: Giessen, Universität, Thesis (doctoral), 2000.

Proefschrift Maastricht. / Lit. opg. - Met een samenvatting in het Nederlands.

Die dieser Arbeit zugrundliegenden Untersuchungen am postmortalen Hirngewebe und an den korrespondierenden Proben postmortalen Liquor cerebrospinalis (CSF) konnten einen Zusammenhang der Dichte der parenchymalen TMEM119-positiven Mikroglia und der der CSF belegen. Innerhalb der analysierten Kompartimente bestehend aus Kortex, Marklager und CSF ergaben sich weit gefächerte Messwerte zur jeweiligen Dichte der immuno-positiven Mikroglia. Die Ergebnisse implizierten eine schnelle Reaktion der Mikroglia im Hirngewebe und einen zeitverzögerten Nachweis von immuno-positiven Mikroglia in der CSF. Signifikante Effekte von Alter, Geschlecht, Hirngewicht und insbesondere einem steigenden Postmortalintervall konnten als potenzielle Einflussfaktoren hinsichtlich der CSF-Intensität ausgeschlossen werden. Eine positive Korrelation ergab sich hingegen zwischen der Mikroglia-Dichte der CSF und den Angaben bezüglich erfolgter Reanimationsmaßnahmen der eingeschlossenen Sterbefälle als Hinweis auf einen relevanten Zusammenhang mit dem zerebralen Blutfluss. Neben dem ursprünglich angestrebten isolierten Vergleich zwischen der TMEM119-positiven Mikroglia-Profildichte der CSF, des Kortex und der des Markraums ergaben sich nach Analyse weiterhin morphologische Auffälligkeiten der identifizierten Mikroglia und teils spezifische Verteilungsmuster. Die abschnittsweise laminäre Anordnung der Zellen in den kortikalen Gewebeanteilen wies insbesondere in den supragranulären Schichten nahe der Hirnoberfläche strukturell auffällige Mikroglia-Profile mit annähernd rundem Zellkörper und wenigen bis keinen Zellfortsätzen auf. Ein annähernd identisches Bild konnte im perivaskulären Marklager festgestellt werden und wies auf einen Zusammenhang zum Übertritt der Mikroglia in die CSF sowie eine Assoziation zu den medullären Gefäßen hin. Der erstmalige Nachweis des aktiven Übertritts der TMEM119-positiven Mikroglia durch die weiche Hirnhaut implizierte einen aktiven Zugangsweg der Zellen in die CSF unter Ausbildung eines amöboid erscheinenden Phänotyps neben einem lediglich diffusen und passiven Übertritt der Zellen unter pathologischen Bedingungen. Die durchgeführten Untersuchungen belegen das enorme Potenzial der postmortalen CSF als Untersuchungsmedium insbesondere im Hinblick auf die Erhebung der Mikroglia-Dichte und die Analyse der Mikroglia-Morphologie in Bezug auf neuropathologische Beteiligung im ZNS und damit verbundenen Fragestellungen. / This study on postmortem brain tissue and the corresponding samples of postmortem cerebrospinal fluid (CSF) was able to demonstrate a correlation between the density of parenchymal TMEM119-positive microglia cell profiles and that of CSF. Within the analyzed cortex, medulla and CSF, there was a wide range of measured values for the respective density of immuno-positive microglia cell profiles. The results implied a rapid response of microglia in the brain tissue and a time-delayed detection of immuno-positive microglia in the CSF. Significant effects of age, gender, brain weight and especially an increasing postmortem interval could be excluded as potential influencing factors regarding CSF intensity. However, a positive correlation was found between the microglia density of the CSF and cardiopulmonary resuscitation measures performed in the included deaths as an indication of a relevant connection with cerebral blood flow. In addition to the originally intended comparison between the TMEM119-positive microglia cell profile density of the CSF, the cortex and the medulla, the analysis also revealed morphological abnormalities of the identified microglia and in some cases specific distribution patterns. The laminar arrangement of the cells in the cortical tissue showed structurally conspicuous microglia profiles with almost round cell bodies and few to no cell processes, especially in the supragranular layers near the brain surface. An almost identical impression was observed in the perivascular medullary layer and indicated a transition of the microglia into the CSF as well as an association with the medullary vessels. The first demonstration of the active crossing of TMEM119-positive microglia through the soft meninges implied an active access pathway of the cells into the CSF with the formation of an amoeboid phenotype in addition to a merely diffuse and passive passage of the cells under pathological conditions. The investigations demonstrate the enormous potential of postmortem CSF as an examination medium, particularly with regard to the analysis of microglia density and the analysis of microglia morphology in relation to neuropathological involvement in the CNS and related issues.

L’Ataxie de Friedreich (AF) est une pathologie à hérédité autosomique récessive caractérisée par des troubles neurologiques progressifs (atteinte des neurones cérébelleux et des neurones sensoriels primaires (PSN, Primary Sensory Neurons), une hypertrophie cardiaque et un risque élevé de diabète. La cause la plus fréquente de cette maladie est la présence d’une hyperexpansion homozygote de triplets nucléotidiques GAA au sein du premier intron du gène de la frataxine (FXN), qui code pour une petite protéine mitochondriale, la frataxine. Cette expansion GAA induit la formation de structures secondaires de l’ADN ainsi que la formation d’hétérochromatine, provoquant une diminution de la transcription du gène FXN. Plusieurs modèles cellulaires et animaux AF ont été développés sans toutefois reproduire l’ensemble des caractéristiques génétiques, épigénétiques et biochimiques de la maladie retrouvé chez le patient AF, à savoir la présence d’une hyperexpansion GAA, au sein du premier intron du gène FXN, accompagnée de la répression du gène FXN conduisant à la diminution de l’expression de la protéine frataxine. Dans la première partie du projet, nous avons généré deux modèles cellulaires, les cellules corticales et les neurones sensoriels primaires dérivés des cellules souches pluripotentes induites (iPSC), générées à partir de biopsies de peau de patients AF. Ces deux modèles cellulaires AF présentent les caractéristiques génétiques, épigénétiques et biochimiques décrites chez les patients AF. D’un point de vue biochimique, nous avons montré que le déficit en frataxine induit une perturbation de l’homéostasie du fer avec un déficit de la biosynthèse des centres [Fe-S] et de l’expression des protéines [Fe-S], qui jouent un rôle au sein de la chaine respiratoire mitochondriale et du cycle de Krebs. De plus, le déficit en frataxine entraine la perturbation des voies antioxydantes sensibilisant les cellules AF au stress oxydatif. Nous avons aussi montré que les cellules corticales AF présentent une sensibilité à l’apoptose pouvant être prévenu par un traitement par la forskoline. Enfin, nous avons étudié l’implication éventuelle de mTOR dans la pathogénèse de l’AF au sein des cellules corticales. Les résultats obtenus n’ont pas permis d’attribuer les désordres de l’homéostasie du fer et du métabolisme lipidique observés au sein des cellules corticales AF, au seul déséquilibre de mTORC1, mais sans doute à la déficience en frataxine elle-même. Ces données font de ces deux modèles cellulaires, dérivés des iPSC, des modèles fiables et robustes dans l’étude de l’AF. Dans la seconde partie du projet, nous avons étudié le potentiel effet thérapeutique d’analogues des incrétines ([D-Ala2]-GIP et exendin-4) et de deux générations d’inhibiteurs des HDAC (iHDAC 109 et iHDAC 69, 71 et 89) sur le niveau d’expression de la frataxine, l’homéostasie du fer, le métabolisme protéique et lipidique ainsi que le stress oxydatif, au sein des cellules corticales AF, des PSN AF et de deux modèles murins de l’AF (les souris Knock-In homozygotes (KIKI) et les souris BAC transgéniques). La nouvelle génération d’iHDAC (69, 71 et 89), se distingue du composé 109 par leur capacité supérieure à traverser la barrière hématoencéphalique et leur courte durée de vie prévenant ainsi l’accumulation du composé cardio-toxique au sein de l’organisme. Nous avons observé que l’ensemble des traitements testé dans ce projet, a eu pour effet d’augmenter l’expression de la frataxine et de restaurer l’homéostasie du fer au sein des cellules corticales AF. De la même façon, l’expression de la frataxine a été augmentée suite à l’administration du composé 109 au sein des PSN AF. De plus, nous avons mis en évidence un effet thérapeutique du composé 89 sur le stress oxydatif et le métabolisme lipidique et protéique, au sein des cellules corticales AF. Néanmoins, étant donné l’absence d’un phénotype biochimique de l’AF clair, au sein des deux modèles murins de l’AF utilisés dans cette étude, nous n’avons pas pu étendre l’efficacité des nouveaux iHDAC (69, 71 et 89) au sein de ces deux modèles murins de l’AF. Néanmoins, les résultats obtenus au sein des cellules corticales AF, sur l’induction de l’expression de la frataxine par des analogues des incrétines et par la nouvelle génération des iHDAC, font de ces molécules de nouvelles approches prometteuses dans l’intervention thérapeutique chez les patients AF. / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques (Médecine) / info:eu-repo/semantics/nonPublished

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Mon projet de thèse a été dédié à l’étude des synucléinopathies. Ces maladies neurodégénératives sont caractérisées par la présence d’inclusions intracytoplasmiques positives pour l’alpha-synucléine et contenues dans les neurones pour la maladie de Parkinson (i.e. les corps de Lewy) ou dans les oligodendrocytes pour l’atrophie multisystématisée (i.e. les inclusions cytoplasmiques oligodendrogliales). L’objectif de mon travail de thèse fut de proposer une approche multifactorielle et translationnelle en développant les aspects de modélisation, de mécanistiques et de thérapeutiques associées aux synucléinopathies. Nous nous sommes tout d’abord intéressés à disséquer les mécanismes sous-jacents à la neurodégénérescence induits par la protéine alpha-synucléine dans un modèle primate non-humain de la maladie de Parkinson. Nous avons ainsi souligné le rôle toxique de la protéine alpha-synucléine et mis en lumière de nouveaux processus cellulaires impliqués dans le phénomène de neurodégénérescence. Dans ce même modèle animal, nous avons étudié l’hypothèse d’une propagation de la pathologie induite par l’alpha-synucléine entre les systèmes nerveux centraux et périphériques. Nous avons ainsi pu démontrer l’existence d’une route bidirectionnelle de propagation et de neurodégénérescence de la protéine entre les deux systèmes nerveux, pouvant corroborer la présence de symptômes non moteurs précoces au cours de la pathologie. Enfin, nous nous sommes concentrés sur le rétablissement de la fonction autophagique comme cible thérapeutique commune aux synucléinopathies. Nous avons ainsi pu démontrer qu’une restauration de la machinerie de dégradation de la voie autophagie était suffisante pour rétablir les taux physiologiques de la protéine alpha-synucléine et induire une neuroprotection dans un modèle rongeur de la maladie de Parkinson et d’atrophie multi-systématisée. Ces travaux corroborent le rôle clé de la protéine alpha-synucléine dans l’étiologie des synucléinopathies et proposent de nouvelles stratégies thérapeutiques communes à toutes les synucléinopathies afin de rétablir les niveaux physiologiques cellulaires de la protéine et une neuroprotection au sein du système nerveux central. / My thesis project was dedicated to the study of synucleinopathies. Synucleinopathies are neurodegenerative diseases characterized by the presence of alpha-synuclein positive intracytoplasmic inclusions which are present either in neurons for Parkinson’s disease (i.e. Lewy Bodies) or in oligodendrocytes for Multiple system atrophy (i.e. Glial Cytoplasmic Inclusions). The aim of my work was to establish a multifactorial and translational approach through modeling, mechanistic and therapeutic aspects associated with synucleinopathies. First, we focused on dissecting the underlying alpha-synuclein-mediated mechanisms of neurodegeneration using a non-human primate model of Parkinson’s disease. We confirmed the toxic role of alpha-synuclein in the pathology and highlighted unpredictable cellular processes involved in neurodegeneration. Using the same Parkinson’s disease model, we studied the hypothesis of a pathological propagation between the central and peripheric nervous systems in an attempt to decipher the initiation point and the direction of propagation of the associated pathology. We thus demonstrated a bidirectional route of propagation of alpha-synuclein between the CNS and the ENS and within the ENS. Finally, we focused on the restoration of the autophagic function as a potential common therapeutic target for all synucleinopathies. We demonstrated through a gene-based restoration of the autophagy, we efficiently reestablish alpha-synuclein physiological protein levels, while inducing neuroprotection in a Parkinson’s disease and Multiple system atrophy rodent models. Thus, this work corroborates the key role of alpha-synuclein in the etiology of synucleinopathy and offers new common therapeutic strategies for all synucleinopathies to decrease alpha-synuclein-induced toxicity into the central nervous system.

Le cytosquelette des neurones matures est majoritairement composé de Neurofilaments. Ils sont nécessaires à la mise en place et au maintien de l'axone. Parmi les trois sous unités qui composent le neurofilament, celle de haut poids moléculaire (NFH) apparaît le plus tardivement lors de la différentiation de la synapse et sa fonction précise est mal connue. Une perturbation du métabolisme des Neurofilaments (à l'échelon de la protéine et/ou du gène) est impliquée dans certaines pathologies du système nerveux. Dans les maladies neurodégénératives, en particulier dans la Sclérose Latérale Amyotophique (SLA) ou dans des neuropathies périphériques, l'agrégation de NFs dans le corps cellulaire et dans l'axone, avec perturbation du flux axonal, est un événement fondamental. Nous avons développé un outil cellulaire et moléculaire, utilisant une protéine de fusion NFHGFP, permettant, grâce à un fluorochrome (eGFP), de suivre le métabolisme de NFH. En culture de cellules ou chez des souris transgéniques, l'expression de cette protéine de fusion ne modifie pas leur fonctionnement ni leur comportement en présence notamment de drogues susceptibles d'entraîner leur agrégation. L'utilisation de cet outil, en particulier en association avec l'expression de la protéine NFHLacZ, ouvre la voie pour de nouvelles études en situation physiologique et pathologique : différentiation neuronale, interactions intracellulaires et axonomyéliniques, études de neurotoxicité... Les travaux présentés portent également sur les mécanismes de régulation intragénique de NFH. Nous avons montré que, comme pour les deux autres sous unités (NFL et NFM), les séquences introniques, en particulier le second intron, permettaient de contrôler dans le temps et dans l'espace l'expression d'un rapporteur. Dans un objectif de transposition des résultats de la recherche fondamentale et expérimentale à la recherche clinique, nous avons démontré qu'une protéine initialement décrite comme associée aux microtubules (STOP) était également associée aux neurofilaments dans les tissus humains normaux et pathologiques (SLA). Enfin nous avons pu établir que le profil d'expression de la tubuline et des Neurofilaments dans des neuropathies périphériques de cause indéterminée reproduisait celui de la croissance axonale, et qu'une régénération inefficace pouvait également être à l'origine de certaines neuropathies.

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Idiopathische Myositiden stellen die größte Gruppe der erworbenen Myopathien im Erwachsenenalter dar. Die Pathogenese dieser Erkrankungen ist sehr heterogen und nicht in allen Einzelheiten geklärt. Das Auftreten von mitochondrialen Veränderungen und mtDNADeletionen in idiopathischen Myositiden und deren pathophysiologische Bedeutung ist in der Literatur ein kontrovers diskutiertes Thema. Nach der Präsentation des bekannten Wissens über diese Erkrankungen wird in vorliegender Arbeit dieses Thema anhand lichtmikroskopischer Methoden unter Anwendung histologischer Spezialmethoden an Muskelbiopsien von 98 Patienten untersucht. Ziel der Arbeit ist es, mit verschiedenen histologischen Färbemethoden Hinweise für Mitochondrien-Alterationen und feinstrukturelle Charakteristika von primären Mitochondrialen Myopathien in idiopathischen Myositiden zu detektieren. Ein besonderer Schwerpunkt liegt auf der Anwendung einer neuen immunhistochemischen Methode unter Anwendung eines monoklonalen antimitochondrialen Antikörpers. Es wird der Fall eines Mädchens mit muskeldystrophischer Symptomatik dargestellt, dessen Muskelbiopsie im Alter von 7 Jahren die myohistologische Diagnose einer juvenilen Dermatomyositis und Hinweise auf eine mitochondriale Dysfunktion ergab. Die Ergebnisse der immunhistochemischen Methode korrelieren gut mit anderen bekannten mitochondrialen Färbungen, sind sensitiver und stellen möglicherweise eine gute Ergänzung zu den bekannten mitochondrialen Markern und Färbungen dar. Die beobachteten mitochondrialen Dysfunktionen sprechen für die gestörte Mitochondrienfunktion und eine früh im Krankheitsverlauf, am ehesten sekundäre, Beteiligung der Mitochondrien im Krankheitsprozess dieser primär nicht mitochondrialen Erkrankungen

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