La acumulación de hierro (Fe) y el estrés oxidativo son eventos patognomónicos de las retinas de pacientes que padecen degeneración macular relacionada con la edad (AMD, del inglés age-related macular degeneration). En este trabajo de tesis hemos caracterizado un modelo de sobrecarga de Fe en retinas bovinas incubadas in vitro con la finalidad de estudiar los eventos que ocurren en la degeneración retiniana provocada por el estrés oxidativo. Específicamente, hemos estudiado la función de las siguientes isoformas de la fosfolipasa A2 (PLA2): la isoforma citosólica (cPLA2), la isoforma independiente de calcio (iPLA2) y la isoforma secretoria (sPLA2), durante la toxicidad retiniana inducida por Fe2+. También analizamos las implicancias de las diferentes PLA2s en la regulación de la ciclooxigenasa (COX)-2, el factor de transcripción nuclear kappa B (NF-κB, del inglés nuclear factor kappa B) y las proteínas quinasas activadas por mitógenos (MAKP, del inglés mitogen-activated protein kinase). En retinas enteras aisladas y expuestas a concentraciones crecientes de Fe2+ (25, 200 o 800 M) o a su vehículo, logramos determinar cuál es la incorporación efectiva de Fe por medio de técnicas analíticas e histoquímicas (espectrometría de emisión atómica por plasma de acoplamiento inductivo y tinción de Perls). El estrés oxidativo asociado a esta incorporación fue evaluado a través del estudio de diversos parámetros, tales como los niveles de peroxidación lipídica, la generación de dienos conjugados, la funcionalidad mitocondrial, la capacidad antioxidante de la retina, y la integridad de la membrana celular. La incorporación de Fe en las retinas fue dependiente de la concentración de Fe2+ utilizada en cada incubación. Esta acumulación de Fe produjo un incremento tiempo- y concentración-dependiente en los niveles de peroxidación lipídica de la retina. Por su parte, la viabilidad mitocondrial solo se vio afectada en menor grado luego de 60 minutos de exposición a la injuria oxidativa. Los niveles de dienos conjugados sufrieron un incremento tiempo-dependiente en tanto que la capacidad de captación de radicales libres solo se vio afectada a altas concentraciones de Fe2+. En concordancia con estos resultados, se observó que la pérdida de la integridad de la membrana celular evidencia un leve incremento en las retinas expuestas a todas las concentraciones de Fe2+ consideradas. Los niveles de peroxidación lipídica, la viabilidad celular y la pérdida de integridad de la membrana celular también fueron analizados en presencia de inhibidores específicos de las distintas isoformas de la PLA2, a saber araquidonoil trifluorometil cetona (ATK, del inglés arachidonoyl trifluoromethyl ketone –inhibidor de la cPLA2–), bromoenol lactona (BEL, del inglés bromoenol lactone –inhibidor de la iPLA2–) e YM 26734 (inhibidor de la sPLA2). La pre-incubación de las retinas con ATK provocó una disminución de los niveles de peroxidación lipídica y también una inhibición de la activación de las proteínas quinasas reguladas por señal extracelular (ERK1/2, del inglés extracellular signal-regulated kinase) a bajas y medianas concentraciones de Fe2+. Por su parte, el inhibidor BEL provocó un aumento en los niveles de peroxidación lipídica y retrasó la activación de las ERK1/2. En cuanto al inhibidor YM 26743, si bien este no demostró tener efecto alguno en la peroxidación lipídica, sí demostró tener la capacidad de retrasar la activación de las ERK1/2. También fue posible observar que ninguno de estos inhibidores afecta la viabilidad celular ni la permeabilidad de la membrana plasmática. Se detectó también una liberación diferencial de ácido araquidónico (AA, del inglés arachidonic acid) y de ácido palmítico (PAL, del inglés palmitic acid) catalizada por la cPLA2 y la iPLA2, respectivamente, en las fracciones microsomales y citosólicas obtenidas a partir de retinas incubadas con Fe2+. En el caso de la cPLA2, demostramos que, en respuesta a la incubación con Fe2+, la forma activa (la forma fosforilada en los residuos de Serina 505) se encuentra asociada principalmente a las fracciones citosólicas y que dicha asociación disminuye en las fracciones microsomales. Fue posible demostrar también que el perfil de liberación de AA producido por la actividad de la cPLA2 se encuentra regulado por acción de las ERK1/2 ya que la inhibición de estas quinasas por medio del inhibidor U0126 provocó la completa abolición de la liberación diferencial del AA. Por otra parte, observamos que la liberación de AA disminuye a la vez que la asociación de la proteína COX-2 aumenta en los microsomas de las retinas expuestas al Fe2+. Se observó también que la sPLA2 se localiza en la fracción citosólica de manera concentración-dependiente. Mediante ensayos de inmunoprecipitación fue posible observar que aumenta la asociación entre la sPLA2 y la proteína COX-2 en las retinas expuestas a la sobrecarga de Fe2+. Sin embargo, a pesar de la mayor asociación de esta proteína con la sPLA2, la generación de prostaglandinas se vio disminuida. Al estudiar los niveles de p65 (RelA) NF-κB encontramos que estos aumentan en las fracciones nucleares de las retinas expuestas a Fe2+. En presencia de los inhibidores ATK e YM 26734, observamos que la localización nuclear de ambas subunidades de NF-κB, p65 y p50, es restaurada a los niveles control en las retinas expuestas al estrés oxidativo inducido por Fe2+. 4 Resumen Los mecanismos de reparación de la membrana también fueron analizados mediante el estudio de la participación de las aciltransferasas en la remodelación fosfolipídica que ocurre durante el estrés oxidativo sufrido por la retina. Los fosfolípidos acídicos, tales como el fosfatidilinositol (PI) y la fosfatidilserina (PS), mostraron una inhibición en el perfil de acilación en las retinas expuestas a Fe2+ mientras que la fosfatidiletanolamina (PE) mostró resultados opuestos. El uso de inhibidores de la PLA2 demostró que la PS es activamente deacilada durante el estrés oxidativo inducido por Fe2+. Nuestros resultados demuestran que las distintas isoformas de la PLA2 participan en diferentes mecanismos regulatorios en este modelo experimental que mimetiza la DME del siguiente modo: i) la cPLA2 promueve el daño inducido por el estrés oxidativo dado que cumple una función en la señalización inflamatoria, liberando AA. ii) La iPLA2 tiene un rol protector debido a que interviene en la remodelación de las membranas mediante la remoción de los ácidos grasos peroxidados, lo cual atenúa los efectos nocivos del Fe2+ sobre las membranas celulares. iii) La sPLA2 Grupo V tiene múltiples blancos intracelulares relacionados con la respuesta inflamatoria porque participa en la regulación del factor NF-κB y de la proteína COX-2. Los hallazgos aquí presentados aportan nuevos conocimientos acerca de los mecanismos moleculares que operan en la degeneración retiniana inducida por el estrés oxidativo. / Iron (Fe) accumulation and oxidative stress are hallmarks of retinas in patients with age-related macular degeneration (AMD). In this thesis work we have characterized an in vitro model of iron-overloaded bovine retinas for the study of retinal degeneration during iron-induced oxidative stress. In particular, we have studied the role of the different phospholipase A2 (PLA2) isoforms, namely cytosolic isoform (cPLA2), calcium-independent isoform (iPLA2) and secretory isoform (sPLA2) during iron-induced retinal toxicity. Furthermore, we have analyzed the implications of PLA2s in the regulation of cyclooxigenase (COX)-2, nuclear factor kappa B (NF-κB) and MAPK pathways. In isolated retinas exposed to increasing Fe2+ concentrations (25, 200 or 800 M) or its vehicle, the effective iron incorporation into retinas was analyzed by means of analytical and histochemical techniques (inductively coupled plasma atomic emission spectroscopy and Perls´ staining). Oxidative stress associated to this incorporation was also analyzed taking into account several parameters, such as lipid peroxidation and conjugated diene levels, mitochondrial function, anti-oxidant ability and cell membrane integrity. Fe accumulation led to a time- and concentration-dependent increase in retinal lipid peroxidation levels whereas retinal cell viability was only affected after 60 minutes of oxidative injury. Conjugated diene levels underwent a time-dependent increase whereas radical scavenging ability was only affected at high Fe2+ concentrations. In agreement with these results, cell membrane integrity was slightly increased at all Fe2+ concentrations. Retinal lipid peroxidation, cell viability and cell membrane integrity were also analyzed in the presence of specific PLA2 isoform inhibitors, namely arachidonoyl trifluoromethyl ketone (ATK, cPLA2 inhibitor), bromoenol lactone (BEL, iPLA2 inhibitor) and YM 26734 (sPLA2 inhibitor). ATK was found to decrease lipid peroxidation levels as well as ERK1/2 activation. BEL showed the same effect on ERK1/2 activation but the opposite effect on lipid peroxidation. YM 26743 was observed to have no effect on lipid peroxidation although it demonstrated to have the ability to delay ERK1/2 activation. None of these inhibitors was found to affect either cell viability or cell membrane permeability. A differential release of arachidonic acid (AA) and palmitic acid (PAL), catalized by cPLA2 and iPLA2 activities, respectively, was also observed in microsomal and cytosolic fractions obtained from Fe2+-incubated retinas. In the case of cPLA2, we demonstrated that in response to Fe2+ incubation, the active form (the phosphorylated form) is associated mainly to the cytosolic fraction whereas this association is lower in the microsomal fraction. We also demonstrated that AA release profile caused by cPLA2 activity is regulated through ERK1/2 action as shown by the complete abolition of AA differential release through ERK 1/2 inhibition. It was also observed that AA release decreases whereas COX-2 association increases in microsomes of the retinas exposed to Fe2+. It could also be observed that sPLA2 is localized in the cytosolic fraction in a concentration-dependent manner. Via immunoprecipitation assays we demonstrated an increase in the association between sPLA2 and COX-2 in the retinas exposed to Fe2+ overload. Furthermore, in spite of the higher association of COX-2 with sPLA2, prostaglandins generation was found to decrease. The analysis of p65 (RelA) NF-κB levels showed that they increased in the nuclear fractions from the retinas exposed to Fe2+. In the presence of ATK and YM 26734, the nuclear localization of both p65 and p50 NF-κB subunits was found to be restored to control levels in the retinas exposed to Fe2+-induced oxidative stress. Membrane repair mechanisms were also analyzed by studying the participation of acyltransferases in phospholipid remodeling during retinal oxidative stress. Acidic phospholipids, such as phosphatidylinositol (PI) and phosphatidylserine (PS), were observed to show an inhibited acylation profile in the retinas exposed to Fe2+ whereas phosphatidylethanolamine (PE) showed exactly the opposite. The use of PLA2 inhibitors demonstrated that PS is actively deacylated during Fe2+-induced oxidative stress. Our results demonstrate that the PLA2 isoforms analyzed in this Ph. D. thesis participate in different regulatory mechanisms in our experimental model mimicking AMD. Such participation can be summarized as follows: i) cPLA2 promotes oxidative stress-induced damage by having a role in inflammatory signaling; ii) iPLA2 has a protective role by remodeling membranes to remove peroxidated fatty acids, thus attenuating the harmful effects of Fe2+ on cell membranes; iii) Group V sPLA2 has multiple intracellular targets related to the inflammatory response by its participation in the regulation of NF-κB and COX-2. The findings herein reported provide new knowledge about the molecular mechanisms operating in retinal degeneration induced by oxidative stress.

La enfermedad de Parkinson (EP) es el segundo trastorno neurodegenerativo más común en la población mundial. Esta patología es causada principalmente por la degeneración y muerte progresiva de las neuronas dopaminérgicas de la substantia nigra pars compacta (SNpc). La señalización celular en la EP ha sido y es uno de los aspectos más estudiados de la enfermedad, para tratar de comprender su etiopatogenia y encontrar nuevas dianas terapéuticas que permitan un tratamiento más específico de la enfermedad. Un componente clave en la muerte de las neuronas dopaminérgicas es el estrés oxidativo (EO), sin embargo, poco se sabe sobre el papel que juega la señalización mediada por las fosfolipasas D y A2 (PLD y PLA2, respectivamente) en este evento que inicia en etapas tempranas de la EP. El objetivo de este trabajo de tesis fue caracterizar el rol que cumplen las isoformas más importantes y estudiadas de las enzimas PLD y PLA2 en la respuesta neuronal frente al daño oxidativo. Para esto, se utilizaron como estímulo la 6-hidroxidopamina (6-OHDA) y la sobrecarga de hierro (Fe), dos agentes neurotóxicos ampliamente utilizados en el estudio de esta patología. La exposición neuronal a la 6-OHDA, un análogo hidroxilado de la dopamina, constituye una estrategia útil para estudiar los eventos moleculares asociados con la muerte neuronal en la EP. La 6-OHDA aumenta los niveles de oxidantes celulares y deteriora la cadena respiratoria mitocondrial, promoviendo así la lesión neuronal y la muerte. A pesar del uso extensivo de 6-OHDA en modelos animales, los eventos moleculares precisos desencadenados por este neurotóxico a nivel neuronal aún no se han dilucidado completamente. Las células de neuroblastoma humano IMR-32 expuestas a concentraciones crecientes de 6-OHDA mostraron altos niveles de especies reactivas de oxígeno (EROs) y aumento de la permeabilidad de la membrana plasmática con disminución concomitante de la viabilidad celular. Como parte de la respuesta neuronal a la exposición a 6-OHDA, se observó la translocación de la subunidad p65 del factor nuclear potenciador de las cadenas ligeras kappa de las células B activadas (NF-κB) hacia el núcleo. La localización nuclear de NF-κB también fue acompañada por un aumento de la fosforilación del inhibidor de kappa B (IκB), así como por un aumento en los niveles de ARNm de la ciclooxigenasa-2 (COX-2) y el receptor 4 de prostaglandina E2 (RP4). Aunque las vías canónicas que participan en la modulación de NF-κB se han descrito ampliamente, aquí se trabajó con la hipótesis de que la lesión inducida por 6-OHDA puede activar las vías de señalización de lípidos y, a su vez, modular la respuesta transcripcional. El EO generado en la célula por la 6-OHDA desencadenó la activación de vías de señalización de lípidos y produjo un aumento de los niveles de ácido fosfatídico (PA), diacilglicerol (DAG) y ácidos grasos libres en las células de neuroblastoma humano. La inhibición de la producción de PA pudo prevenir la disminución de la viabilidad celular provocada por 6-OHDA, la translocación nuclear de la subunidad p65 de NF-κB y el aumento en la expresión del ARNm de COX-2. En el primer capítulo de esta tesis, nuestros resultados indican que la respuesta neuronal desencadenada por 6-OHDA implica la activación de vías de señalización mediadas por PA que, a su vez, gobiernan la localización subcelular de NF-κB y la expresión de COX-2 de manera diferencial. La acumulación de Fe y la sobre-expresión de α-sinucleína son rasgos característicos de varios trastornos neurodegenerativos. Previamente en nuestro laboratorio hemos demostrado que el EO inducido por Fe activa la liberación de ácidos grasos catalizada por diferentes isoformas de PLA2 en el sistema nervioso. En este trabajo, nuestro objetivo fue estudiar la participación de las PLA2 en la regulación de la biología de la α-sinucleína y en la respuesta neuronal a la sobrecarga de Fe. También investigamos el papel de los factores secretados por la glía en la resolución del daño oxidativo por parte de las neuronas. Se estudió el estado redox, la fosforilación de α-sinucleína y la participación de las isoformas de PLA2 citosólica e independiente de calcio (cPLA2 e iPLA2, respectivamente) en la regulación de estos eventos. Las neuronas IMR-32 expuestas a una sobrecarga de Fe, bajo la forma del compuesto denominado citrato amonio férrico (FAC), mostraron un aumento de los niveles de expresión de iPLA2, concomitantemente con un aumento de los peróxidos lipídicos y las EROs. El bloqueo farmacológico de la actividad de iPLA2 aumentó, aún más, los niveles de peróxidos lipídicos y el contenido de EROs. Por el contrario, la inhibición conjunta de cPLA2 e iPLA2 mostró el efecto opuesto al promover una disminución de los marcadores de EO asociados con una mayor viabilidad neuronal. Las neuronas estimuladas con Fe también mostraron un aumento de la fosforilación de α-sinucleína. La fosforilación de α-sinucleína fue bloqueada por la inhibición de la actividad de la iPLA2. Gran parte de estos resultados también fueron corroborados por estudios en la línea celular de neuronas dopaminérgicas de rata (N27). Para estudiar el papel de la glía en la respuesta neuronal al Fe, se expusieron las células de astroglioma C6 a FAC o su vehículo, y los medios derivados de los astrocitos incubados en estas condiciones se añadieron, luego, a cultivos neuronales. En la caracterización de los astrocitos expuestos a Fe, estos mostraron un aumento en el marcador glial S100β y en los niveles de peroxidación lipídica, indicando una reactividad al EO. Los astrocitos fueron positivos para γ-glutamilcisteína ligasa, enzima limitante de la reacción de biosíntesis de glutatión. La respuesta de las neuronas a los medios condicionados de los astrocitos fue diferente dependiendo del origen de la línea celular. Mientras que el medio condicionado de astrocitos demostró ser neuroprotector para las neuronas humanas IMR-32, el efecto contrario se observó en las células dopaminergicas N27 derivadas de mesencéfalo de rata. Los resultados del segundo capítulo de esta tesis muestran roles específicos para la iPLA2 en cuanto a la neuroprotección y modulación de la fosforilacion de α-sinucleína en la respuesta neuronal a la lesión inducida por Fe. En conjunto los hallazgos de este trabajo de tesis contribuyen a dilucidar nuevos mecanismos de acción de determinadas isoformas de la PLA2 y la PLD en procesos de injuria neuronal asociados con la EP. / Parkinson's disease (PD) is the second most common neurodegenerative disorder worldwide. This pathology is mainly caused by the degeneration and progressive death of the dopaminergic neurons of the substantia nigra pars compacta (SNpc). Cell signaling in PD has always been one of the most studied key aspects of the disease in an attempt not only to understand its etiopathogenesis but also to find new therapeutic targets towards a more specific treatment of this pathology. However, little is known to date about the role of phospholipase D and A2 signaling (PLD and PLA2, respectively) in the neuronal response to oxidative injury, beginning in the early stages of PD. The objective of this thesis work was to begin to delineate the role played by the most important and studied isoforms of PLD and PLA2 enzymes in the neuronal response to oxidative damage, when they were subjected to the stimulus of 6-hydroxydopamine (6-OHDA) and to iron overload (Fe), two neurotoxic agents widely used in the study of PD. Likewise, the relationship and impact of the latter on the biology of α-synuclein were figured. Neuronal exposure to 6-OHDA, a hydroxylated analog of dopamine, is a useful strategy to study the molecular events associated with neuronal death in PD. 6-OHDA increases the levels of cellular oxidants and impairs the mitochondrial respiratory chain, thus promoting neuronal damage and death. Despite the extensive use of 6-OHDA in animal models, the exact molecular events triggered by this neurotoxic at the neuronal level have not yet been fully understood. Human IMR-32 neuroblastoma cells exposed to increasing concentrations of 6-OHDA showed high levels of reactive oxygen species (ROS) and increased plasma membrane permeability with concomitant decrease in cell viability. As part of the neuronal response to exposure to 6-OHDA, the translocation to the nucleus of the p65 subunit of the nuclear factor enhancer of the kappa light chains of activated B cells (NF-κB) was observed. The nuclear localization of NF-κB was also accompanied by an increase in phosphorylation of the inhibitor of kappa B (IκB) as well as an increase in the levels of mRNA of cyclooxygenase-2 (COX-2) and prostaglandin E2 receptor 4 (RP4). Although the canonical pathways involved in NF-κB modulation have been extensively described, the hypothesis that 6-OHDA-induced injury can activate lipid signaling pathways and, in turn, modulate the transcriptional response has been challenged here. The oxidative stress generated in the cell by 6-OHDA triggered the activation of lipid signaling pathways and produced an increase in the levels of phosphatidic acid (PA), diacylglycerol (DAG) and free fatty acids in human neuroblastoma cells. Inhibition of PA production could prevent the decrease in cell viability caused by 6-OHDA, the nuclear translocation of the p65 subunit of NF-κB and the increase in the expression of COX-2 mRNA. Our results indicate that the initiation of the inflammatory process triggered by 6-OHDA involves the activation of PA signaling which, in turn, governs the subcellular localization of NF-κB and the expression of COX-2 mRNA. Iron accumulation and α-synuclein overexpression are characteristic features of several neurodegenerative disorders. We have previously shown in our laboratory that oxidative stress induced by Fe activates the release of fatty acids catalyzed by different isoforms of PLA2 in the nervous system. In this work, our objective was to study the participation of PLA2 in the regulation of α-synuclein biology and the redox response developed by neurons in response to Fe overload. We also investigated the role of factors secreted by the glia in the resolution of oxidative damage by neurons. The redox state, the phosphorylation of α- synuclein and the participation of the calcium-dependent and independent PLA2 isoforms (cPLA2 and iPLA2, respectively) in the regulation of these events were studied. IMR-32 neurons exposed to Fe overload, in the form of the compound called ferric ammonium citrate (FAC), showed an increase in iPLA2 expression levels, concomitantly with an increase in lipid peroxides and ROS. The pharmacological blocking of iPLA2 activity further increased the levels of lipid peroxides and the content of ROS. In contrast, cPLA2 inhibition showed the opposite effect by promoting a decrease in oxidative stress markers associated with higher neuronal viability. Fe-stimulated neurons also showed increased α-synuclein phosphorylation. The phosphorylation of α-synuclein was blocked by the inhibition of iPLA2 activity. Several of these results were also corroborated by studies in the rat dopaminergic neuron cell line (N27). To study the role of glia in the neuronal response to Fe, C6 astroglioma cells were subjected to FAC or vehicle, and astrocyte-derived media was added to neuronal cultures of the same species (N27). In the characterization of the astrocytes exposed to Fe, they showed an increase in the glial marker S100β and the levels of lipid peroxidation, indicating a reactivity to oxidative stress. Neurons incubated with the above-mentioned astrocyte-derived media showed higher levels of oxidative damage than neurons exposed solely to Fe. Astrocytes were positive for the rate-limiting step enzyme for glutathione biosynthesis. Taken together, our results show specific roles for iPLA2 in terms of neuroprotection and modulation of α-synuclein phosphorylation in the neuronal response to Fe-induced injury. Together, the results of this thesis work contribute to elucidate new mechanisms of action of certain isoforms of PLA2 and PLD in neuronal injury processes associated with PD.

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En este trabajo de tesis nos concentramos en dos compo-nentes principales del sistema endógeno de defensa, impli-cados en el contexto de las enfermedades neurodegenerativas de la retina: la línea de defensa antioxidante, y las citoquinas de estrés. En el capitulo I, investigamos si los antioxidantes zeaxantina (ZEA), luteína (LUT), y β-caroteno (BC), los principales carotenoides de la dieta, protegen a los fotorre-ceptores del estrés oxidativo y si esa protección es sinérgica con la impartida por el ácido docosahexaenoico (DHA). Reali-zando cultivos neuronales puros de retinas de rata, encon-tramos que los pretratamientos con DHA, ZEA, LUT y BC redujeron la muerte de los fotorreceptores inducida por dos tipos de agentes oxidantes, paraquat (PQ) y peróxido de hi-drógeno (H2O2). Además de este efecto, ZEA y LUT incre-mentaron la diferenciación de los fotorreceptores, aumen-tando la expresión de opsina y promoviendo el desarrollo de procesos característicos de fotorreceptores maduros. Nues-tros resultados sugieren que las xantófilas ZEA y LUT junto al DHA podrían ser importantes factores ambientales que contri-buyen a la promoción de la supervivencia y diferenciación de los fotorreceptores. En el capitulo II, utilizamos los cultivos neuronales puros de retina de rata para estudiar el efecto protector directo de la neurocitoquina de estrés, el factor inhibidor de la leucemia (LIF), sobre fotorreceptores sujetos al estrés oxidativo inducido por PQ. Observamos que el pretrata-miento con LIF redujo la muerte celular y disminuyó la expresión de opsina en los cultivos, en una forma dependiente de la concentración. LIF activó la vía de señalización gp130/STAT3, lo que sugiere que este modelo es una poten-te herramienta para facilitar el estudio de los mecanismos que dirigen los efectos en la protección y en la diferenciación de LIF en los fotorreceptores de la retina. En el capítulo III investigamos mecanismos endógenos de neuroprotección de fotorreceptores in vivo en ratones usando un modelo de precondicionamiento con ciclos de luz/oscuridad (PC), seguido por exposición a daño agudo por luz (LD). Trabajos previos en el laboratorio del Dr. Ash demostraron que El PC induce la expresión de LIF y la activación de la vía gp130/STAT3. Aquí demostramos que el PC con luz moderada, previo al LD resultó en casi completa protección funcional y morfológica de los fotorreceptores. Estudiamos si el mecanismo de esta protección involucra la disminución en la acumulación de productos de oxidación. Hallamos que LD induce la oxidación de ADN en fotorreceptores. El PC previo redujo la oxidación de ADN como parte de la respuesta endógena de neuropro-tección inducida por este modelo. En el capítulo IV, investiga-mos si la activación de STAT3 inducida por LIF altera la actividad biológica de las células del epitelio pigmentado de la retina (RPE) in vivo. Generamos modelos de ratones knock-out para específicamente delecionar STAT3 o gp130 en el RPE, en la retina, o en ambos retina y RPE y realizamos inyecciones intravítreas de LIF en estos modelos. Establecimos que LIF regula negativamente la expresión y actividad de la isomerohidrolasa RPE65, componente clave del ciclo visual en el RPE, de manera coordinada con una reducción en la expresión de la rodopsina en los fotorreceptores, para disminuir la síntesis del fotopigmento visual. Dicha regulación se postula como neuroprotectora de la exposición al estrés por luz, o de enfermedades neurodegenerativas de la retina. Estos efectos en la retina y en el RPE fueron independientes y requirieron la activación de la vía de señalización gp130/STAT3 intrínseca de la retina y del RPE, respectivamente. / In this thesis, we focused on two main components of the endogenous defense system implicated in neurodegenerative diseases in the retina: the antioxidant line of defense and stress cytokines.In chapter I, we investigated whether the main carotenoids from the diet:zeaxantin (ZEA), lutein (LUT), and β-carotene (BC), protect photoreceptors from oxidative stress and whether this protection is synergis-tic with that given by docosahexaenoic acid (DHA). By per-forming pure neuronal cultures from rat retinas, we found that pretreatment with DHA, ZEA, LUT and BC reduced photo-receptor apoptotic cell death induced by two types of oxidants, paraquat (PQ) and hydrogen peroxide (H2O2).Also, ZEA and LUT increased the expression of opsin and promoted the development of processes that are characteristic of mature photoreceptors. Our results suggest that the xantho-phylls ZEA and LUT along with DHA could be important envi-ronmental cues contributing to the promotion of photore-ceptor survival and differentiation. In chapter II, we used pure neuronal cultures from rat retinas to study the direct effects of the stress neurocytokine, leukemia inhi-bitory factor (LIF), on photoreceptors exposed to oxidati-ve stress induced by PQ. We observed that pretreatment with LIF reduced photoreceptor cell death and decreased opsin expression in primary retinal neurons, in a dose-de-pendent manner. LIF activated the gp130/STAT3 signaling pathway, which suggests this model as a potent tool that could ease the study on mechanisms involved in the effects induced by LIF on photoreceptor survival and differentiation. In chapter III, we examined endogenous protective mechanisms of photoreceptor in 9 vivo, in mice exposed to a model of preconditioning with cycles of light/darkness (PC) followed by exposure to acute light damage (LD). Previous work in Dr. Ashs laboratory has demonstrated that the primary endogenous neuroprotective response in this model is the upregulation of LIF and increased gp130/STAT3 signaling in photoreceptors. Here, we demonstrated that PC with moderate levels of light prior to LD resulted in almost complete functional and morphological protection of photoreceptors. We studied whether the mechanism mediating this protection involved a reduction in the accumulations of oxidation products. We found that LD induced DNA oxidation in photoreceptors, but the prior treatment with PC decreased such oxidation as a part of the endogenous response induced by this model. In chapter IV, we aimed to investigate whether the activation of STAT3 induced by LIF alters the biological activities of the retinal pigmented epithelium (RPE) in vivo. We generated conditional knock-out mouse models with specific deletion of STAT3 or gp130 in the RPE, in the retina, or in both retina and RPE and we performed intravitreal injections of LIF in these animals. Our studies allowed us to establish that LIF downregulates the expression and activity of the isomerohydrolase RPE65, a key component in the visual cycle in the RPE, which is coordinated with a decrease in the expression of rhodopsin in photoreceptors, to diminish the synthesis of the visual photopigment. This coordinated downregulation is postulated to be neuroprotective in both light stress and in neurodegenerative diseases in the retina. The effects induced by LIF in the retina and the RPE were independent from each other and required the activation of the gp130/STAT3 signaling pathway intrinsic to retina and RPE, respectively.

La Retinitis Pigmentaria (RP) y la Degeneración Macular Asociada a la Edad (AMD) son enfermedades neurodegenerativas de la retina que se caracterizan por la pérdida progresiva e irreversible de las neuronas fotorreceptoras (FR). Ambas enfermedades son incurables, conducen a la pérdida de visión y no cuentan con tratamientos efectivos. Una estrategia para lograr desarrollar una terapia más adecuada para estas enfermedades es la utilización de células madre que puedan restaurar los tejidos dañados. Sin embargo, regenerar la retina requiere resolver varios problemas poco explorados: uno de ellos es la escasa actividad regenerativa de las células gliales de Müller (CGM) de la retina que, si bien han sido propuestas como células madre, poseen una efectividad muy limitada en mamíferos y son ineficientes para recuperar los FR perdidos. Otro problema es la respuesta reactiva de las CGM, la cual ocurre luego de daños en la retina y genera una inflamación crónica local que afecta la supervivencia de las neuronas regeneradas. Al respecto, recientemente se ha propuesto que los receptores X para retinoideos (RXR) son moduladores de la respuesta inflamatoria que protegerían a las neuronas durante las enfermedades neurodegenerativas del SNC. Sin embargo, aún se conoce muy poco sobre su rol en la retina. El estudio de estas enfermedades enfrenta dificultades éticas y prácticas, por lo que el uso de ratones rd1, un modelo animal de RP que presenta una mutación específica que causa la muerte por apoptosis de los FR, resulta extremadamente útil para investigar las causas de la escasa capacidad regenerativa de la retina. Con este objetivo utilizamos retinas enteras y cultivos primarios neuronales y de CGM de ratones control y rd1. También investigamos y comparamos la actividad proliferativa de las CGM y la expresión de diversos marcadores de células madre, así como la expresión de los RXR y su efectos sobre la supervivencia neuronal y reactividad glial ante el tratamiento con un agonista sintético de estos receptores. Los resultados indicaron una disminución de los marcadores de célula madre de las CGM rd1. Notablemente, la expresión de uno de ellos, Nestina, pudo ser revertida al co-cultivar las CGM rd1 con neuronas control (wt), lo que sugiere una alteración en la comunicación neuro-glial. Además, el agonista sintético de los RXR, PA024, retrasó la muerte de los FR y disminuyó la reactividad glial en cultivos de retinas rd1. En resumen, en esta tesis presentamos evidencia de que en las retinas rd1 existe una alteración en la comunicación neuro-glial que afectaría el potencial regenerativo y dispararía una respuesta reactiva en las CGM. Asimismo, hallamos que la reactividad de las CGM y la muerte de los FR en las retinas rd1 pudo ser disminuida mediante la utilización de un agonista de los RXR. Estos resultados sugieren que el potencial regenerativo de las CGM dependería de su interacción con neuronas sanas; que durante los procesos neurodegenerativos de la retina este diálogo neuro-glial estaría afectado; y que los RXR regularían, en parte, los procesos inflamatorios y la supervivencia neuronal en la retina. Estos hallazgos podrían ser de utilidad para el desarrollo de una terapia efectiva de reemplazo celular. / Retinitis Pigmentosa (RP) and Age-related Macular Degeneration (AMD) are neurodegenerative diseases of the retina which are characterized by the progressive and irreversible loss of photoreceptor neurons (PRs). Both diseases are incurable, lead to loss of vision and lack effective treatment. A strategy to develop an adequate therapy involves the use of stem cells that are able to restore damaged tissue. However, retina regeneration requires solving many unexplored issues. One of them is poor regenerative activity of Müller glial cells (MGC) of the retina. Although these cells have been postulated as stem cells, they have limited effectiveness in mammals and are inefficient to recover lost PRs. Another issue is the reactive response of MGC, which occurs after damage to the retina and causes local chronic inflammation that affects the survival of regenerated neurons. In that regard, it has recently been claimed that retinoid X receptors (RXR) are inflammatory response modulators that could protect the neurons from neurodegenerative diseases of the central nervous system. However, little is known about the role they play in the retina. Research into these diseases faces many ethical and practical challenges. Therefore, using rd1 mice, an animal model of RP with a very specific mutation which causes death by apoptosis of PRs, is extremely useful to study the causes of poor regenerative capacity of the retina. For this purpose, we have used whole retinas and primary neural and MGC cultures from control and rd1 mice. We have also studied and compared the proliferative activity of MGC and the expression of several stem cell markers, as well as the expression of RXR and their effect on neuronal survival and glial reactivity upon treatment with a synthetic agonist. Results showed decreased rd1 MGC stem cell markers. Remarkably, the expression of one of these, Nestin, could be reverted by co-culturing of rd1 MGC with control neurons (wt), which suggests an alteration in neuroglial communication. Furthermore, using the RXR synthetic agonist PA024 delayed death of PRs and decreased glial reactivity in rd1 retina cultures. In sum, throughout this thesis we have presented evidence that in rd1 retinas there is an alteration in neuroglial communication which could affect the regenerative potential and trigger a reactive response of MGC. Additionally, we found that MGC reactivity and death of PRs in rd1 retinas could be reduced by means of a RXR agonist. These results suggest that regenerative potential of MGC could depend on their interaction with healthy neurons, that neuroglial communication could be affected when neurodegenerative processes of the retina take place, and that RXR could partially regulate inflammatory processes and neuronal survival in the retina. These findings could prove useful for the development of an effective cellular replacement therapy.

Desde hace casi tres décadas, los esfingolípidos han entrado a la escena de los lípidos bioactivos. Dentro de esta gran familia, son sus versiones más simples los que han sido relacionados con importantes funciones celulares. La Ceramida (Cer), y su derivado por deacilación, la esfingosina (Sph), han sido reportados como segundos mensajeros de muerte en diversos tipos celulares. Por su parte, sus derivados fosforilados, en especial la esfingosina-1-fosfato (S1P), se han identificado con funciones proliferativas y pro-supervivencia. Diversas señales mitogénicas contribuyen no solo a la proliferación sino también a la migración celular, siendo de especial interés en ciertas patologías como el cáncer. Sin embargo, los procesos celulares invasivos son relevantes también en la retina, el tejido de interés de este trabajo de tesis. Diversas patologías, como la retinopatía diabética, presentan una proliferación exacerbada de las células gliales de Müller (CGM), el principal tipo glial de la retina, proceso conocido como gliosis. En su inicio, esta respuesta es un intento fisiológico por aislar al tejido neuronal de la injuria y reparar el daño. Sin embargo, en un estado patológico, ante la continuidad de la injuria, esta proliferación celular termina convirtiéndose en una cicatriz que afecta el normal funcionamiento del tejido retiniano, llevando en última instancia a la pérdida parcial o total de la visión. Por lo expuesto, resulta relevante investigar estos procesos proliferativos de la retina a fin de encontrar nuevos tratamientos terapéuticos. La información sobre las funciones del esfingolípido mitogénico S1P a nivel de la retina es escasa. Por ejemplo, se ha reportado que la S1P promueve la proliferación y respuestas pro-fibróticas y pro-inflamatorias en células de epitelio pigmentario y que participa en la neo-vascularización retinal y coroidal. Además, los niveles retinales y plasmáticos de S1P aumentan en un modelo inflamatorio inducido por lipopolisacárido. En el primer capítulo de este trabajo de tesis, planteamos la hipótesis de que la S1P podría estar involucrada en los procesos glióticos, participando como una señal clave para inducir la migración glial. Para contrastar nuestra hipótesis, utilizamos un modelo de cultivo primario de células gliales de Müller y analizamos la migración glial mediante el “ensayo de la herida”, un método sencillo y ampliamente utilizado para este propósito. Nuestros experimentos revelaron que la adición exógena de S1P induce modificaciones en el citoesqueleto de las CGM, detectadas en las primeras 8-10 h de tratamiento, que llevan a la formación de lamelipodios y al inicio de la motilidad glial sobre el sustrato. Esta motilidad glial fue claramente superior a la de los cultivos controles luego de 18 h de estímulo. Las CGM expresaron dos de los cinco receptores transmembrana para S1P, los S1PR, específicamente los subtipos S1P1 y S1P3, siendo la activación de este último la que desencadena el proceso migratorio, tal como lo demostraron experimentos utilizando antagonistas selectivos de ambos receptores. Nuestros resultados también mostraron que rio-abajo de la activación del S1P3 se activarían dos importantes vías intracelulares, la vía de ERK/MAPK y la vía de PI3K, ya que el pre-tratamiento con inhibidores de estas vías disminuyó significativamente el estímulo migratorio inducido por S1P. Cabe destacar que esta inducción del proceso migratorio no estuvo acompañada de un incremento significativo en la proliferación glial. Por otra parte, no solo la S1P exógena tuvo un rol en la migración glial. Encontramos que la inhibición de la síntesis endógena de S1P, utilizando un inhibidor selectivo de la enzima esfingosina quinasa 1 (Sphk1) (enzima que cataliza la síntesis de S1P), el inhibidor de SphK1 2 (SphKI2), prácticamente abolió la migración glial basal, es decir aquella observada aun en ausencia de S1P. Estos resultados demuestran que la S1P tiene un rol clave en la inducción de migración glial en la retina, y su bloqueo podría ser utilizado como una estrategia terapéutica para las enfermedades proliferativas de la retina. Otro conjunto de patologías de la retina, de creciente avance y lamentablemente aun sin tratamientos efectivos, son las enfermedades neurodegenerativas. Las mismas son un conjunto de patologías, entre las que destacan la retinitis pigmentosa y la degeneración de la mácula con una variada etiología, con múltiples factores, desde genéticos hasta ambientales como desencadenantes, pero que comparten un denominador común: la muerte de los fotorreceptores (FR). Esta degeneración progresiva de los FR lleva, como consecuencia final, a la pérdida de la visión. Como se describió, Cer y Sph son importantes mediadores de muerte celular y han despertado la atención en el campo de las enfermedades neurodegenerativas. Estudios pioneros encontraron que los niveles de Cer se encontraban aumentados en retinas pos mortem de pacientes con la enfermedad de Faber, y que los niveles de este esfingolípido aumentaban frente a la degeneración neuronal inducida por desprendimiento de retina. Posteriores reportes, incluidos los de nuestro laboratorio, establecieron que la Cer es un mediador clave en la muerte de los FR en cultivo. El daño oxidativo estimula la síntesis de Cer que desencadena la muerte de los FR y este proceso es mimetizado por la adición exógena de un análogo sintético de ceramidas endógenas, la C2-Ceramida (C2Cer). Hallazgos posteriores en diversos modelos animales de neurodegeneración retiniana permiten proponer a la Cer como un mediador central en la activación de la muerte de los FR. Pese a esto, aún no se conoce en profundidad cuáles son los mecanismos moleculares involucrados en este proceso. Esta pregunta resulta relevante, ya que la regulación de los distintos blancos intracelulares de Cer podría emerger como posible terapia para las enfermedades neurodegenerativas de la retina. Ante esto, nos planteamos como objetivo en el 2º capítulo de esta Tesis, estudiar los mecanismos moleculares involucrados en la muerte de los FR mediada por C2Cer, utilizando un modelo de cultivo primario de neuronas de retina de rata. Un trabajo previo de nuestro laboratorio demostró que la C2Cer, en una concentración de 10 μM induce la muerte de los FR y las neuronas amacrinas, los tipos neuronales mayoritarios en los cultivos. Estudiando el proceso de muerte de manera cronológica, encontramos que el tratamiento de cultivos neuronales con C2Cer 10 μM durante 6 h indujo selectivamente la muerte de los FR, disminuyendo el potencial de membrana mitocondrial y aumentando la formación de especies reactivas de oxígeno (ROS). En contraste, las neuronas amacrinas preservaron su viabilidad. Cabe destacar que la cantidad de células marcadas con TUNEL y de FR que expresaron caspasa-3 clivada, forma activa de la caspasa-3, permanecieron constantes y que el pretratamiento con un pan inhibidor de caspasas no evitó la muerte inducida por C2Cer. C2Cer provocó la sobre activación de la poli-ADP ribosil polimerasa-1 (PARP-1). La inhibición de PARP-1 disminuyó la muerte de los FR inducida por C2Cer. A su vez, C2Cer aumentó los niveles de polímero de poli-ADP ribosa (PAR), cuya síntesis es catalizada por PARP-1, e indujo la translocación del factor inductor de apoptosis (AIF) de las mitocondrias al núcleo de los FR, ya que dicha translocación se previno mediante la inhibición de PARP-1. El pretratamiento con un inhibidor de calpaínas y catepsinas, y con un inhibidor de la calpaína redujo la muerte de los FR, mientras que los inhibidores selectivos de catepsinas no otorgaron protección. El pretratamiento combinado con un inhibidor de PARP-1 y un inhibidor de calpaína evidenció la misma protección que cada inhibidor por sí mismo. Esto sugiere que tanto PARP-1 como calpaínas confluyen en el mismo mecanismo de acción rio-abajo de la C2Cer. Ni la autofagia ni la necroptosis estuvieron involucradas en la muerte inducida por C2Cer; no se observó un aumento en la liberación de LDH después del tratamiento con C2Cer y el pretratamiento con inhibidores de la necroptosis y de la autofagia no rescataron a los FR. Estos resultados sugieren que la C2Cer activa la muerte de los FR por un mecanismo novedoso, independiente de caspasas, que implica la activación de PARP-1, disminución del potencial de membrana mitocondrial, activación de calpaína y translocación de AIF, todas las características bioquímicas del tipo de muerte celular denominada parthanatos. Nuestros resultados, sugieren así nuevos blancos terapéuticos, y contribuyen a los avances en la búsqueda de tratamientos efectivos para las enfermedades neurodegenerativas de la retina. / For almost three decades, sphingolipids have entered the bioactive lipid scenery. Within this large family, simple sphingolipids are the ones that have been related to important cellular functions. Ceramide (Cer), and its deacylation derivative, sphingosine (Sph), have been reported as death second messengers in several cell types. On the other hand, its phosphorylated derivatives, especially sphingosine-1-phosphate (S1P) have been related to proliferative and pro-survival functions. Several mitogenic signals contribute not only to proliferation but also to cell migration, being of special interest in certain pathologies such as cancer. However, invasive cellular processes are also relevant in the retina, the tissue of interest in this thesis work. Diverse pathologies, such as diabetic retinopathy, show an exacerbated proliferation of Müller glial cells (CGM, the main glial type of the retina), a process known as gliosis. Initially, this response is a physiological attempt to isolate neuronal tissue from injury and repair the damage. However, in a pathological state, given the continuity of the injury, this cell proliferation gives rise to a scar that affects the normal functioning of the retinal tissue, ultimately leading to a partial or total vision loss. Therefore, it is relevant to investigate these retinal proliferative processes in order to find new therapeutic treatments. There is scarce information on the functions of the mitogenic sphingolipid S1P in the retina. S1P has been reported to promote proliferation, pro-fibrotic and pro-inflammatory responses in pigment epithelial cells and it also participates in retinal and choroidal neovascularization. In addition, there is an increase in retinal and plasma levels of S1P in an inflammatory model induced by lipopolysaccharide. In the first chapter of this thesis we propose the hypothesis that S1P might be involved in gliotic processes, as a key signal in the induction of glial migration. To test our hypothesis, we used a primary culture model of Müller glial cells and evaluated cell migration by the scratch-wound assay, which is a simple and widely used method. Our experiments revealed that the exogenous addition of S1P modified the CGM cytoskeleton, in the first 8-10 hours of treatment. This addition led to the formation of lamelipodia and to the onset of glial motility. This motility was markedly enhanced compared to control conditions after 18 h of S1P addition. CGM expressed two of the five transmembrane receptors for S1P (S1PR), specifically the S1P1 and S1P3 subtypes. However, only activation of S1P3 was required to induce S1P-induced CGM migration, as evidenced by experiments performed with S1P1 and S1P3 antagonists. Analysis of the signaling pathways activated downstream of S1P3 evidenced that two well-known pathways, the ERK/MAPK and PI3K pathways were activated, since pre-treatment with specific inhibitors, significant reduced S1P-induced glial migration. Of note, this induction of the migratory process was not accompanied by a significant increase in glial proliferation. On the other hand, not only exogenous S1P played a role in glial migration. Inhibition of the endogenous synthesis of S1P, using a selective inhibitor of the enzyme sphingosine kinase 1 (Sphk1) (the enzyme that catalyzes the synthesis of S1P), the SphK1 inhibitor number 2 (SphKI2), virtually blocked the basal glial migration, i.e. the migration level observed in the absence of exogenous S1P. These results demonstrated that the S1P-S1P3 axis has a key role in the induction of migration in the retina, and its targeting might provide an interesting approach in the search of new therapeutical treatments for proliferative diseases of the retina. Among retinal pathologies, neurodegenerative diseases are a set of diseases of the retina that progressively lead to vision loss and still lack effective treatments. Pathologies such as retinitis pigmentosa and macula degeneration have very diverse etiologies, varying from genetic to environmental triggers, but which share a common hallmark: the death of photoreceptors (PhRs). This progressive degeneration of PhR leads, as a final consequence, to visual disability and blindness. As described, Cer and Sph are important mediators of cell death and have attracted special attention in the field of neurodegenerative diseases. Pioneering studies found that Cer levels were increased in post-mortem retinas of patients with Faber's disease; furthermore, the levels of this sphingolipid are increased in neuronal degeneration induced by retinal detachment. Subsequent reports, including those from our laboratory, established that Cer is a key mediator in the death of PhRs in culture. Oxidative damage stimulates the synthesis of Cer, which triggers the death of photoreceptors and this process is mimicked by the exogenous addition of a synthetic analogue of an endogenous ceramide, C2-Ceramide (C2Cer). Further work using animal models of retina degeneration support a role for Cer as a crucial signal involved in the induction of PhR death. However, the molecular mechanisms involved in this process are still unknown. Uncovering them is very relevant, since regulating the different intracellular targets of Cer might provide new therapies for neurodegenerative diseases of the retina. The purpose of the second chapter of this thesis was to study the molecular mechanisms involved in the death of PhRs induced by C2Cer, using as a model primary cultures of rat retinal neurons. Previous work from our laboratory showed that 10 μM C2Cer induces the death of PhRs and amacrine neurons, the two major neuronal types in our cultures. A chronological analysis of the death process showed that treatment with 10 μM C2Cer for 6 h selectively induced the death of photoreceptors, decreasing mitochondrial membrane potential and increasing the formation of Reactive Oxygen Species (ROS). In contrast, amacrine neurons preserved their viability. Of note, the number of cells labeled with TUNEL and of photoreceptors expressing cleaved caspase-3 remained constant and a pretreatment with a pan caspase inhibitor did not prevent C2Cer-induced neuronal death. C2Cer caused over-activation of poly-ADP ribosyl polymerase-1 (PARP-1). The inhibition of PARP-1 decreased photoreceptor death induced by C2Cer. In turn, C2Cer increased poly-ADP ribose (PAR) polymer levels, the synthesis of which is catalyzed by PARP-1, and induced the translocation of apoptosis-inducing factor (AIF) from mitochondria to the nuclei, which was prevented by PARP-1 inhibition. Pretreatment with a calpain and cathepsin inhibitor, and with a selective calpain inhibitor, reduced photoreceptor death, whereas selective cathepsins inhibitors did not provide any protection. The combined pretreatment with a PARP-1 inhibitor and a calpain inhibitor showed the same extent of protection as each inhibitor by itself. This suggests that both PARP-1 and calpains converge downstream in the same mechanism. Neither autophagy nor necroptosis were involved in C2Cer-induced cell death; no increase in LDH release was observed after C2Cer treatment and pretreatment with necroptosis and autophagy inhibitors did not rescue photoreceptors. These results suggest that the C2Cer-induced photoreceptor death signaling by a novel caspase-independent mechanism, which involves PARP-1 activation, a decrease in mitochondrial membrane potential, activation of calpain and translocation of AIF, all of which are biochemical characteristics of the cell death type named parthanatos. In conclusion, our results identify a new therapeutic target, thus contributing to the advances in the search for effective treatments for neurodegenerative diseases of the retina.

El alcohol es un compuesto neurotóxico y su abuso puede causar daño cerebral y neurodegeneración. Sin embargo, los procesos neuropatológicos que producen estos efectos no se conocen con exactitud. Nuestro grupo demostró por primera vez que el etanol induce gliosis, neuroinflamación, daño cerebral y neurodegeneración mediante la activación del sistema inmune innato en cerebro a través de los receptores TLR4 de las células gliales. Además, evidencias recientes apuntan a que el alcohol altera los procesos de degradación de proteínas en patologías como la hepatopatía alcohólica, pero se desconoce si estos procesos proteolíticos también participan en el daño cerebral inducido por el consumo de alcohol. Mediante esta tesis, pretendemos evaluar la relación de los dos principales complejos proteolíticos, el sistema ubicuitina-proteasoma y la vía de la autofagia, con el daño producido por el alcohol en el cerebro, así como la implicación de los receptores TLR4 en este proceso. Para ello, usaremos ratones WT y TLR4-/- tratados crónicamente con etanol en agua durante 5 meses y los compararemos con los respectivos controles mediante técnicas como el western blot, PCR cuantitativa, inmunofluorescencia, inmunohistoquímica o citometría. Del mismo modo, trabajaremos también con cultivos primarios de células gliales para evaluar el efecto del alcohol en dosis agudas in vitro. Nuestra hipótesis de partida es que al activar la señalización por TLR4, el etanol causa inflamación en el cerebro, estrés oxidativo y acumulación de proteínas por disfunción de los sistemas proteolíticos. Esta acumulación de agregados proteicos podría a su vez estimular la activación de los receptores TLR4, amplificando los efectos del etanol en la producción de daño cerebral y neurodegeneración. / Pla Rodríguez, A. (2014). IMPORTANCIA DE LOS MECANISMOS DE DEGRADACIÓN DE PROTEÍNAS EN LA NEURODEGENERACIÓN CAUSADA POR EL ABUSO DE ALCOHOL: PAPEL DE LOS RECEPTORES TLR4 [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/36532 / TESIS

En esta tesis estudiamos la población total de las células ganglionares de la retina (CGR) en rata y ratón, y desarrollamos un modelo experimental de hipertensión ocular mediante fotocoagulación láser. La población de CGR proyecta masivamente a los colículos superiores. Se observa una estría visual en la retina dorsal donde se encuentra las densidades más altas de CGR. La pequeña población de CGR ipsilateral se distribuye mayoritariamente en la periferia de la retina temporal. El aumento de la presión intraocular induce una compresión de los axones en la cabeza del nervio óptico que provoca una alteración del transporte axonal retrógrado, que induce una degeneración sectorial localizada y difusa de las CGR, preferentemente en la retina dorsal, así como de sus axones. La pérdida selectiva de las CGR en la capa de CGR, sugiere que la causa de la muerte de las CGR no se debe a una isquemia retiniana. / In this thesis we have studied the total population of retinal ganglion cells (RGCs) in rat and mouse, and developed an experimental model of ocular hypertension by laser photocoagulation. The RGC population projects massively to the superior colliculi. There is a visual streak in the dorsal retina where the highest densities of RGCs are found. The small population of ipsilateral RGCs is distributed mainly in the periphery of the temporal retina. The increase of intraocular pressure induces a compression of the axons at the optic nerve head that causes a disturbed retrograde axonal transport, inducing a localized, diffuse and sectorial degeneration of RGCs and their axons, preferably in the dorsal retina. The selective loss of RGCs in the RGC layer, suggests that the cause of the RGC loss is not due to retinal ischemia.

En la present tesi doctoral es va establir i calcular els factors genètics de risc per a la forma tardana de la malaltia d'Alzheimer (MA). Foren analitzats un total de 15 variants gèniques (polimorfismes) ubicats en alguns dels gens candidats que codifiquen per a proteïnes involucrades en la fisiopatologia de la MA. Les freqüències gèniques i genotípiques de tots els polimorfismes, així com les freqüències haplotípiques d'aquelles variants que estaven en desequilibri de lligament, foren comparades entre una població de 136 individus amb diagnòstic clínic de MA i una població de 91 individus sense deteriorament cognitiu (tots amb edats superiors als 65 anys i sense cap relació de parentesc).Es va trobar una associació estadísticament significativa entre l'al·lel e4 del gen APOE i la MA (OR ajustada per sexe i edat de 7.8), així com una altre associació positiva entre el polimofisme *159C/T del gen Neprilysin i la MA (OR del subgrup menor de 75 anys i homozigots CC = 2.87). Finalment, es va trobar una sobre representació significativa del genotip GG, situat en l'exó 5 del gen BACE1, en els pacients d'Alzheimer (OR = 2.14 ). També es va obtenir una associació significativa entre el polimorfisme analitzat en el gen HSP70-2 i la presència de simptomatologia no cognitiva en els pacients que havien estat avaluats amb test neuropsiquiàtric (NPI).Tots aquests estudis confirmen la base genètica de la forma tardana de la MA i demostren la importància de l'epidemiologia genètica i dels estudis de tipus cas-control en aquelles malalties complexes com la MA. / En la presente tesis doctoral se establecieron y calcularon los factores genéticos de riesgo para la forma tardía de la enfermedad de Alzheimer (EA). Para ello se analizaron un total de 15 variantes génicas (polimorfismos) que se encuentran en algunos de los genes candidatos que codifican proteínas involucradas en la fisiopatología de la EA. Las frecuencias génicas y genotípicas de todos los polimorfismos, así como las frecuencias haplotípicas de aquellos polimorfismos que se encontraron en desequilibrio de ligamiento, fueron comparadas entre una población de 136 individuos con diagnóstico clínico de EA y una población de 91 individuos sin deterioro cognitivo (todos con edades superiores a los 65 años y sin relación de parentesco).Se halló una asociación estadísticamente significativa entre el alelo e4 del gen APOE y la EA (OR ajustada por sexo y edad de 7.8), así como otra asociación positiva entre el polimofismo *159C/T del gen Neprilysin y la EA (OR del subgrupo menor de 75 años y homocigotos CC = 2.87). Finalmente, se encontró una sobre representación significativa del genotipo GG, situado en el exón 5 del gen BACE1, en los pacientes de Alzheimer (OR = 2.14 ). También se obtuvo una asociación significativa entre el polimorfismo analizado en el gen HSP70-2 y la presencia de sintomatología no cognitiva en los pacientes que habían sido evaluados con test neuropsiquiátrico (NPI).Todos estos estudios confirman la base genética de la forma tardía de la EA y demuestran la importancia de la epidemiología genética y de los estudios de tipo caso-control en aquellas enfermedades complejas como la EA. / In the present thesis, genetic risk factors for late onset Alzheimer's disease (AD) have been evaluated. A total of 15 polymorphisms located in several candidate genes involved in AD pathophysiology were analysed in a sample set comprising 136 AD patients and 91 non-demented elderly control individuals. A statistically significant association was found between the e4 allele of the APOE gene and AD (age- and sex-adjusted OR = 7.8). An association was also found between the *159C/T polymorphism located at the Nerprilysin gene (the OR for those individuals younger than 75 years old and homozygous for the C allele was 2.87). Finally, an over representation of the GG genotype of the BACE1 exon 5 was found in AD patients compared to controls (OR = 2.14). An elevated propensity to develop non-cognitive alterations in AD patients was found to be associated with the A2 allele of the HSP70-2 gene.All of these results confirm the genetic susceptibility to AD and clearly demonstrate the usefulness of genetic epidemiology tools as well as the case-control approaches in identifying genes related to complex disorders such as AD.

Las enfermedades neurodegenerativas cursan con la degeneración y muerte de las neuronas las cuales son incapaces de suplir su propia muerte. Debido a esta característica enfermedades como el Alzheimer, el Parkinson o el Glaucoma no tienen cura en la actualidad. La retina es una proyección del sistema nervioso central (SNC) encapsulada en el globo ocular y aislada del resto del SNC, lo que la hace fácilmente accesible a la manipulación experimental. En este trabajo estudiamos las alteraciones funcionales de la retina con el electrorretinograma de campo completo (ERG), técnica basada en el registro de la respuesta eléctrica retiniana tras la presentación de un estímulo de luz homogéneo. Así hemos estudiado los efectos de la sección del nervio, del aumento de presión intraocular y de la fototoxicidad, dichas lesiones afectan selectivamente a determinadas poblaciones neuronales retinianas e imitan enfermedades neurodegenerativas como el Glaucoma o la Degeneración Macular Asociada a la Edad. / Neurodegenerative diseases are characterized by degeneration and death of neurons which are unable to recover after a given insult, thus impairing functional recuperation. Because of this, there is no cure for diseases such as Alzheimer, Parkinson or Glaucoma. The retina is a projection of the central nervous system (CNS) located in the eye and therefore, isolated from the rest of the CNS. This makes the retina a very good model for experimental manipulation. In this work we have studied the functional changes in the retina by full field electroretinograme (ERG). This technique records the electric response of the retina after presentation of homogeneous light stimuli. We have studied the effects that optic nerve sections, increase of the intraocular pressure and phototoxicity have on ERG recordings. These lesions impair selectively certain retinal neuronal populations and imitate neurodegenerative diseases as Glaucoma or Age-related Macular Degeneration.