Se han obtenido una serie de conjugados de flavanoles a partir de un extracto vegetal mediante un proceso de despolimerización ácida en presencia de derivados de cisteína. Los monómeros de flavanoles derivatizados se separaron eficientemente del crudo de extracción mediante cromatografia de intercambio iónico en medio ácido, debido a la carga neta introducida al derivatizar. Posteriormente fueron purificados por cromatografia en fase reversa C18 obteniendo los correspondientes derivados de epicatequina, catequina y epicatequin 3-O-galato conjugados con L-cisteína, O-etilcisteína y N-acetilcisteína. Dichos compuestos presentaron una mayor capacidad antiradicalaria que la correspondiente epicatequina mediante ensayos con los radicales libres DPPH (el cual se reduce via donación de hidrogenos y/o por transferencia electrónica) y el nuevo radical estable HNTTM sintetizado en el Departamento de Materiales Orgánicos Halogenados del IIQAB-CSIC (el cual se reduce solo por transferencia electrónica). Todos los compuestos conjugados presentaron una mayor capacidad antiradicalária que el monómero de epicatequina y los compuestos que contenian el éster de galato fueron los que generaron una mayor capacidad antiradicalária en ambos estudios. También se realizaron estudios in vitro con líneas tumorales humanas de melanoma (A375 y M21) y de colon (HT29) y con una línea no tumoral de queratinocitos humanos (HaCaT), observándose una moderada inhibición en la viabilidad celular, siendo los compuestos que contenian un éster galato los que presentaron mayor efectividad. A nivel de ciclo celular, solo los derivados que contenian el éster galato presentaron una alteración en el ciclo a concentraciones dobles de su respectiva IC50, con un aumento de la distribución en la fase S. Igualmente se observó una inducción en la apoptosis en las linias tumorales tratadas con los compuestos (siendo los conjugados con el éster galato los que presentaron una mayor inducción), pero no en la linea no tumoral de queratinocitos. Dicha inducción a la apoptosis se corroboró con otras técnicas en las que se observó condensación de cromatina y la fragmentación del ADN. Sorprendentemente, uno de los derivados que contenia un éster de galato no presentó alteración en el ciclo celular ni indujo apoptosis en las células tumorales. Igualmente, su poder antiradicalario mediante transferencia electrónica (HNTTM) fue inusitadamente bajo aun conteniendo el grupo galato. Con dichos resultados se hipotetizó la posible relación entre la transferencia electrónica y su efecto en la maquinaria celular. Asimismo, el radical estable HNTTM nos permitiria predecir de forma sencilla la capacidad pro-apoptótica de los compuestos según su capacidad de transferencia electrónica. / It has been obtained a serie of flavanol conjugates from grape byproduct through acid depolimerisation with cysteine derivatives. The conjugates were separated efficiently form the crude extract using ion exchange chromatography. The conjugates of epicatechin, catechin and epicatechin 3-O-gallate with L-cysteine, O-ethylcysteine and N-acetylcysteine were purificated by reverse phase chromatography. These conjugates showed an enhanced antiradical power using the free radical DPPH (through electron transfer and/or hydrogen atom donation) and the recently synthetized free radical HNTTM (reduced only by electron transfer). All the conjugates showed higher antiradical power than the monomeric epicatechin and the conjugates containing the gallate group were the most active compounds against free radicals. Studies about tumoral human melanoma (A375 and M21) and adenocarcinoma (HT29) cell lines and non-tumoral keratinocyte cell line (HaCaT) were also performed. It was observed a moderate effect in cell viability inhibition, being the conjugates containing the gallate group the most effective ones. Regarding cell cycle, only the conjugates containing the gallate group showed S-phase arrest to concentrations double of its IC50. Moreover, it was observed an induction of apoptosis in the tumoral cell lines treated with the conjugates, but not in the keratinocyte cell line. Surprisingly, just only one of the conjugates containing a gallate group showed a normal cell cycle distribution and it did not induce apoptosis to the tumoral cell line. Thus, its antiradical power agaisnt HNTTM (electron transfer) was lower than expected for a galloylated compound. With these results, a possible relationship between electron transfer and the cellular mechanism was proposed.

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Una dieta rica en frutas y verduras parece ser importante para la prevención de enfermedades relacionadas con el estrés oxidativo y por tanto es posible que alguno de sus compuestos constituyentes o la interacción de varios de ellos sean los responsables del efecto protector que presentan. Los flavonoides son los principales candidatos debido su abundancia en el reino vegetal y la actividad antioxidante que presentan en su estado natural. Existe una gran variedad de flavonoides que difieren en su estructura. Las pequeñas diferencias en la estructura química resultan en grandes diferencias en el efecto biológico. Además cuando los flavonoides son ingeridos sufren biotransformaciones que modifican la estructura química de los compuestos y por lo tanto, la actividad biológica se ve modificada. Una gran parte de los flavonoides que forman parte de frutas y verduras se encuentra en forma polimérica y fundamentalmente son proantocianidinas. Así, el objetivo general de la presente tesis fue contribuir al establecimiento de las bases científicas para el uso de fracciones polifenólicas y fibra dietética constituidas básicamente por proantocianidinas en la prevención de enfermedades como el cáncer. Para ello, se realizó un estudio de la relación entre el grado de polimerización y porcentaje de galoización y el efecto antioxidante y biológico de fracciones de proantocianidinas de diferente composición en diferentes medios físico-químicos. Así, fracciones obtenidas de corteza de pino (exentas de galato), de subproductos del prensado de la uva (porcentaje de galoización media) y de Hamamelis (de elevada galoización) fueron caracterizadas por despolimerización ácida y posteriormente se evaluó la capacidad antioxidante (método DPPH, TEAC), antirradicalaria (método del radical HNTTM, TNPTM), inhibición a la oxidación lipídica y el efecto antiproliferativo en una línea celular de melanoma (SK-MEL-28). Los resultados mostraron que los efectos químicos y biológicos en los que están implicadas las proantocianidinas están influidos de menor a mayor grado por el grado de polimerización, porcentaje de galatos y porcentaje de grupos pirogalol. Además se realizó un estudio de las biotransformaciones que sufren las proantocianidinas utilizando como muestra rica en proantocianidinas una fibra dietética procedente de subproductos del prensado de la uva. Para ello, se realizó previamente la identificación de los compuestos fenólicos mayoritarios y posteriormente con el fin de avanzar en el conocimiento de los posibles efectos beneficiosos de los polifenoles, se realizó un estudio de identificación de metabolitos tras la ingesta de fibra antioxidante de uva en ratas. Experimentos en tándem (LC-MS/MS) permitieron identificar 18 metabolitos procedentes de epicatequina monomérica y diversos ácidos fenólicos resultantes de la fermentación colónica. PALABRAS CLAVE: Radicales libres, Actividad antioxidante, Polifenoles, Fibra dietética, Procianidinas / Many epidemiological studies indicate that a diet rich in flavonoids from vegetables and fruits appear to be inversely related to several diseases and cancer mortality. Flavonoids in food have been shown to have powerful free-radical scavenging activity, antioxidant activity, and anti-tumor promoting effect. There are more than 5000 different types of flavonoids with numerous structural variations within. Small differences in their structure are converted into great differences in their biological activity. Moreover, polyphenols are extensively metabolized in the intestinal tract and liver. Thus, it is very important to examine the action of these compounds from different angles and evaluate their effects and risks. The main objective of the present PhD has been to contribute to the knowledge of the chemical and biological effects of polyphenols, especially proanthocyanidins. The influence of the degree of polimeration and percentage galloylation and the biological activities of proanthocyanidins fractions were evaluated. The results show that the most cytotoxic /antiproliferative fractions showed also the highest electron transfer capacity. The study of the metabolization of polyphenols after the intake of antioxidant dietary fiber (GADF) rich in proanthocyanidins resulted in the identification of more than 18 metabolites such a epicatechin mono, di-, tri- conjugates and also phenolic acids from colonic fermentation and even phenolic acids conjugates with sulfated and glucuronide. KEYWORDS: Free radicals, Antioxidant capacitiy, Polyphenols, Dieraty fiber, Procianidins

During aerobic cell metabolism, molecular oxygen is reduced to water through electron-transfer reactions, and the oxygen not completely reduced is transformed into a set of neutral and free radical molecules with high oxidant ability, generally denominated Reactive Oxygen Species (ROS). To regulate the cellular ROS content, organisms are endowed with an efficient endogen antioxidant system. The physiological ROS levels may be excessively increased by different factors including unbalanced diets, ionizing radiations, and tobacco smoke among others, leading to the oxidative stress, term referred to the imbalance between ROS production and its neutralization by the endogenous antioxidant system. More importantly, in vitro and in vivo studies reveal the relationship between suffering oxidative stress and the development of cardiovascular and respiratory diseases, diabetes, and cancer. To prevent and treat the oxidative stress and its adverse effects, exogenous, readily oxidizable molecules may help the organism to neutralize ROS into less dangerous species. The phenolic compounds or (poly)phenols, molecules very abundant in our diet (i.e. fruits, vegetables, and beverages such as tea and wine) may be responsible for this antioxidant activity of fruits and vegetables. Currently, (poly)phenols are regarded as natural antioxidant molecules with outstanding beneficial effects, including anti-aging activity, and the prevention of cancer and diabetes. The antioxidant activity of (poly)phenols is mainly associated with their radical scavenging activity, action conferred by the transfer of a hydrogen atom or an electron to a free radical, rendering a less reactive molecule. On the other hand, chemical probes and in vitro studies have demonstrated that some highly reacting (poly)phenols are able to generate small quantities of ROS. Phenolic compounds have shown antiproliferative activity which may be caused inter alia by their ability to scavenge or generate toxic radicals. To further understand the connection between the redox reactivity of (poly)phenols and their biological actions, studies with more sensitive and selective chemical probes may help to clarify the role of redox reactions in the physiological actions of phenolics and their metabolites. In this thesis, we have focused on the utilization of two stable radicals synthesized in our laboratory, the tris(2,4,6-trichloro-3,5-dinitropehnyl)methyl (HNTTM) and the tris(2,3,5,6-tetrachloro-4-nitrophenyl)methyl)radical (TNPTM), as chemical probes to determine the electron-transfer activity of dietary (poly)phenols and some metabolites. The different reducing potential of the two stable radicals facilitates the quantitative evaluation of the radical scavenging capacity of each (poly)phenol, as well as the establishment of the most reactive moieties. TNPTM is a useful tool to determine the most reactive (poly)phenols as electron transfer donors, (poly)phenols that cannot be differentiate with any other chemosensor. The results obtained are compared with two well-established methods for the quantification of electron-transfer capacity. The action of these (poly)phenols on cell cultures of a colon cancer cell line is also presented, showing a correlation between those (poly)phenols detected with TNTPM and with those that produce the highest antiproliferative activity. This cell line is particularly relevant because dietary (poly)phenols are in contact with epithelial cells of this kind during their transit along the digestive tract and may exert some preventive action on colon cancer. In addition, a chemoenzymatic strategy to prepare glucuronated metabolites of (-)-epigallocatechin-3-O-gallate (EGCG), the most abundant and active (poly)phenol of green tea, was attempted, obtaining the acetylated and methylated precursor of the EGCG-4’’-glucuronide, the most abundant EGCG glucuronide obtained in the human metabolism. The final conjugated, the EGCG-4’’-glucruonide, was obtained albeit with not enough quantity to be purified. / "Estudi de la Transferència Electrònica de compostos fenòlics i la seva relació amb l’activitat biològica en cèl•lules canceroses" En el metabolisme i respiració dels organismes aeròbics, l’oxigen és utilitzat com a receptor electrònic reduint-se principalment a aigua. Una petita part d’aquest oxigen no és totalment reduint obtenint-se un conjunt d’espècies radicalàries i no radicalàries (ROS). Aquestes espècies en ser altament reactives poden malmetre macromolècules, activitat que està relacionada amb l’aparició de malalties com el síndrome metabòlic i el càncer. Per aquest motiu els organismes han desenvolupat un sistema de regulació de la seva concentració. En determinades situacions, aquest sistema no és suficient i per tant, antioxidants exògens poden ajudar a aquest sistema endògen. Els polifenols molècules abundants en la nostra dieta (fruita i verdures) són els principals candidats, i s’ha demostrat un efecte preventiu i terapèutic en la salut per la seva part. L’efecte beneficiós exercit pels polifenols pot tenir lloc per dos mecanismes de reacció; per transferència d’hidrogen i per transferència electrònica. Actualment, no hi ha cap mètode prou eficaç que ens permeti determinar la acció del polifenols exercida per transferència electrònica, mecanisme que també habilita als polifenols per a formar ROS. En el nostre laboratori hem sintetitzat dos radicals lliures estables, els radicals tris(2,4,6-tricloro-3,5-dinitrofenil)metil (HNTTM) i el tris(2,3,5,6-tetracloro-4-nitrofenil)metil (TNPTM) com a quimiosensors de transferència electrònica. Aquests radicals ens permeten mesurar la activitat antiradicalària dels polifenols, i el TNPTM ens permet detectar a aquells polifenols amb una reactivitat per transferència electrònica més elevada i que no poden ser diferenciats amb altres mètodes. S’han fet estudis d’antiproliferació per part dels polifenols en cèl•lules de càncer de còlon HT-29 i s’ha demostrat que els polifenols amb més activitat antiproliferativa són els que tenen activitat front al TNPTM. Per tant, el radical TNPTM permet determinar als polifenols amb una elevada reactivitat per a cedir electrons i es suggereix que els mecanismes de transferència electrònica juguen un paper important en els mecanismes d’ antiproliferació en cèl•lules de càncer de còlon HT-29. S’ha proposat metodologia sintètica per a obtenir els principals glucuronats de l’epigal•locatequin-3-O-gal•lat (EGCG) el més abundant i més actiu dels polifenols del te verd. S’ha obtingut el precursor acetil•lat i metil•lat del glucuronat majoritari de l’EGCG obtingut en el metabolisme humà, l’EGCG-4’’-glucurònid i s’ha obtingut el conjugat final però no amb una quantitat suficient com per a ser aïllat.