheimer (MA). A més, la MA es caracteritza per un dèficit colinèrgic, el qual és encara més acusat a les DCL. En el present treball s'ha estudiat la genètica de la butirilcolinesterasa (BChE), un enzim de tipus glicoproteic que intervé en el metabolisme de l'acetilcolina, sobre les sinucleïnopaties en comparació amb la MA com a control de neurodegeneració, així com mostres control. L'estudi es va iniciar analitzant la freqüència de la variant K (A1699G, A539T) de BChE que està descrit com un possible factor de risc a patir la MA a les mostres post mortem (25 MA, 12 DCLp, 24 DCLc, 5 MP, 6 AMS i 25 controls). Es va observar una marcada acumulació de l'al·lel K de BChE en totes les demències en comparació amb els controls. A continuació es va caracteritzar el promotor de BChE mitjançant seqüenciació i s'hi van trobar quatre polimorfismes no descrits. Aquests es van genotipar a totes les mostres post mortem i els resultats van ser analitzats conjuntament per identificar possibles combinacions genotípiques específiques formades pels polimorfismes del promotor i la variant K de BChE. El resultat més rellevant va ser la detecció d'una combinació genotípica, AAAGCC8+K+, específica per al 17% de les mostres amb DCL. L'aplicació del genotipat de BChE com a eina per al diagnòstic diferencial augmentaria l'especificitat diagnòstica de les DCL, que tot i que l'any 2005 es van establir nous criteris per al seu diagnòstic clínic, es diagnostiquen erròniament entre el 40 i el 80 % dels casos. Per corroborar les dades obtingudes a partir de mostres post mortem, es va fer un estudi a partir de mostres de sang de 230 pacients amb MA, 21 amb AMS, 23 amb MP i 160 controls. Per completar l'anàlisi de BChE, es va analitzar l'expressió relativa de les quatre variants de splicing a nivell d'mRNA al còrtex frontal, còrtex temporal, nucli caudat i cerebel utilitzant PCR a temps real. El resultat va ser l'obtenció de patrons d'expressió determinats per a cada malaltia estudiada. Finalment, per immunohistoquímica es va concloure que BChE no es troba en els cossos de Lewy, ja que no colocalitza amb α-sinucleïna. Encara que per a la MA s'han descrit diferents marcadors genètics, fins al moment no se'n coneix cap per a les DCL. Mentre que els patrons d'expressió de mRNA característics de cada patologia trobats poden ajudar a elucidar els possibles mecanismes moleculars involucrats en el desenvolupament de les DCL, la determinació de les combinacions genotípiques específiques podran ajudar en el seu diagnòstic diferencial. / Neurodegenerative diseases develop through different molecular mechanisms that produce aggregation of unfolded proteins in different brain areas. On one hand, α-synuclein is present in Lewy bodies that can be found in Parkinson's disease and in dementia with Lewy bodies (DLB: pure DLB, pDLB; common DLB, cDLB) and in glial cytoplasmic inclusions (GCI) that are the pathological hallmark of multiple system atrophy (MSA). On the other hand, senile plaques composed primarily of β-amyloid and neurofibrillary tangles with hyperphosphorilated tau are the main characteristic of Alzheimer's disease (AD). In addition, AD is characterized by a cholinergic deficit, which is even more pronounced in DLB. In this thesis we have studied Butyrylcholinesterase (BChE), a glycoproteic enzyme that mediates acetylcholine metabolism, in synucleinopathies compared with AD, as a control of neurodegeneration, as well as, with control samples.The study began by analysing the frequency of BChE K-variant (A1699G, A539T), that is described as a possible risk factor to suffer AD, in post mortem samples (25 AD, 12 pDLB , 24 cDLB, 5 PD, 6 MSA and 25 controls). There was a marked accumulation of BChE K allele in all dementias compared with controls.Then BChE promoter was characterized and four new polymorphisms were found. These were genotyped in all post mortem samples, results were analyzed together to identify specific genotypic combinations formed by polymorphisms of the promoter and BChE K-variant. The most relevant result was the detection of a genotypic combination, AAAGCC8+K+, specific for 17% of DLB samples. The application of BChE genotyping as a tool for differential diagnosis would increase the diagnostic specificity of DLB, that although in 2005 new criteria for its clinical diagnosis were established, between 40-80% cases are misdiagnosed. To corroborate the data obtained from post mortem samples, a study from blood samples of 230 AD patients, 21 with MSA, 23 with PD and 160 controls was done.To complete the analysis of BChE, we examined the relative expression of four splice variants in frontal cortex, temporal cortex, caudate nucleus and cerebellum using real time PCR. Specific expression patterns for each disease studied were obtained. Finally, immunohistochemistry concluded that BChE is not found in Lewy bodies, as it does not colocalize with α-synuclein.Although several AD genetic markers have been described, until this moment none is known for DLB. While the mRNA expression patterns characteristic of the disease may help to elucidate the possible molecular mechanisms involved in the development of DLB, the determination of the specific genotypic combination can help in their differential diagnosis.

L’àcid 3-nitropropiònic (3NP) és una toxina d’origen vegetal la ingesta de la qual produeix, en humans, una síndrome neurològica que presenta una simptomatologia similar a la de la malaltia de Huntington (MH). Injectada a rosegadors o primats, la toxina s’ha utilitzat per desenvolupar models animals de la MH, ja que els produeix lesions similars a les observades a l’esmentada malaltia, consistents en una afectació específica del cos estriat del seus cervells. A nivell bioquímic, aquesta molècula inhibeix de forma irreversible la succinat deshidrogenasa mitocondrial, i per tant el complex II de la cadena respiratòria. Això provoca una disminució a la producció d’ATP, punt de posada en marxa dels mecanismes d’excitotoxicitat secundària i de producció d’espècies reactives d’oxigen i per tant, de l’estrès oxidatiu, que porten a l’activació de diferents vies metabòliques de la neurona responsables de la seva mort, com són la necrosi o l’apoptosi mediades per l’activació de calpaïnes i caspases respectivament. Pel que fa a l’apoptosi, es pensa que la reactivació del cicle cel•lular podria estar involucrada en la seva activació. Reforçant aquesta idea, nombrosos estudis han detectat activació de diferents proteïnes reguladores del cicle cel•lular en teixit post mortem de pacients afectats de malalties neurodegeneratives. Per altra banda, el 3NP produeix alteracions a la permeabilitat de la barrera hematoencefàlica (BHE) dels rosegadors tractats i, recentment, s’ha vist que un dels mecanismes que pot estar implicat en aquest fet és la digestió per part de la gelatinasa MMP-9. Així, els objectius d’aquesta tesi consisteixen en estudiar la possible participació de la reactivació del cicle cel•lular en la neurodegeneració induïda en rates per l’administració del 3NP, i per altra banda caracteritzar les alteracions de la permeabilitat de la BHE i el paper que les gelatinases MMP-2 i MMP-9 i altres tipus cel•lulars com astròcits i micròglia hi poden jugar. Pel que fa al primer objectiu, s’ha vist que, tot i que s’ha detectat l’activació d’elements del cicle cel•lular a la lesió dels animals tractats, la reactivació del cicle cel•lular no intervé en la posada en marxa de la neurodegeneració provocada per la toxina, i s’ha arribat a la conclusió que l’expressió d’aquests elements pot estar relacionada amb una resposta tardana encaminada a la supervivència cel•lular. A partir d’aquí, s’han estudiat diferents proteïnes que poden estar relacionades amb la mort neuronal, com ATM, p53, Akt i GSK3beta. Els resultats que s'han obtingut en aquest cas indiquen que la pèrdua de la forma activa de l’Akt i la inhibició de la GSK3beta poden estar relacionades amb la neurodegeneració induïda pel 3NP. Pel que fa a l’estudi de les alteracions de la BHE, s’ha observat que, a la zona lesionada dels animals tractats amb 3NP, hi ha una gran alteració dels seus components com són les cèl•lules endotelials, la proteïna de les unions estretes ZO-1 i la laminina, component bàsic de la membrana basal dels vasos. Finalment, s’ha comprovat que la MMP-9 i la micròglia reactiva juguen un paper destacat a la degradació de la microvasculatura cerebral afectada per l’administració del 3NP. / 3-nitropropionic acid (3-NPA) is a natural toxin that provokes, in humans, a neurological symptomatology which is similar to that observed in Huntington’s disease (HD). When injected to rodents or primates, it produces cerebral lesions, mainly located in their striata, which are similar to those observed in the brains of HD patients. 3-NPA irreversibly inhibits mitochondrial succinate dehidrogenase, which in turn causes a decrease in ATP production that triggers secondary excitotoxicity and reactive oxygen species production. These events lead neurons to their death by necrosis or apoptosis. It has been suggested that cell cycle re-entry may be involved in the activation of the apoptotic cascade. Reinforcing this, the activation of different cell cycle elements has been detected in post mortem brains of pacients affected by neurodegenerative diseases. Furthermore, blood brain barrier (BBB) disfunction has been detected in rodents administrated with 3-NPA, and it has been recently proposed that matrix metalloproteinase-9 (MMP-9) is involved in this process. The main objectives of this work were to study the role of cell cycle re-entry in the striatal neurodegeneration induced by 3-NPA and to characterize the alterations of BBB permeability. Regarding BBB impairment, the role of MMP-2 and MMP 9 and other cellular types such as astrocytes and microglia was considered. Although activation of G1 phase cell cycle elements was detected in the striatal lesion of 3-NPA treated rats, it was concluded that cell cycle re-entry was not involved in the activation of the neurodegenerative process, but it might be related to a late survival response. Moreover, it was shown that the loss of the active form of Akt and the inhibition of GSK3beta might be linked to the striatal neurodegeneration induced by 3-NPA. Furthermore, severe alterations in the permeability of the BBB and in the staining pattern of some of its components such as endothelial cells, tight junctions and basement membrane were detected in the striatal lesion of treated rats. Finally, gelatinolytic activity, which was mainly attributed to MMP-9, and reactive microglia were profusely detected around the injured vessels in the striatal lesion of 3-NPA, indicating that they might play a determinant role in BBB disruption in this model

DE LA TESI:L´apoptosi és un dels principals tipus de mort cel.lular programada i es caracteritza per ser un procés actiu encaminat a produir la mort cel.lular de manera controlada. Aquest procés juga un paper important en el correcte desenvolupament del sistema nerviós central, ja que permet l'eliminació de les cèl.lules innecessàries. En canvi, l´activació anòmala d´aquest mecanisme en el cervell adult contribueix de manera significativa en el desencadenament de moltes malalties neurodegeneratives, com són la malaltia d´Alzheimer o la de Parkinson entre d´altres. Així doncs, la determinació i comprensió de les diferents rutes senyalitzadores pro-apoptòtiques involucrades en aquestes malalties permetrà identificar noves dianes terapèutiques.L´objectiu d´aquesta tesi doctoral ha estat estudiar el paper anti-apoptòtic en neurones granulars de cerebel (CGNs) dels inhibidors de dos proteïnes cinases: la Glycogen Sinthase Kinase-3beta (GSK-3beta) i la c-Jun NH2-terminal Kinase (JNK), i determinar per quines rutes senyalitzadores protegeixen a les neurones de la mort apoptòtica provocada per la deprivació de sèrum i potassi (DV S/K). El model escollit per realitzar aquests estudis ha estat la DV S/K en cultius primaris de CGNs, ja que permet reproduir in vitro la mort neuronal programada provocada per la deprivació de factors tròfics.En quant a la GSK-3beta s´ha demostrat que la seva inhibició protegeix de la mort induïda per la DV S/K i que aquesta protecció ve donada, com a mínim, per dos mecanismes no descrits prèviament. En primer lloc s´ha determinat que la GSK-3beta intervé en l'activació anòmala del cicle cel.lular, fet que en CGNs condueix a l'activació de l'apoptosi, i en segon lloc que la GSK-3beta intervé en l'alliberament desde els mitocondris de la proteína pro-apoptòtica AIF. En quant a la JNK també s'ha detectat que la seva inhibició protegeix d'aquest estímul apoptòtic i que una de les raons subjacents a aquest fet, és que la inhibició de la JNK manté activa la via de supervivència de l'AKT.La conclusió final d'aquesta tesi doctoral és que tant la GSK-3beta com la JNK tenen un paper clau en l'activació de l'apoptosi en neurones i que per aquest motiu podrien ser considerades potencials dianes farmacològiques per tractar malalties neurodegeneratives.

No description available.

Parkinson’s disease (PD) is an incurable, chronically progressive neurodegenerative disease leading to premature invalidity and death. The locomotor disability of PD patients is mainly rooted in the gradual and insidious degeneration of dopaminergic neurons (DA) projecting from the midbrain substantia nigra (SN) to the basal ganglia striatum, a pathological process highlighted microscopically by the formation of insoluble cytosolic protein aggregates, known as Lewy bodies and Lewy neurites. The pathogenic mechanisms leading to PD remain poorly understood, arguably owing to the lack of suitable animal and cellular experimental models of the disease. Therefore, there is an urgent need for developing reliable experimental models that recapitulate the key features of PD. The recent development of induced pluripotent stem cell (iPSC) technology has enabled the generation of patient-specific iPSC and their use to model human diseases, although it is currently unclear whether this approach could be useful to successfully model age-related conditions. Importantly, disease modeling using iPSC largely relies on the existence of efficient protocols for the differentiation of disease-relevant cell types. Here, we first developed an efficient protocol for the differentiation of iPSC to authentic midbrain-specific DA neurons with SN properties by forced expression of LMX1A using a lentivirus-mediated gene delivery system. Next, we generated an iPSC-based cellular model of PD that recapitulates key phenotypic features of PD, such as DA neuron loss and α-synuclein accumulation in DA neurons from PD patients. Overall, our results demonstrate that we have developed a valuable tool for elucidating the pathogenic mechanisms leading to PD, as well as an experimental platform for screening new drugs that may prevent or rescue neurodegeneration in PD. / La malaltia de Parkinson (MP) és una malaltia neurodegenerativa incurable que causa invalidesa i mort prematura. Els pacients de la malaltia de Parkinson presenten alteracions motores degudes a una degeneració gradual de les neurones dopaminèrgiques que projecten des de la substància nigra fins a l’estriat. A nivell microscòpic s’observa la presència d’agregats proteics insolubles en el citosol de les neurones coneguts com cossos o neurites de Lewy. Els mecanismes patològics responsables de la MP no es coneixen bé, possiblement a causa de la manca de models animals i cel•lulars adequats. Per tant, existeix una gran necessitat de desenvolupar models experimentals fiables que recapitulin les característiques bàsiques de la MP. El recent desenvolupament de les cèl•lules mare pluripotents induïdes (iPSC) ha permès la generació de iPSC específiques de pacient i el seu ús per modelar malalties humanes, ara bé, no és clar si aquesta estratègia es pot utilitzar per modelar exitosament malalties d’origen tardà, com ara la MP. És important destacar que el modelatge de malalties utilitzant iPSC, es basa, en gran mesura en l'existència de protocols eficients per a la diferenciació de les iPSC cap al tipus cel•lular rellevant per a la malaltia. Durant aquest període, per primera vegada, s’ha desenvolupat un protocol per a l’eficient diferenciació de les iPSC cap a neurones dopaminèrgiques amb les propietats característiques de neurones dopaminèrgiques nigrostriatals, mitjançant l’expressió forçada de LMX1A utilitzant vectors lentivirals. A continuació, s’ha generat un model cel•lular usant iPSC derivades de pacients de MP que recapitula les principals característiques fenotípiques de la malaltia, com ara la pèrdua de neurones dopaminèrgiques i l'acumulació de α-sinucleïna en les neurones dopaminèrgiques. En general, els nostres resultats demostren que hem desenvolupat una eina valuosa per a l’estudi dels mecanismes patològics que condueixen a la MP, així com una nova plataforma pel descobriment de nous fàrmacs encaminats a prevenir o evitar la neurodegeneració.

En la present tesi doctoral es va establir i calcular els factors genètics de risc per a la forma tardana de la malaltia d'Alzheimer (MA). Foren analitzats un total de 15 variants gèniques (polimorfismes) ubicats en alguns dels gens candidats que codifiquen per a proteïnes involucrades en la fisiopatologia de la MA. Les freqüències gèniques i genotípiques de tots els polimorfismes, així com les freqüències haplotípiques d'aquelles variants que estaven en desequilibri de lligament, foren comparades entre una població de 136 individus amb diagnòstic clínic de MA i una població de 91 individus sense deteriorament cognitiu (tots amb edats superiors als 65 anys i sense cap relació de parentesc).Es va trobar una associació estadísticament significativa entre l'al·lel e4 del gen APOE i la MA (OR ajustada per sexe i edat de 7.8), així com una altre associació positiva entre el polimofisme *159C/T del gen Neprilysin i la MA (OR del subgrup menor de 75 anys i homozigots CC = 2.87). Finalment, es va trobar una sobre representació significativa del genotip GG, situat en l'exó 5 del gen BACE1, en els pacients d'Alzheimer (OR = 2.14 ). També es va obtenir una associació significativa entre el polimorfisme analitzat en el gen HSP70-2 i la presència de simptomatologia no cognitiva en els pacients que havien estat avaluats amb test neuropsiquiàtric (NPI).Tots aquests estudis confirmen la base genètica de la forma tardana de la MA i demostren la importància de l'epidemiologia genètica i dels estudis de tipus cas-control en aquelles malalties complexes com la MA. / En la presente tesis doctoral se establecieron y calcularon los factores genéticos de riesgo para la forma tardía de la enfermedad de Alzheimer (EA). Para ello se analizaron un total de 15 variantes génicas (polimorfismos) que se encuentran en algunos de los genes candidatos que codifican proteínas involucradas en la fisiopatología de la EA. Las frecuencias génicas y genotípicas de todos los polimorfismos, así como las frecuencias haplotípicas de aquellos polimorfismos que se encontraron en desequilibrio de ligamiento, fueron comparadas entre una población de 136 individuos con diagnóstico clínico de EA y una población de 91 individuos sin deterioro cognitivo (todos con edades superiores a los 65 años y sin relación de parentesco).Se halló una asociación estadísticamente significativa entre el alelo e4 del gen APOE y la EA (OR ajustada por sexo y edad de 7.8), así como otra asociación positiva entre el polimofismo *159C/T del gen Neprilysin y la EA (OR del subgrupo menor de 75 años y homocigotos CC = 2.87). Finalmente, se encontró una sobre representación significativa del genotipo GG, situado en el exón 5 del gen BACE1, en los pacientes de Alzheimer (OR = 2.14 ). También se obtuvo una asociación significativa entre el polimorfismo analizado en el gen HSP70-2 y la presencia de sintomatología no cognitiva en los pacientes que habían sido evaluados con test neuropsiquiátrico (NPI).Todos estos estudios confirman la base genética de la forma tardía de la EA y demuestran la importancia de la epidemiología genética y de los estudios de tipo caso-control en aquellas enfermedades complejas como la EA. / In the present thesis, genetic risk factors for late onset Alzheimer's disease (AD) have been evaluated. A total of 15 polymorphisms located in several candidate genes involved in AD pathophysiology were analysed in a sample set comprising 136 AD patients and 91 non-demented elderly control individuals. A statistically significant association was found between the e4 allele of the APOE gene and AD (age- and sex-adjusted OR = 7.8). An association was also found between the *159C/T polymorphism located at the Nerprilysin gene (the OR for those individuals younger than 75 years old and homozygous for the C allele was 2.87). Finally, an over representation of the GG genotype of the BACE1 exon 5 was found in AD patients compared to controls (OR = 2.14). An elevated propensity to develop non-cognitive alterations in AD patients was found to be associated with the A2 allele of the HSP70-2 gene.All of these results confirm the genetic susceptibility to AD and clearly demonstrate the usefulness of genetic epidemiology tools as well as the case-control approaches in identifying genes related to complex disorders such as AD.