Reproduction de : Thèse d'exercice : Médecine. Médecine générale : Nantes : 2008. / Bibliogr.

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De nombreuses études ont établi que la majorité des neurones libèrent plus qu’une substance chimique. Il est bien connu que les neurones peuvent co-exprimer et co-libérer des neuropeptides en plus de leur neurotransmetteur, mais des évidences de la co-libération de deux petits neurotransmetteurs à action rapide se sont accumulées récemment. Des enregistrements électrophysiologiques ont aussi montré que des neurones sérotoninergiques et dopaminergiques isolés peuvent libérer du glutamate quand ils sont placés en culture. De plus, la présence de glutamate et de glutaminase a été détectée dans des neurones sérotoninergiques, dopaminergiques et noradrénergiques par immunomarquage sur des tranches de cerveau. Malheureusement, en considérant le rôle métabolique du glutamate, sa détection immunologique n’est pas suffisante pour assurer le phénotype glutamatergique d’un neurone. Récemment, la découverte de trois transporteurs vésiculaires du glutamate (VGLUT1-3) a grandement facilité l’identification des neurones glutamatergiques. Ces transporteurs sont nécessaires pour la libération de glutamate et constituent les premiers marqueurs morphologiques du phénotype glutamatergique. Il a été démontré que des neurones noradrénergiques expriment VGLUT2 et que des neurones sérotoninergiques expriment VGLUT3. Mais aucune évidence d’expression d’un des sous-types de VGLUT n’a été reportée pour les neurones dopaminergiques. Le but de notre travail était d’identifier quel sous-type de VGLUT est exprimé par les neurones dopaminergiques mésencéphaliques, et de déterminer si le phénotype glutamatergique de ces neurones peut être modulé dans des conditions particulières. Premièrement, nous avons utilisé des microcultures pour isoler les neurones dopaminergiques et des doubles marquages immunocytochimiques pour observer l’expression de VGLUT dans les neurones positifs pour la tyrosine hydroxylase (TH). Nous avons montré que la majorité (80%) des neurones TH+ isolés exprime spécifiquement VGLUT2. Cette expression est précoce au cours du développement in vitro et limitée aux projections axonales des neurones dopaminergiques. Toutefois, cette forte expression in vitro contraste avec la non-détection de ce transporteur dans les rats adultes in vivo. Nous avons décidé ensuite de regarder si l’expression de VGLUT2 pouvait être régulée pendant le développement cérébral de jeunes rats et sous des conditions traumatiques, par double hybridation in situ. Entre 14 et 16 jours embryonnaires, les marquages de VGLUT2 et de TH montraient une superposition significative qui n’était pas retrouvée à des stades ultérieurs. Dans le mésencéphale de jeunes rats postnataux, nous avons détecté l’ARNm de VGLUT2 dans environs 1-2% des neurones exprimant l’ARNm de TH dans la substance noire et l’aire tegmentaire ventrale (ATV). Pour explorer la régulation de l’expression de VGLUT2 dans des conditions traumatiques, nous avons utilisé la 6-hydroxydopamine (6-OHDA) pour léser les neurones dopaminergiques dans les jeunes rats. Dix jours après la chirurgie, nous avons trouvé que 27% des neurones dopaminergiques survivants dans l’ATV exprimaient l’ARNm de VGLUT2 dans les rats 6-OHDA. Finalement, nous avons observé la colocalisation de la protéine VGLUT2 dans les terminaisons TH positives par microscopie électronique. Dans les rats normaux, la protéine VGLUT2 est retrouvée dans 28% des terminaisons axonales TH dans le noyau accumbens. Dans les rats lésés à la 6-OHDA, nous avons observé une diminution considérable des terminaisons TH positives, et une augmentation dans la proportion (37%) des terminaisons dopaminergiques présentant du VGLUT2. Nos résultats suggèrent que le phénotype glutamatergique des neurones dopaminergiques est régulé au cours du développement, peut être réactivé dans des états pathologiques, et que ces neurones peuvent libérer du glutamate dans conditions spécifiques. / Numerous studies have established that the majority of neurons release more than one chemical substance. It is well known that neurons can co-express and co-release neuropeptides in addition to their neurotransmitter, but evidence of co-release of two small and fast-acting neurotransmitters has been accumulated recently. Electrophysiological recordings have also shown that isolated serotonine and dopamine neurons can release glutamate as a co-transmitter when they are placed in culture. Furthermore, the presence of glutamate and glutaminase has been detected in serotonine, dopamine and noradrenaline neurons by immunolabelling in brain slices. Unfortunately, considering the metabolic role of glutamate, its immunodetection is not sufficient to assert the glutamatergic phenotype of a neuron. Recently, the discovery of three vesicular glutamate transporters (VGLUT1-3) has greatly facilitated the identification of glutamate neurons. These transporters are necessary for the glutamate release by neurons and constitute the first molecular markers of a glutamatergic phenotype. Interestingly, it was demonstrated that some noradrenaline neurons express VGLUT2 and that some serotonin neurons express VGLUT3. But no evidence for expression of any VGLUT subtypes was initially reported for dopamine neurons. The goal of our work was to identify which VGLUT subtype is expressed by mesencephalic dopamine neurons, and to determine if the glutamatergic phenotype of these neurons can be modulated under specific conditions. First, we used microcultures to isolate dopamine neurons and double immunocytochemistry to visualize VGLUT expression in tyrosine hydroxylase (TH) positive neurons. We showed that the majority (80%) of isolated TH+ neurons express specifically VGLUT2. This expression occurred early during in vitro development and was limited to axonal projections of dopamine neurons. However, this strong expression in vitro contrasted with the lack of detection of this transporter in adult rats in vivo. We next decided to investigate if VGLUT2 expression could be regulated during brain development of young rats and under traumatic conditions, using double in situ hybridization. At embryonic days 14 to 16, VGLUT2 and TH labelling displayed significant overlap which was no longer found at later stages. In postnatal mesencephalon of young rats, we detected VGLUT2 mRNA in approximately 1-2% of neurons expressing TH mRNA in the substantia nigra and in ventral tegmental area (VTA). To explore the regulation of VGLUT2 expression under traumatic condition, we used 6-hydroxydopamine (6-OHDA) to damage dopamine neurons in young rats. Ten days post-surgery, we found that 27% of surviving dopamine neurons in the VTA expressed VGLUT2 mRNA in 6-OHDA animals. Finally, we observed the colocalisation of VGLUT2 protein in TH positive terminals by electron microscopy. In normal rats, VGLUT2 protein was found in 28% of TH positive axon terminals in nucleus accumbens. In 6 OHDA-lesioned rats, we observed a considerable reduction of TH positive terminals, and an increase in the proportion (37%) of dopamine terminals displaying VGLUT2. Our results suggest that the glutamatergic phenotype of dopamine neurons is developmentally regulated, can be reactivated under pathological states, and that these neurons are able to release glutamate under specific conditions.

Les effets de la marijuana, un médicament utilisé par l’homme depuis des millénaires, sur le système visuel sont peu connus. Une meilleure connaissance de la distribution du système endocannabinoïde (eCB) de la rétine pourrait expliquer comment cette drogue affecte la vision. Cette étude vise à caractériser la distribution du récepteur cannabinoïde CB1 (CB1R) et de l’enzyme de dégradation FAAH (“fatty acid amide hydrolase”) des ligands du CB1R dans la rétine du singe Vert (Chlorocebus sabaeus). De plus, elle vise à déterminer quelles sous-populations cellulaires de la rétine expriment ces composantes. La plupart des études à ce jour ont été conduites surtout sur les rongeurs et peu de travaux ont été réalisés chez le singe. Notre étude vient donc combler cette carence. Par le biais de méthodes immunohistochimiques, nous avons investigué la localisation du CB1R et de l’enzyme FAAH à différentes excentricités rétiniennes, de la fovéa centralis vers la périphérie. Nos résultats, en accord avec notre hypothèse de travail, démontrent que CB1R et FAAH sont exprimés à travers toute la rétine mais avec, cependant, des différences notoires. Au niveau de la couche des photorécepteurs, CB1R est exprimé préférentiellement dans les cônes et ce patron d’expression suit la distribution des photorécepteurs centre-périphérie. De plus, CB1R se retrouve surtout dans les pédicules des cônes de la couche plexiforme externe. CB1R et FAAH sont abondants dans les cellules bipolaires tant au centre qu’en périphérie. Le soma et l’axone des cellules ganglionnaires expriment aussi CB1R et FAAH. Ces données suggèrent que le système eCB est présent à travers toute la rétine du primate et pourrait expliquer les perturbations visuelles entrainées par la marijuana, telles la photosensibilité et la vision des couleurs. / The effects of marijuana, a drug that has been used by men for millennia, on the visual system are poorly understood. A better understanding of the distribution of the endocannabinoid system in the retina will help us explain how this drug affects vision. This study aims at characterizing the distribution of the endocannabinoid receptor CB1 (CB1R) and the enzyme degrading CB1R ligands, fatty acid amide hydrolase (FAAH) throughout the Green monkey retina (Chlorocebus sabaeus). In addition, it seeks to determine which sub-population of neurons expresses CB1R and the degrading enzyme FAAH. Most data on the endocannabinoid system have been acquired in rodents and studies on monkeys are rather scarce. We attempted to fill this void by using immunohistochemical methods to locate CB1R and FAAH at various eccentricities of the monkey retina, from the center to the far periphery. Our results, in agreement with our hypothesis, demonstrate that CB1R and FAAH are expressed throughout the retina. At the level of the photoreceptors, CB1R is expressed preferentially in cones rather than in rods, and this expression pattern follows the photoreceptors distribution. In the outer plexiform layer, CB1R immunoreactivity is predominantly concentrated in the cone pedicles. Although foveal cones are the main expressers of both CB1R and FAAH, these are also found in rod bipolar cells. The ganglion cell axons strongly express the CB1 receptor and the enzyme FAAH. These data suggest that the presence of CB1R throughout the retina may be responsible for the visual effects commonly reported by cannabis users, such as the increase in photosensitivity and alterations in color discrimination.

Tau est une protéine associée aux microtubules enrichie dans l’axone. Dans la maladie d’Alzheimer, Tau devient anormalement hyperphosphorylée, s’accumule dans le compartiment somato-dendritique et s’agrège pour former des enchevêtrements neurofibrillaires (NFTs). Ces NFTs se propagent dans le cerveau dans un ordre bien précis. Ils apparaissent d’abord dans le cortex transenthorinal pour ensuite se propager là où ces neurones projettent, c’est-à-dire au cortex entorhinal. Les NFTs s’étendent ensuite à l’hippocampe puis à différentes régions du cortex et néocortex. De plus, des études récentes ont démontré que la protéine Tau peut être sécrétée par des lignées neuronales et que lorsqu’on injecte des agrégats de Tau dans un cerveau de souris, ceux-ci peuvent pénétrer dans les neurones et induire la pathologie de Tau dans le cerveau. Ces observations ont mené à l’hypothèse que la protéine Tau pathologique pourrait être sécrétée par les neurones, pour ensuite être endocytée par les cellules avoisinantes et ainsi propager la maladie. L’objectif de la présente étude était donc de prouver la sécrétion de la protéine Tau par les neurones et d’identifier par quelle voie elle est secrétée. Nos résultats ont permis de démontrer que la protéine Tau est sécrétée par des neurones corticaux de souris de type sauvage ainsi que dans un modèle de surexpression dans des cellules HeLa et PC12. Nos résultats indiquent que la sécrétion de Tau se ferait par les autophagosomes. Finalement, nous avons démontré que la protéine Tau sécrétée est déphosphorylée et clivée par rapport à la protéine Tau intracellulaire non sécrétée. / Tau, a microtubule-associated protein, is enriched in the axon. In Alzheimer’s disease, Tau becomes hyperphosphorylated, redistributes to the somato-dendritic compartment and forms aggregates called neurofibrillary tangles (NFTs). The NFTs propagates in a predictable manner in particular neuronal networks. Indeed, they appear in the trans-entorhinal region and then propagate to the entorhinal cortex where the trans-entorhinal cortex projects. Then, the NFTs propagate to the hippocampus and to different regions of the cortex and neocortex. Recent studies have reported that Tau can be secreted by neuronal cell lines. Besides, when aggregates of Tau protein were injected in mouse brain, they could enter neurons and induced Tau pathology. Based on those observations, it was speculated that Tau could be secreted by neurons and then captured by neighbouring cells to propagate Tau pathology in the brain. The goal of the present study was to prove that Tau can be secreted by neurons and to find the secretory pathway involved in Tau secretion. Moreover, the phosphorylation state of Tau protein was examined and compared to intracellular non-secreted Tau. Our results showed that Tau is secreted by cortical neurons isolated from wild-type mice and by HeLa and PC12 cells overexpressing human Tau. Our results also indicated that autophagosomes would be involved in Tau secretion. Finally, we found that secreted Tau was dephosphorylated and cleaved compared to the non-secreted intracellular Tau.

La plupart des études sur la perception isolent une modalité sensorielle pour mieux l’étudier et la comprendre. Malheureusement, aucun de nos sens ne représente la seule source d’information, car une intégration sensorielle se fait en tout moment lors de la perception de l’environnement. L’information d’un sens est donc plutôt en accord ou en conflit avec l’apport d’information des autres sens. Le but de la présente étude était d’investiguer, par IRMf, les activations cérébrales d’une intégration visuelle et olfactive lorsque ces deux perceptions sont congruentes. Pour ce faire, une image et/ou une odeur étaient présentées au sujet et ce dernier devait identifier si le stimulus perçu était congruent. Ce protocole permettait d’observer les activations cérébrales lors de l’analyse d’un stimulus et la prise de décision selon la congruité du stimulus présenté. La condition de congruence vision-odeur activa les zones visuelles et olfactives plus fortement que lors des conditions contrôle (image seule, odeur seule). Ces résultats illustrent une potentialisation des aires visuelles et olfactives par une intégration d’information congruente venant de ces deux modalités. Par conséquent, l’intégration d’un stimulus visuel et odorant congruent semble rehausser la perception du stimulus. / Most studies on perception isolate one sensory modality in order to better study and comprehend it. Unfortunately, none of our senses represents the only source of information, since sensory integration is underway at all times during environmental perception. The information from one sense is therefore usually in agreement with or in conflict with the input of information from other senses. The goal of the present study was to investigate, by fMRI, the cerebral activations caused by visual and olfactory integration when these two perceptions are congruent. To do this, an image and/or an odour were presented to the subject who then had the task of identifying whether the perceived stimulus was congruent. This protocol allowed the observation of the cerebral activations during stimulus analysis and decision-making depending on the congruity of the presented stimulus. The vision-odour congruent condition activated the visual and olfactory areas more strongly than the control conditions (image only, odour only). These results illustrate a potentialization of the visual and olfactory areas by an integration of the congruent information coming from these two modalities. As a result, the integration of a visual and olfactory congruent stimulus seems to enhance the perception of a stimulus.

Proximale Spinale Muskel Atrophie (SMA) ist eine autosomal rezessive Krankheit, charakterisiert durch eine Degeneration des zweiten Motorneurons und einer progressiven Paralyse und Atrophie proximaler Muskeln. Nach Zystischer Fibrose, ist SMA die häufigste autosomal rezessive Erkrankung bei Menschen und der häufigste genetische Grund für Säuglingssterblichkeit. SMA, monogenetisch im Ursprung, ist verursacht durch eine Mutation in einem einzelnen Gen, dem Survival Motor Neuron 1 (SMN1) Gen, was zu einer reduzierten Menge an Survival Motor Neuron (SMN) protein führt. SMN ist ein ubiquitär expremiertes Protein mit house-keeping Funktion in snRNP Biogenese und pre-mRNA splicen. Dennoch, eine reduzierte Menge an SMN beeinträchtigt vor allem Motor Neurone und Muskeln aus bisher unverständlichen Gründen. Es wurde demonstriert, dass SMN mit ß-actin mRNA interagiert und an dessen Transport entlang des Axons beteiligt ist. Funktionelle Studien an der Neuromuskulären Synapse (NMJ) haben gezeigt, dass Evozierte Neurotransmitterfreisetzung um 55 % reduziert war in den meist betroffenen Muskelgruppen, dies indiziert, dass eine verringerte Menge an Vesikeln fusioniert, währenddessen asynchrone Transmitterfreisetzung um 300 % erhöht ist aufgrund von einer abnormalen Akkumulation von Calcium in der Nervenendigung in SMA Mäusen. Eine Mögliche Erklärung für diese Calcium Erhöhung ist eine herabgesetzte Calcium Aufnahme durch Mitochondrien während Serien von Aktions Potenzialen. Diese Studie präsentiert eine umfassende Analyse mit einem Fluoreszens Konfokal Mikroskop über die Organisation und Fülle Synaptischer Vesikel (SVs), Mitochonrien und Aktin in Nervenendigungen von SMA Mäusen ( Smn -/-; SMN2; SMNdelta7). Wir visualisierten Synaptische Vesikel mit einem Antikörper gegen den Acetylcholin ( VACht) und konnten zeigen, dass im Transversus Abdominis (TVA) Muskel SV Klusters während des Reifungsprozesse klein verbleiben mit einer Reduzierung von 50% der totalen Fläche die von SVs bedeckt ist. Diese schwere Reduktion von SVs wurde auch im der kaudalen Muskelstrang des Levator auris longus (LAL) Muskel gefunden, obwohl nur leichte Veränderungen in der Postsynapse dieses Muskels festzustellen sind. Diese Ergebniss von Präsynaptischer Pathologie, neben fast normalen postsynaptischen Status, verstärkt die Hypothese dass SMN-induzierte Veränderungen im Muskel nicht auschließlich eine reine Konsequenz von Motor Neuron Degeneration sein können. Als Nächstes, haben wir Mitochondria mit Mitotracker angefärbt und haben gefunden, dass die Fläche,die von Mitochondrien in Mutanten Mäusen bedeckt ist, etwa nur die Hälfte der Fläche im Wild typ beträgt. Überraschenderweise waren SVs und Mitochondrien stak kolokalisiert. In vielen Fällen war ein Kern von Mitochondrien deutlich umgeben von einem Ring aus SVs. Diese Verteilung war unbeeinträchtig in der Mutanten Maus und könnte eine mehr generelle Bedeutung in Nervenendigungen haben. Phalloidin gefärbtes Aktin zeigte das F-aktin ringförmige Strukturen um SV Klusters formt. Diese Strukturen und der Prozentuale Anteil der Nervenendigung der von Aktin bedeckt ist, war geringer in SMA Mutanten Mäusen. Aktin ist an multiblen Schritten des Vesikel Zyklus beteiligt. Kurz Strecken-Transport von Vesikeln und Organellen, wie Mitochondrien in Wachstunskegeln und Nervendigungen ist vor allem vom aktin-myosin-basierten Transport abhängig. Weitere Arbeit ist notwendig um zu klären ob die Charakteristiken des SMA Phänotyps wie abnormales SV Klustering, Reduktion von Mitochondrien, unabhängig auftreten oder eine gemeinsame Konsequenz von einer Dysfunktion des Aktin Zytoskeleton sind, was Aktin eine Schlüsselrolle in der SMA Pathogenese verleihen würde.

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Parmi les maladies neurologiques, celles qui atteignent la conscience constituent la pire des épreuves infligée à la puissance de notre esprit, socle de notre autonomie. C'est bien à un défi éthique que se mesurent les soignants et les accompagnants, confrontés à la complexité de la rencontre avec cette personne blessée dans ses possibilités mêmes d'être présente au monde, d'affirmer son identité et sa liberté : comment proposer une attitude juste et aidante de la relation de soins répondant à cette tragédie humaine ? Comment préserver l'autonomie de ce sujet sans méconnaître son extrême vulnérabilité ? Comment affirmer la permanence de la personne alors que sa conscience s'en va ? Comment, dans les situations extrêmes, savoir éviter une obstination que la loi qualifie de déraisonnable ? Nous proposons dans ce travail les réponses nuancées qu'impose la déclinaison de la conscience en degrés, dans son état ou ses contenus, s'opposant ainsi aux réponses obligatoirement binaires de la loi ou d'une éthique exagérément principliste. Mais manier la complexité n'empêche pas l'audace des paris ni la sagesse des limites. Parier sur les capacités plus que sur les déficits ne guérit pas le malade, mais modifie totalement la relation soignante dans le sens de la préservation de l'autonomie, dût-elle être accompagnée. En même temps, ces situations qui touchent parfois à l'extrême vulnérabilité, aux limites de l'humain comme de la médecine, interpellent notre responsabilité ainsi que notre souci de bienfaisance, nous invitant à éviter la pente de l'abandon, la tentation de la violence comme la déraison de l'obstination. L'éthique n'est-elle pas par essence la recherche d'une sagesse pratique visant à atténuer le tragique des situations ?

Chez les vertébrés, la neurulation représente les premiers stades de développement du système nerveux durant l'embryogenèse. Elle consiste en la formation, à partir du neuroectoderme, des premières ébauches du système nerveux. Ce processus est finement régulé par un réseau complexe de gènes et le dérèglement de l'un d'entre eux peut entraîner le développement d'une maladie congénitale. Le traitement et la prévention de ces maladies passent par le savoir et la compréhension des différents processus impliqués dans le développement du système nerveux. La souris est un bon modèle d'étude in vivo de la neurogenèse et la technologie Cre-LoxP permet de contrôler l'activation spatiotemporelle d'un transgène. Cependant, aucun modèle de souris ne cible spécifiquement la plaque postérieure durant la neurulation de l'embryon. L'enhancer intronique Cdx2NSE a été caractérisé comme capable de récapituler l'expression du gène Cdx2 dans la plaque neurale postérieure. Notre nouvelle lignée de souris transgénique Cdx2NSE-Cre est capable d'exprimer la recombinase Cre dès le jour embryonnaire 7.5 (E.7.5) dans la plaque neurale postérieure. Elle permet ainsi de cibler le tube neural avec comme limite antérieure la partie caudale du rhomboncéphale. Dans ces mêmes limites, toutes les structures dérivées des cellules de la crête neurale vont également être ciblées par notre nouveau modèle murin, ce qui en fait un très bon outil pour l'étude de la neurogenèse. Le mécanisme de régulation des protéines Cdx spécifiquement dans le neuroectoderme est à ce jour toujours méconnu. L'étude in vitro de ce même enhancer Cdx2NSE nous a permis de montrer que les trois principales voies de signalisation impliquées dans le développement neural et dans l'induction des cellules de la crête neurale, à savoir les voies FGF, BMP et Wnt canonique, sont capables d'en réguler son expression sous le contrôle du gène rapporteur de la luciférase. Enfin, différentes études suggèrent une implication des protéines Cdx dans l'induction des cellules de la crête neurale et dans la fermeture du tube neural, notamment par la régulation de Pax3. Les enhancers de la crête neurale de Pax3 NCE1 et NCE2 sont effectivement régulés par la voie Wnt-Cdx (Sanchez-Ferras et al., 2012) mais un troisième enhancer de la crête neurale (NCE3) a été également caractérisé (Dagenhardt et al., 2010). Nos résultats préliminaires en essai luciférase nous suggèrent une régulation positive de cet enhancer NCE3 par les protéines Cdx1 et Cdx2. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : neurogenèse, Cdx2NSE, souris, voies de signalisation, Cdx, Pax3, NCE3