The formation of synapses in cell cultures of rat cerebellum was examined in the presence of the protein synthesis inhibitor cycloheximide. First, cell survival in the presence of 25 μg/ml cycloheximide was determined by phase contrast microscopy, trypan blue exclusion, total protein and uptake of [3H]gamma-aminobutyric acid (GABA). Neurons with 24 h incubation in cycloheximide appeared normal with little cell death, but by 48 h incubation the first signs of cell death were found. Some viable neurons were still found in cultures incubated continuously in cycloheximide for 72 h. Normally, the number of synapses seen in cerebellar cultures with the electron microscope shows an increase during the first several weeks in culture. However, the number of synapses in cultures treated with cycloheximide decreased, indicating that inhibition of protein synthesis at least partially inhibited synaptogenesis. Cycloheximide also inhibited the maintenance of synapses already formed as seen by the decrease in the number of synapses from the time the cycloheximide was added. To determine the sensitivity of the forming presynaptic element to cycloheximide, the development of apparent presynaptic elements was investigated. In cultures treated with polylysine-coated sepharose beads, neurites grew and formed apparent presynaptic elements with the bead taking the position of the postsynaptic element. Cultures pretreated with cycloheximide for 1 h followed by 24 h incubation with both cycloheximide and coated beads showed a normal number of apparent presynaptic elements. The first decrease in numbers was seen after 12 h preincubation and 12 h incubation with both cycloheximide and coated beads. Even after 72 h continuous incubation some apparent presynaptic elements could be formed although at reduced levels. Results presented here suggest that continuous protein synthesis is not necessary for the formation of the presynaptic element, but that active protein synthesis is required for neurons to form and maintain postsynaptic elements.

Hypertension is associated with marked cardiac sympathetic over-activity and end organ hyper-responsiveness. The sympathetic dysfunction is caused by aberrant calcium (Ca²⁺) handling resulting in enhanced neurotransmission. However, it remains unclear whether the sympathetic neuron or the myocytes is the primary driver behind the initiation and maintenance of the autonomic phenotype. The work in this thesis characterises the Ca²⁺ dysfunction and regulation at the membrane level. Further, it employs physiologically coupled sympathetic neurons and ventricular myocytes to determine the cellular driver of cardiac dysautonomia in the pro-hypertensive state. <b>Chapter 1</b> provides a general overview of the field of autonomic hypertension with a specific focus on the sympathetic control of cardiac excitability. In particular, the role of Ca²⁺ and cyclic nucleotides in the facilitation of neurotransmission are explored. <b>Chapter 2</b> details the methods used in this thesis. It provides rationale for the approaches taken to record membrane Ca2+ currents, cyclic adenosine monophosphate (cAMP) levels and cAMP-activated protein kinase (PKA) activity, and the development and uses of a co-culture of coupled sympathetic neurons and ventricular myocytes. <b>Chapter 3</b> describes the successful development of an effective voltage clamp method to isolate whole cell Ca²⁺ currents in sympathetic neurons. It details the issue of space clamp problem when using this technique on peripheral neurons and provides experimental guidance on how to quantify and limit theses issues. <b>Chapter 4</b> identifies that the pro-hypertensive four-week old neurons from the spontaneously hypertensive rat (SHR) have significantly larger whole cell Ca²⁺ currents when compared to normotensive (Wistar Kyoto-WKY) neurons, that are largely N-type in nature. Restoring the cGMP cyclic nucleotide dysfunction seen in these cells, rescues the ion channel phenotype and bring the Ca²⁺ down to levels seen in the normotensive WKY neuron. Further, it identifies that phosphodiesterase (PDE) 2A inhibition differentially affects the currents in the WKY and SHR, further supporting the notion of PDE2A dominance. <b>Chapter 5</b> identifies the presence and functional relevance of cGMP cross-talk with the cAMP-PKA pathway in sympathetic neurons. This cross talk is significantly altered in the pro-hypertensive state, via the differential involvement of PDEs. It functionally identifies the presence of PDE3 and PDE2A and provides further evidence that these enzymes could be dysregulated in pro-hypertensive neurons. <b>Chapter 6</b> describes the use of a co-culture model of ventricular myocytes and sympathetic neurons. Physiological stimulation of the sympathetic neuron with nicotine whilst monitoring cAMP levels in the myocytes confirms that the cellular phenotypes seen in the individual cells are functionally present in the co-culture. Using cross-cultures, it identifies the neuron as the principal driver behind the cardiac sympathetic responses observed in pro-hypertension. The results provide evidence for a dominant role played by the neuron in driving the adrenergic phenotype seen in cardiovascular disease and highlights the potential of using healthy neurons to turn down the gain of neurotransmission, akin to a smart pre-synaptic &beta;-blocker. <b>Chapter 7</b> forms the concluding discussion that summarises the main findings of this thesis and attempt to place it in a clinical context, and highlights avenues of further research. In particular, the possibility of using a cell therapeutic approach to treat sympathetic hyperactivity.

Humans are exposed to a variety of chemicals including environmental pollutants, cosmetics, food preservatives and drugs. Some of these substances might be harmful to the human body. Traditional toxicological and behavioural investigations performed in animal models are not suitable for the screening of a large number of compounds for potential toxic effects. There is a need for simple and robust in vitro cellular models that allow high-throughput toxicity testing of chemicals, as well as investigation of specific mechanisms of cytotoxicity. The overall aim of the thesis has been to evaluate neuronally differentiated mouse embryonal carcinoma P19 cells (P19 neurons) as a model for such testing. The model has been compared to other cellular models used for neurotoxicity assessment: retinoic acid-differentiated human neuroblastoma SH-SY5Y cells and nerve growth factor-treated rat pheochromocytoma PC12 cells. The chemicals assessed in the studies included the neurotoxicants methylmercury, okadaic acid and acrylamide, the drug of abuse MDMA (“ecstasy”) and a group of piperazine derivatives known as “party pills”. Effects of the chemicals on cell survival, neurite outgrowth and mitochondrial function have been assessed. In Paper I, we describe a fluorescence-based microplate method to detect chemical-induced effects on neurite outgrowth in P19 neurons immunostained against the neuron-specific cytoskeletal protein βIII-tubulin. In Paper II, we show that P19 neurons are more sensitive than differentiated SH-SY5Y and PC12 cells for detection of cytotoxic effects of methylmercury, okadaic acid and acrylamide. Additionally, in P19 neurons and differentiated SH-SY5Y cells, we could demonstrate that toxicity of methylmercury was attenuated by the antioxidant glutathione. In Paper III, we show a time- and temperature-dependent toxicity produced by MDMA in P19 neurons. The mechanisms of MDMA toxicity did not involve inhibition of the serotonin re-uptake transporter or monoamine oxidase, stimulation of 5-HT2A receptors, oxidative stress or loss of mitochondrial membrane potential. In Paper IV, the piperazine derivatives are evaluated for cytotoxicity in P19 neurons and differentiated SH-SY5Y cells. The most toxic compound in both cell models was TFMPP. In P19 neurons, the mechanism of action of TFMPP included loss of mitochondrial membrane potential. In conclusion, P19 neurons are a robust cellular model that may be useful in conjunction with other models for the assessment of chemical-induced neurotoxicity.

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Over the last decade advances in multineuron simultaneous recording techniques have produced huge amounts of data. This has led to the investigation of probable temporal relationships between spike times of neurons as manifestations of the underlying network structure. But the huge dimensionality of data makes the search for patterns difficult. Although this difficulty may be surpassed by employing massive computing resources, understanding the significance and relation of these temporal patterns to the underlying network structure and the causative activity is still difficult. To find such relationships in networks of excitatory neurons, a simplified network structure of feedforward chains called "Synfire chains" has been frequently employed. But in a recurrently connected network where activity from feedback connections is comparable to the feedforward chain, the basic assumptions underlying synfire chains are violated. In the first part of this thesis we propose the first-spike-latency based analysis as a low complexity method of studying the temporal relationships between neurons. Firstly, spike latencies being temporal delays measured at a particular epoch of time (onset of activity after a quiescent period) are a small subset of all the temporal information available in spike trains, thereby hugely reducing the amount of data that needs to be analyzed. We also define for the first time, "Synconset waves and chains" as a sequence of first-spike-times and the causative neuron chain. Using simulations, we show the efficacy of the synconset paradigm in unraveling feedforward chains of excitatory neurons even in a recurrent network. We further create a framework for going back and forth between network structure and the observed first-spike-latency patterns. To quantify these associations between network structure and dynamics we propose a likelihood measure based on Bayesian reasoning. This quantification is agnostic to the methods of association used and as such can be used with any of the existing approaches. We also show the benefits of such an analysis when the recorded data is subsampled, as is the case with most physiological recordings. In the subsequent part of our thesis we show two sample applications of first-spike-latency analysis on data acquired from multielectrode arrays. Our first application dwells on the intricacies of extracting first-spike-latency patterns from multineuron recordings using recordings of glutamate injured cultures. We study the significance of these patterns extracted vis-a-vis patterns that may be obtained from exponential spike latency distributions and show the differences between patterns obtained in injured and control cultures. In a subsequent application, we study the evolution of latency patterns over several days during the lifetime of a dissociated hippocampal culture.

Synuclein, Parkinson's disease, network activity, neuron, tau protein, neurodegeneration, connectivity, cAMP,

Nach dem Eintritt in den Wirtsorganismus und initialer Replikation infizieren Alphaherpesviren Neuronen zur weiteren Ausbreitung im Nervensystem und zur Etablierung einer Latenz. Dazu werden die Viruspartikel innerhalb der Axone retrograd von der Peripherie zum neuronalen Zellkörper transportiert. Die umgekehrte Richtung beschreibt den Weg des anterograden Transports vom Zellkörper zur Synapse für weitere Infektionen von Neuronen höherer Ordnung oder zurück zur Peripherie. Der retrograde intraaxonale Transport ist gut untersucht. Dagegen wird über den anterograden Transport kontrovers diskutiert. Zwei verschiedene Transportmodelle werden vermutet. Das „Married Model“ postuliert, dass umhüllte Virionen innerhalb von Vesikeln entlang des Axons transportiert werden. Die Freisetzung der Partikel erfolgt an der jeweiligen Synapse durch Endocytose. Das „Subassembly Model“ geht dagegen davon aus, dass einzelne Virusstrukurkomponenten (Nukleokapsid, Hülle) entlang des Axons transportiert werden. Der Zusammenbau und die Freisetzung erfolgt am Axonterminus bzw. an der Synapse (in vivo) oder am Wachstumskegel (in vitro) oder an speziellen Auftreibungen des Axons, den sogenannten Varicosities. Nach Infektion eines neuronalen Explantatsystems mit dem Pseudorabiesvirus (PrV) konnten ultrastrukturell umhüllte Virionen in Vesikeln detektiert werden und so der Nachweis der Gültigkeit des „Married Model“ als vorherrschendes Transportmodell geführt werden. Dagegen ist die Situation beim prototypischen Alphaherpesvirus, dem Herpes Simplex Virus Typ 1 (HSV-1), weiterhin ungeklärt. Aufgrund der zahlreichen unterschiedlichen Analysemethoden und -systeme war ein direkter Vergleich der beiden Viren bislang nicht möglich. Daher sollte in dieser Arbeit ein standardisiertes neuronales Kultursystem genutzt werden, um vier verschiedene HSV-1 Stämme im Vergleich zu PrV zu untersuchen. Für die Infektionen wurden sowohl Neuronen aus dem oberen Cervikalganglion als auch aus Spinalganglien genutzt. So konnte gezeigt werden, dass in Neuronen, welche mit den HSV-1 Stämmen HFEM, 17+ und SC16 infiziert waren ca. 75% als umhüllte Virionen in Vesikeln und ca. 25% als nackte Kapside vorlagen. Ingesamt war die Anzahl der Viruspartikel in HSV-1 infizierten Neuronen signifikant geringer als in PrV infizierten Kulturen. Überraschenderweise zeigten mit HSV-1 KOS infizierte Neuronen ein reverses Bild. Hier lagen nur 25% der Viruspartikel als umhüllte Virionen in Vesikeln vor, während 75% als nackte Kapside detektiert wurden. Dieser unerwartete Phänotyp sollte auf molekularbiologischer Ebene genauer untersucht werden. Dabei wurde auf die Genregion von US9 fokussiert. Das von US9 codierte Membranprotein spielt eine wichtige Rolle während des Zusammenbaus der Virionen und bei anschließenden axonalen anterograden Transportvorgängen. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass das HSV-1 KOS Genom durch verschiedene Basenaustausche an der vorhergesagten TATA-Box von US9 eine Mutation aufweist. Zusätzlich trägt das offene Leseraster durch eine weitere Mutation ein vorzeitiges Stopcodon auf und wird dadurch auf 58 Kodons reduziert, im Gegensatz zu anderen HSV-1 Stämmen, wo es 91 Kodons umfasst. Die Mutation an der TATA-Box verändert auch das ursprüngliche Stopcodon vom US8a Gen, was zur einer Verlängerung von ursprünglich 161 zu 191 Kodons führt. In Northern Blot Analysen konnte eine reduzierte Transkription von US9 in HSV-1 KOS infizierten Zellen detektiert werden. In HSV-1 KOS infizierten Zellen konnten mittels eines spezifischen Antiserums gegen US9 im Western Blot kein Genprodukt nachgewiesen werden. Auch Immunfluoreszenzanalysen zeigten, dass das abgeleitete verkürzte Protein offenbar nicht stabil exprimiert wird. Dagegen konnten Western Blot Analysen die Vergrößerung des pUS8a bestätigen. Der beobachtete auffällige intraaxonale Phänotyp könnte somit durch die Mutation des US9 Protein erklärt werden. Zusammenfassend wurde in dieser Arbeit gezeigt, dass auch bei HSV-1 vorwiegend das „Married Model“ für den anterograden intraaxonalen Transportweg bevorzugt wird und somit beide Alphaherpesviren, HSV-1 und PrV, denselben Transportweg nutzen.

Nach dem Eintritt in den Wirtsorganismus und initialer Replikation infizieren Alphaherpesviren Neuronen zur weiteren Ausbreitung im Nervensystem und zur Etablierung einer Latenz. Dazu werden die Viruspartikel innerhalb der Axone retrograd von der Peripherie zum neuronalen Zellkörper transportiert. Die umgekehrte Richtung beschreibt den Weg des anterograden Transports vom Zellkörper zur Synapse für weitere Infektionen von Neuronen höherer Ordnung oder zurück zur Peripherie. Der retrograde intraaxonale Transport ist gut untersucht. Dagegen wird über den anterograden Transport kontrovers diskutiert. Zwei verschiedene Transportmodelle werden vermutet. Das „Married Model“ postuliert, dass umhüllte Virionen innerhalb von Vesikeln entlang des Axons transportiert werden. Die Freisetzung der Partikel erfolgt an der jeweiligen Synapse durch Endocytose. Das „Subassembly Model“ geht dagegen davon aus, dass einzelne Virusstrukurkomponenten (Nukleokapsid, Hülle) entlang des Axons transportiert werden. Der Zusammenbau und die Freisetzung erfolgt am Axonterminus bzw. an der Synapse (in vivo) oder am Wachstumskegel (in vitro) oder an speziellen Auftreibungen des Axons, den sogenannten Varicosities. Nach Infektion eines neuronalen Explantatsystems mit dem Pseudorabiesvirus (PrV) konnten ultrastrukturell umhüllte Virionen in Vesikeln detektiert werden und so der Nachweis der Gültigkeit des „Married Model“ als vorherrschendes Transportmodell geführt werden. Dagegen ist die Situation beim prototypischen Alphaherpesvirus, dem Herpes Simplex Virus Typ 1 (HSV-1), weiterhin ungeklärt. Aufgrund der zahlreichen unterschiedlichen Analysemethoden und -systeme war ein direkter Vergleich der beiden Viren bislang nicht möglich. Daher sollte in dieser Arbeit ein standardisiertes neuronales Kultursystem genutzt werden, um vier verschiedene HSV-1 Stämme im Vergleich zu PrV zu untersuchen. Für die Infektionen wurden sowohl Neuronen aus dem oberen Cervikalganglion als auch aus Spinalganglien genutzt. So konnte gezeigt werden, dass in Neuronen, welche mit den HSV-1 Stämmen HFEM, 17+ und SC16 infiziert waren ca. 75% als umhüllte Virionen in Vesikeln und ca. 25% als nackte Kapside vorlagen. Ingesamt war die Anzahl der Viruspartikel in HSV-1 infizierten Neuronen signifikant geringer als in PrV infizierten Kulturen. Überraschenderweise zeigten mit HSV-1 KOS infizierte Neuronen ein reverses Bild. Hier lagen nur 25% der Viruspartikel als umhüllte Virionen in Vesikeln vor, während 75% als nackte Kapside detektiert wurden. Dieser unerwartete Phänotyp sollte auf molekularbiologischer Ebene genauer untersucht werden. Dabei wurde auf die Genregion von US9 fokussiert. Das von US9 codierte Membranprotein spielt eine wichtige Rolle während des Zusammenbaus der Virionen und bei anschließenden axonalen anterograden Transportvorgängen. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass das HSV-1 KOS Genom durch verschiedene Basenaustausche an der vorhergesagten TATA-Box von US9 eine Mutation aufweist. Zusätzlich trägt das offene Leseraster durch eine weitere Mutation ein vorzeitiges Stopcodon auf und wird dadurch auf 58 Kodons reduziert, im Gegensatz zu anderen HSV-1 Stämmen, wo es 91 Kodons umfasst. Die Mutation an der TATA-Box verändert auch das ursprüngliche Stopcodon vom US8a Gen, was zur einer Verlängerung von ursprünglich 161 zu 191 Kodons führt. In Northern Blot Analysen konnte eine reduzierte Transkription von US9 in HSV-1 KOS infizierten Zellen detektiert werden. In HSV-1 KOS infizierten Zellen konnten mittels eines spezifischen Antiserums gegen US9 im Western Blot kein Genprodukt nachgewiesen werden. Auch Immunfluoreszenzanalysen zeigten, dass das abgeleitete verkürzte Protein offenbar nicht stabil exprimiert wird. Dagegen konnten Western Blot Analysen die Vergrößerung des pUS8a bestätigen. Der beobachtete auffällige intraaxonale Phänotyp könnte somit durch die Mutation des US9 Protein erklärt werden. Zusammenfassend wurde in dieser Arbeit gezeigt, dass auch bei HSV-1 vorwiegend das „Married Model“ für den anterograden intraaxonalen Transportweg bevorzugt wird und somit beide Alphaherpesviren, HSV-1 und PrV, denselben Transportweg nutzen.