Tesi realitzada a l'Institut d'Investigació Biomèdica de Bellvitge (IDIBELL) / La adenosina es un metabolito presente en todo el organismo con distintas funciones fisiológicas. En el sistema nervioso central, desempeña un importante papel como neuromodulador a través de la interacción con sus receptores de membrana: los receptores de adenosina A(1), A(2A), A(2B) y A(3), siendo los más abundantes en el cerebro el A(1 )y el A(2A). El receptor de adenosina A(2A) (A(2A)R) presenta una elevada expresión en el estriado, especialmente en las neuronas GABAérgicas medianas espinosas que conforman la vía indirecta de los ganglios basales. La actividad de esta vía está relacionada con la inhibición motora. La actividad del A(2A)R puede modular de hecho la actividad motora. Es bien conocido cómo, tanto en modelos animales como en humanos, los antagonistas del receptor, como la cafeína, estimulan el movimiento, mientras que sus agonistas tienen actividad sedante. Las tres enfermedades abordadas en este trabajo han sido previamente relacionadas con alteraciones del sistema adenosinérgico. En la enfermedad de Parkinson, coincidiendo con una sintomatología hipocinética, se ha descrito una sobreexpresión patológica del A(2A)R en el estriado. La reducción de los niveles del receptor ha sido descrita en la misma región cerebral en el contexto de la enfermedad de Huntington, en la que se da una sintomatología hipercinética. La esquizofrenia, a su vez, ha sido relacionada con una disfunción de los ganglios basales y un déficit en la señalización adenosinérgica. La línea de investigación en la que se enmarca este trabajo había determinado previamente cómo la expresión tejido específica del A(2A)R en el cerebro está controlada por la metilación de la región 5'UTR de su gen, ADORA2A. A lo largo de la presente tesis se ha investigado si éste u otros mecanismos epigenéticos están implicados en la aparición de niveles anómalos del receptor en las enfermedades de Parkinson y Huntington. Además, se han explorado los niveles de expresión del receptor en el estriado en personas con esquizofrenia. Para todo ello se ha trabajado fundamentalmente con muestras de putamen postmortem, una de las regiones del estriado que ha sido vinculada más estrechamente con el control motor. Este trabajo ha permitido confirmar que la sobreexpresión patológica del A2A en el estriado en la enfermedad de Parkinson se produce ya en los primeros estadios de la enfermedad (estadios de Braak 1 a 3), coincidiendo con una bajada de los niveles del microARN hsa-miR-34b. El descenso en los niveles de este microARN había sido previamente descrito en cerebros postmortem de personas con Parkinson pero en otras regiones cerebrales, relacionándolo con estrés mitocondrial. En este trabajo se ha validado el A(2A)R como diana para este microARN mediante ensayos funcionales in vitro, por lo que se propone que el descenso del hsa-miR-34b promueve un aumento de los niveles del A(2A)R en el putamen desde las primeras etapas de la progresión patológica. En cuanto a los resultados en la enfermedad de Huntington, se ha mostrado cómo la reducción de la expresión del A(2A)R en el estriado humano coincide con un incremento en los niveles de metilación y una reducción en los niveles de hidroximetilación de la región 5'UTR del ADORA2A. El estudio llevado a cabo en la esquizofrenia ha revelado un importante descenso de la expresión del A(2A)R en la mitad de los casos patológicos analizados, coincidiendo con hipermetilación de la región 5'UTR del ADORA2A. Estos casos presentan además una sintomatología motora particular, lo que ha permitido proponer la existencia de un subgrupo de pacientes en esta enfermedad. Esto resultados ofrecen soporte a ciertas estrategias terapéuticas propuestas para estas enfermedades y basadas en la modulación de la actividad o de la expresión del A(2A)R. Indican además un uso potencial para la medida de los niveles del A(2A)R en los pacientes con trastorno motor. Esta información permitiría una mayor personalización de los tratamientos y una mejora en la interpretación de las respuestas individuales a los fármacos. / Adenosine is a metabolite distributed throughout the entire organism with multiple physiological functions. In the central nervous system it plays a main role as neuromodulator, interacting with specific membrane receptors: A(1), A(2A), A(2B) and A(3). The most brain-enriched are A1 and A2A. Adenosine receptor A(2A) (A(2A)R) is highly expressed in the striatum, specially in the GABAergic medium-sized spiny neurons that form the indirect pathway of the basal ganglia, whose activity has been related with motor inhibition. There is evidence for A(2A)R activity involvement in motor behavior: A(2A)R antagonists, as caffeine, stimulate locomotion, while A(2A)R agonists are sedative. The three diseases studied in this work have previously been related to adenosinergic system dysfunction. In Parkinson's disease, characterized by hypokinesia, a pathological overexpression of striatal A(2A)R has been described. In Huntington's disease, characterized by hyperkinesia, striatal A(2A)R expression is reduced. Schizophrenia has been related to basal ganglia dysfunction and reduced adenosinergic signaling. In previous studies, the group described how DNA methylation regulates ADORA2A (A(2A)R gen) basal expression in different cell lines as well as its tissue-specific expression in brain. In the present thesis, it was studied whether this or other epigenetic mechanisms were involved in A(2A)R pathological expression levels detected in Parkinson or Huntington diseases. Besides, A(2A)R levels were analyzed in striatum of schizophrenia patients. The work has been performed mainly using human postmortem putamen samples, a striatal region strongly related to motor control. Overall, the obtained results (i) reinforce the relation between A(2A)R striatal expression and motor control, (ii) demonstrate involvement of epigenetic mechanisms in pathological A(2A)R expression in different neuropathological contexts and (iii) support therapeutic strategies previously proposed based on the modulation of A(2A)R expression, and indicate potential usefulness of A(2A)R levels measure in patients with motor alterations, considering that this information would allow a better personalization of treatments and a better understanding of individual reactions to drugs.

Programa de doctorat: Organogénesis y anatomía clínica y aplicada. Departament de Ciències Morfològiques i Odontoestomatología, 1995-1997 / El objetivo de la tesis era encontrar una forma de calcular la selectividad para reinervar las mismas dianas proximales o distales por parte de la población neuronal original tras una lesión nerviosa periférica. Por un lado, se podría detectar la alteración del patrón de distribución de las neuronas que inervan las zonas de estudio después de la regeneración. Otro método podría contemplar el doble marcaje con trazadores fluorescentes que permitiesen marcar la población neuronal original con un trazador y la población regenerante con otro, para buscar coincidencias. El estudio de las neuronas sensitivas de los principales nervios de la extremidad posterior (femoral y ciático) demostró una organización somatotópica de las células, en particular en el ganglio L4, donde ambos nervios coinciden. Allí, el nervio femoral se distribuye dorsal y rostralmente, mientras que el ciático ocupa el resto del ganglio. Sin embargo, las neuronas que inervaban las áreas más distales, las falanges distales de los dedos de los pies, se hallaban distribuidas difusamente en los ganglios L3-L6, si bien presentaban también una organización rostrocaudal, de forma que en los ganglios más rostrales se hallaban más representados los dedos mediales y caudalmente los más laterales. La resección del nervio ciático combinada con la inyección posterior de trazador en los dedos permitió detectar la permanencia de marcaje neuronal en los ganglios lumbares L3 y L4, que se eliminaba al añadir la resección del nervio femoral. Sin embargo, permanecía marcaje en L5 y L6 que no desapareció hasta la resección del aquí descrito nervio musculocutáneo. Por tanto, estos tres nervios participaban en la inervación de los dedos de los pies. En animales control, Fast blue (FB), diamidino yellow (DY) y fluoro-gold (FG) marcaban un número similar de neuronas al inyectarlos subcutáneamente, alcanzando cifras del 75-85% de doble marcaje. Al aplicar una cápsula de DY, seguida de otra con FB en el extremo seccionado del nervio ciático, se alcanzaba un 97% de doble marcaje. La inyección de DY seguida inmediatamente o meses más tarde de una cápsula de FB también conseguía la práctica totalidad de doble marcaje de las células, mientras que el porcentaje se reducía al 10% en caso de aplicar primero el FB. Al aplicarlos en nervios regenerantes el FB actuaba con igual eficacia tanto si se aplicaba en nervios inicialmente marcados con DY o sin marcaje previo. Asimismo, otros experimentos demostraron que una pequeña proporción del trazador que se aplica en una zona al principio del estudio puede ser captado de nuevo meses más tarde por axones regenerantes, ya sean pertenecientes a la población original o bien desviados a la zona de estudio. Si los axones desviados captan también el segundo trazador, sus somas estarán doble marcados, al igual que la población original, confundiendo su identificación. El estudio de la sección y reparación del nervio ciático demostró una gran selectividad por parte de las neuronas originales en la reinervación del nervio tibialis (en un 80-90%), en la primera bifurcación del nervio ciático, pero significativamente inferior en los dedos de los pies (del orden del 22-56%), con una limitada colateralización del 1-2% por parte de los nervios femoral y musculocutáneo. / Our aim was to quantify the selective reinnervation of proximal and distal targets by their original neuronal population after a peripheral nerve injury, by detecting alterations in the neuronal arrangement after the regeneration or by labelling the original population with one tracer and the regenerating population with another to detect double labelled cells. When labelling the femoral and the sciatic nerves, a somatotopical arrangement was found in L4 dorsal root ganglion (DRG) where the femoral is distributed dorsally, rostrally and laterally while the sciatic occupies the rest of the ganglion. However, neurones innervating the toes showed a diffuse rostrocaudal organization in L3-L6 DRG: rostral ganglia showed more neurones from medial toes and caudal ganglia from lateral toes. After the ressection of the sciatic nerve, combined with tracer injections in the toes, labelling was seen in all DRG L3-L6. L3 and L4 labelling disappeared after adding the ressection of the femoral nerve while labelling in L5-L6 disappeared after adding also the ressection of the so called musculocutaneous nerve, suggesting the participation of all those nerves in the toe innervation. In control animals, fast blue (FB), diamidino yellow (DY) and fluoro-gold (FG) labelled a similar number of neurones after subcutaneous injections, reaching double labelling rates of 75-85%. With successive application of capsules with DY and FB in sciatic nerve, a 97% of double labelling was obtained. The tibialis nerve injection of DY followed by a capsule application of FB lead also to more than 90% of double labelling. When applying tracers to regenerating nerves, FB labelled the same number of cells when applied alone or in a previous DY labelled nerve. Other experiments demonstrated that part of the tracer that is injected subcutaneously or in nerve branches remains available to be uptaken by new regenerating axons (misdirected or not), confusing the iddentification of the original population. After sciatic nerve injury, there was a high selective reinnervation of the tibialis nerve (80-89%), at the main bifurcation of the sciatic nerve, but a reduced selectivity in distal areas (22-56% in the toes), with a limited collateralization (1-2%) of adjacent femoral and musculocutaneous nerves.

Tesi realitzada a l'Institut Clínic de Neurociències / Hospital Clínic / 1) Introduction Cannabis use has been associated to mental health problems and worsened outcome of established psychiatric disorders. Disturbances of the endocannabinoid system may be responsible for long-lasting effects, such as neuropsychological deficits and morphological brain alterations. As not all the exposed individuals are equally affected, proneness to cannabis induced impairment may rely on key factors such as age of onset, cannabis use parameters and genetic background. The aim of the present thesis is to expand current knowledge of the effects of cannabinoids, while assessing gene-environment interactions that are relevant for psychiatric disorders, based on the following hypothesis: - Cannabis use in first-episode psychosis would be associated with worse outcome regarding readmission rates (Chapter 3). - Acute and chronic cannabis use would be associated with alterations on brain function and structure in key areas relevant for psychiatric disorders (Chapters 4-5). - Early-onset chronic cannabis users would show morphological brain alterations compared to non-using controls, and variation in the dopamine-regulating genes would result in diverse liability to experience cannabis-related brain impairment (Chapters 6-7). 2) Methods We assessed a cohort of 58 first-episode psychosis patients. The main outcome was the time until first readmission. All subjects were interviewed using the Structured Clinical Interview SCIO-I, the Positive and Negative Syndrome Scale (PANSS) and the Dartmouth Assessment of Lifestyle Inventory (DALI) scale. The subjects also underwent blood and urine sampling for drug use (Chapter 3). In addition, we conducted two systematic literature reviews in accordance with PRISMA guidelines. Chapter 4 included 43 neuroimaging studies of experimental administration of cannabinoids involving animals naive to cannabinoids and naive/occasional cannabis users. Chapter 5 considered 4S neuroimaging studies involving chronic cannabis users with a matched control group. Finally, we performed a case-control study in male Caucasians, 30 early-onset chronic cannabis users and 29 age-, education- and intelligence-matched non-using controls. All subjects were assessed by a structured interview (PRISM). Catechol-a-methyltransferase (COMT Val(158)Met] and dopamine transporter (DATI-VNTR) genotyping were performed. MRI data was analysed by VBM (Chapter 6) and manual tracing of the hippocampus via well-validated methods (Chapter 7). 3) Results Cannabis was the most common drug found in the first-episode psychosis cohort, either in urinalysis (38%) or self-reported (50%). Both the DALI cannabis/cocaine subscale (p=0.002) and urinalysis for cannabis (p=0.02) were associated with increased readmission risk in survival curves. The DALI cannabis/cocaine subscale at baseline was a significant predictor of readmission over the study period (HR = 4.5: 95% CI = 1.1 to 18.7; p=0.036) after controlling for potential confounders (Chapter 3). Studies included in Chapter 4 showed that acute administration of cannabinoids modulate resting state activity and alter neural activity during performance of several cognitive tasks in areas related with reward and psychiatric disorders. Chapter 5 indicated that chronic cannabis use is associated with alterations in brain function and structure, particularly in medial temporal regions. In the case-control study, chronic cannabis users showed morphologic brain alterations that were differently influenced by the COMT and DATI genotypes compared to controls. Variation in the COMT genotype affected the bilateral ventral caudate nucleus and left amygdala in both groups in an opposite direction (Chapter 6). Chapter 7 expanded these results by showing that COMT and DATI genes interacted with each other moderating individual differences also in the hippocampal volume. 4) Conclusion Together, these results proVide support for endocannabinoid Involvement in the outcome of psychiatric disorders, as well as in the control of different cognitive functions, dopamine release and brain volume. Findings also provide evidence that dopamine-regulating genes may playa particular role in the sensitivity to the effects of cannabis on brain morphology, providing further insights into the mechanisms of cannabis-related brain impairment and genetic vulnerability. / L'ús de cànnabis pot comportar l'aparició de trastorns mentals i un pitjor curs dels trastorns psiquiàtrics establerts. Alteracions del sistema endocannabinoid endogen podrien ser responsables també dels efectes a llarg termini associats amb el consum d'aquesta substància, com son les alteracions en la funció i estructura cerebral. Donat que no tots els individus es veuen igualment afectats, la probabilitat de patir danys associats al consum de cànnabis podria recaure en diversos factors clau, com són l'edat d'inici, els paràmetres de consum i aspectes relacionats amb la vulnerabilitat genètica individual. Aquesta tesi té com a objectiu eixamplar el coneixement actual sobre els efectes aguts i crònics dels cannabinoids, tot avaluant interaccions gen-ambient que són rellevants pels trastorns psiquiàtrics. Aquest objectiu s'assoleix a través de l'estudi de les conseqüències de l'ús de drogues d'abus en una cohort de primers episodis psicòtics (Capítol 3): dues revisions sistemàtiques de la literatura que inclouen estudis de neuroimatge sobre l'administració experimental de cannabinoids en animals no tractats prèviament i consumidors puntuals/ocasionals de cànnabis (Capítol 4), i estudis de neuroimatge funcional i estructural en consumidors crònics de cànnabis i un grup control aparellat (Capítol 5); i posteriorment per mitjà d'Un estudi cas-control sobre la influència dels gens reguladors de la dopamina ((catecol-O-metiltransferasa (COMT) Ya11S8Met) i transportador de la dopamina (DAT1•YNTR)] en l'estructura cerebral de consumidors crònics de cànnabis d'inici temprà comparats amb controls sans aparellats no consumidors. En conjunt, els resultats presentats en aquesta tesi donen suport a la participació del sistema endocannabinoid en el curs dels trastorns mentals, aixf com en el control de diverses funcions cognitives, modulació de dopamina i volum cerebral. Els resultats també demostren que els gens reguladors de la dopamina poden tenir un paper rellevant en la sensibilitat als efectes del cànnabis en la morfologia cerebral, proporcionant nous coneixements sobre el mecanismes subjacents al dany cerebral induït per cànnabis i sobre aspectes de vulnerabilitat genètica.

pendent

Treball realitzat a l’Hospital Sant Joan de Déu - Esplugues de Llobregat / Barcelona / En el sistema nerviós central (SNC) la dopamina es comporta com la catecolamina prototip controlant el moviment i l’estat de motivació de l’individu, així com l’alliberació de prolactina. L’objectiu principal d’aquesta tesi doctoral ha estat estudiar la utilitat de tres biomarcadors relacionats amb el metabolisme de la dopamina (àcid homovaníl•lic, les pterines i el piridoxal fosfat) com a eines pel diagnòstic i la investigació de malalties neurològiques en la infància. La tesi ha estat estructurada en tres objectius, i per tant en tres treballs. En el primer treball, es va avaluar la utilitat de l’àcid homovaníl•lic, el metabòlit principal i més estable de la dopamina, per estudiar l’estat dopaminèrgic. El seu ús com a biomarcador en el líquid cefaloraquidi (LCR) ens ha permès diagnosticar varis errors congènits del metabolisme en els últims anys. No obstant això, la necessitat d’aquest estudi va originar-se pel fet que hi ha molts pacients amb simptomatologia de deficiència dopaminèrgica que romanen sense un diagnòstic definitiu confirmat. La descripció d’aquests pacients des d’un punt de vista bioquímic, buscant associacions amb les característiques clíniques, radiològiques i electrofisiològiques ens ha permès millorar el coneixement científic respecte aquest marcador bioquímic en l’àmbit neuropediàtric. Seguint en l’avaluació del metabolisme de la dopamina, cal remarcar el paper essencial que tenen els cofactors tetrahidrobiopterina i vitamina B6 en el metabolisme dopaminèrgic. Les alteracions quantitatives d’aquests cofactors també poden provocar deficiències en la via dopaminèrgica i, per tant, també tenen un important valor a la hora d’estudiar aquests pacients. D’altra banda, s’ha demostrat el paper que té la neopterina (metabòlit de la tetrahidrobiopterina) com a marcador bioquímic en LCR en el diagnòstic de processos immuno-inflamatoris del SNC. D’aquí neix el plantejament del segon treball, la finalitat del qual és estudiar les pterines (neopterina i biopterina) com a eina d’ajut en pacients neurològics sense un diagnòstic confirmat però que presenten alteracions en el valor de pterines en LCR. Alteracions que poden estar associades a malalties genètiques d’aquest cofactor o bé causades per processos immuno-inflamatoris. Finalment l’últim treball es basa en la utilitat de quantificar els valors del cofactor que participa en l´últim pas de la síntesi dopaminèrgica, el piridoxal fosfat (la forma activa de la vitamina B6). Les seves deficiències poden provocar trastorns marcats de la síntesis de dopamina, però també d’altres metabòlits, com aminoàcids o l’àcid gamma-aminobutíric. Clínicament, aquests pacients presenten greus alteracions neurològiques sent l’epilèpsia refractària als anticonvulsivants habituals, la simptomatologia més freqüent. La necessitat d’aquest treball esdevé en què hi ha varis pacients que presenten deficiències de piridoxal fosfat els quals han respòs favorablement a suplements de vitamina B6. Els diferents estudis que s’han presentat en aquesta tesi s’han realitzat en pacients procedents del Hospital Sant Joan de Déu, però també d’altres hospitals nacionals i internacionals, entre els quals n’hi ha de Portugal, Argentina, Grècia, Turquia i la Índia. La col•laboració amb altres serveis del nostre hospital ha donat un component traslacional als tres treballs presentats en aquesta tesi, que inclouen dades clíniques, bioquímiques i moleculars, aportant un aspecte més holístic i tenint una aplicació pràctica i valuosa per l’estudi de pacients amb malalties neuropediàtriques greus. / Our objective was to study the utility of three biomarkers related to dopamine metabolism (homovanillic acid (HVA), pterins and pyridoxal phosphate (PLP)) as a diagnostic and investigation tool of neurologic disorders in infancy. In the first study our objective was to determine and assess the HVA concentrations in cerebrospinal fluid (CSF) in a large neuropediatric cohort as a biochemical tool to identify dopaminergic abnormalities. To achieve this aim, we studied biogenic amines in 1388 CSF samples from children with neurological disorders analysed by high pressure liquid chromatography with electrochemical detector. This study allowed us to determine the prevalence of dopaminergic abnormalities, as well as we defined several neurologic diseases with CSF HVA abnormalities, besides from 21 primary dopaminergic defects. In the second study, our objective was to analyse the CSF pterins (neopterin and biopterin) concentrations in children with neurologic disorders to identify primary or secondary diseases about these coenzymes. We also evaluated the CSF neopterin utility as a biomarker in inflammatory-immune mediated processes establishing a new cut-off for it. After that, the next step was to assess data from 606 neuropediatric patients presenting CSF neopterin values above or below the new established cut-off value. Finally, our last study was to analyse the CSF PLP concentrations in neuropediatric patients without an aetiological diagnosis in order to identify primary or secondary diseases related to PLP metabolism. After the analyses of PLP in CSF of 147 patients, we detected our first PNPO gene defect. Moreover, we recruited a series of 10 patients who disclosed low-normal CSF PLP values, that the main clinical feature was epilepsy. Additionally we also assessed the response to PLP treatment in all of them. These different studies have been performed in patients from Hospital Sant Joan de Déu, as well as from other national and international hospitals, such as Portugal, Argentina, Greece, Turkey and India. Moreover, the collaboration with other services of our hospital has allowed this thesis to have a holistic component including clinical, radiological, biochemical and molecular data.

La enfermedad de Alzheimer (EA) es una patología neurodegenerativa devastadora. Es la principal causa de demencia en las sociedades occidentales y actualmente no tiene cura. Sus síntomas no son evidentes hasta estados muy avanzados y su origen sigue siendo desconocido. Aunque se acepta que es una enfermedad multigénica, han sido pocos los genes asociados a la enfermedad y, conjuntamente, sólo pueden explicar un pequeño porcentaje de los casos. Se estima que cerca de 34 millones de personas están afectadas por la patología en todo el mundo y que esta cifra se duplicará en los próximos 20 años. Por lo que son necesarios más esfuerzos para identificar las causas que conducen a la aparición de esta patología. En los últimos años la epigenética se ha mostrado como un mecanismo crucial en el funcionamiento del sistema nervioso y participa en la cognición, el aprendizaje y en la formación de la memoria. Muchas enfermedades neurológicas están causadas por mutaciones en la maquinaria epigenética y cada vez más indicios sugieren su importancia en muchas otras. La EA no es una excepción y los primeros estudios están empezando a identificar ya nuevos genes epigenéticamente alterados en la EA. Conscientes de la importancia de la epigenética en el funcionamiento del sistema nervioso, el trabajo presentado en esta tesis ha pretendido profundizar en las causas de la EA desde un punto de vista epigenético. Para ello, hemos desarrollado nuevas herramientas de análisis epigenómico. Hemos determinado los patrones de metilación del cerebro de ratón y hemos identificado un subgrupo de genes alterados en modelos murinos y muestras post-mortem de EA. Además, hemos identificado genes epigenéticamente alterados desde las primeras fases de la enfermedad y hemos demostrado las consecuencias funcionales de dichas alteraciones. En conjunto, los resultados presentados en esta tesis no sólo ponen de relieve la importancia de los cambios epigenéticos en la aparición y progresión de la EA sino que, además, ofrecen nuevas vías de diagnóstico y tratamiento reforzando la necesidad de incidir en esta vía de investigación que está empezando a ofrecer nuevas perspectivas para una enfermedad que actualmente no tiene cura. / Alzheimer's disease (AD) is a devastating neurodegenerative disorder. It is the main cause of dementia in Western societies and currently has no cure. Symptoms only appear in late stages and it origin remains unknown. Although it is accepted that AD is a multigenic disease, few genes have been associated with these disease and, together, they only explain a small percentage of cases. It is estimated that around 34 million of people in the world is affected by AD and that this number will double in next 20 years. As consequence, more efforts are necessary to identify the causes of the disease. In recent years, epigenetics has demonstrated to be crucial in nervous system and it is involved in cognition, learning and memory formation. Many neurological diseases are caused by mutations in the epigenetic machinery and many others are associated with epigenetic alterations. AD is not an exception and pioneer studies are starting to identify new genes epigenetically altered in these disease. Due to the importance of epigenetics in nervous system, the work presented in this thesis aims to get insight of the causes of AD from an epigenetic perspective. To this end, we have developed new tools of epigenomic analysis, determined methylation patterns of mouse brain and described a subset of genes epigenetically altered in mouse models and post-mortem samples of AD. In addition, we have identified genes epigenetically altered from the earliest stages of the disease and demonstrated the functional consequences of these alterations. In sum, the results presented in this thesis not only highlight the importance of epigenetic changes in the onset and progression of AD but also offer new avenues of diagnosis and treatments reinforcing the necessity of get deeper in this line of research that is already starting to provide a new perspectives for a disease that currently has no cure.

Tesi realitzada al Departament de Neuroquímica i Neurofarmacologia, Institut d’Investigacions Biomèdiques de Barcelona (IIBB), CSIC, IDIBAPS / Els antagonistes no competitius del receptor N-metil-D-aspartat (R-NMDA) com la fenciclidina (PCP) són utilitzats com a model farmacològic d'esquizofrènia atès que tenen propietats psicotomimètiques quan s'administren en individus sans i perquè empitjoren els símptomes en pacients esquizofrènics. Estudis previs del nostre laboratori mostren com la PCP provoca, en l’escorça prefrontal medial (EPFm) de rata anestesiada, un augment de l’activitat de les neurones piramidals juntament amb una disminució de l'activitat oscil•latòria de baixa freqüència (OBF; <4 Hz). Aquestes alteracions són revertides pels antipsicòtics haloperidol i clozapina. Així mateix, la PCP incrementa l'expressió del gen c-fos (indicador d'activitat neuronal) en neurones piramidals corticals i en neurones dels nuclis centromedial (CM) i mediodorsal (MD) del tàlem (connectats recíprocament amb l’EPFm), però no en les neurones GABAèrgiques del nucli reticular del tàlem (NRT), que controlen la resta dels nuclis talàmics. Aquest fet suggereix que les neurones de l’NRT podrien ser més sensibles als efectes de la PCP que altres tipus neuronals, el què ens fa pensar que l'efecte psicotomimètic de la PCP podria estar relacionat amb canvis en l'activitat d'aquest nucli, la qual cosa es traduiria en una desinhibició dels circuits talamocorticals. En aquest context , els objectius plantejats han sigut: 1. Estudiar la possible participació dels nuclis talàmics CM i MD en els efectes induïts per l’antagonista dels R-NMDA PCP sobre l’activitat cortical i la seva possible reversió per l’antipsicòtic clozapina. 2. Estudiar la possible acció preferencial de la PCP sobre l’activitat de les neurones de l’NRT. 3. Validar la reversió dels efectes induïts per la PCP sobre les OBF corticals com a marcador de capacitat antipsicòtica per al cribratge de nous fàrmacs i estudiar la implicació dels sistemes glutamatèrgic i GABAèrgic en aquest mateix model. Per dur a terme aquests objectius s’han utilitzat tècniques electrofisiològiques, concretament registres unitaris i de potencial de camp en rata anestesiada. Els resultats mostren com, en conjunt, la PCP augmenta l’activitat de les neurones talàmiques dels nuclis CM i MD i disminueix les OBF en aquesta mateixa àrea. La subsegüent administració de clozapina reverteix aquests efectes. Aquests resultats suggereixen que la PCP bloqueja principalment els R-NMDA de neurones GABAèrgiques de l’NRT i/o d’altres àrees aferents al tàlem, desinhibit neurones talamocorticals i, per tant, augmentant el to cap a l’EPF. Els resultats obtinguts dels registres a l’NRT mostren com efectivament les seves neurones s'inhibeixen després de l'administració de la PCP juntament amb una disminució de les OBF en aquest mateix nucli, de forma paral•lela a l’EPFm. La posterior injecció de clozapina no reverteix aquests efectes a l’NRT sinó que inhibeix encara més els efectes sobre la descàrrega neuronal. En resum, l'acció psicotomimètica de la PCP probablement sigui produïda per una hiperactivitat talamocortical causada per una desinhibició de l’NRT, mentre que l'acció de la clozapina involucraria una atenuació d'aquesta hiperactivitat, probablement actuant a nivell cortical i sense implicar l’NRT. Finalment, els resultats han mostrat que diversos antipsicòtics representatius tant del grup dels antipsicòtics clàssics com dels antipsicòtics atípics reverteixen la disrupció de les OBF corticals causada per la PCP, probablement per una complexa interacció entre els receptors de dopamina D1 i D2 (clàssics) i l’activació dels receptors de serotonina 5-HT1A (atípics). Així mateix, tant els agents glutamatèrgics (LY379268 i CNPX) com GABAèrgics (muscimol i diazepam) també reverteixen la pèrdua d'oscil•lacions causada per la PCP probablement restablint el balanç excitació/inhibició que es perd en el model de la PCP. En general aquests resultats donen suport a aquest model per al cribratge de nous fàrmacs antipsicòtics i la recerca de noves dianes terapèutiques. / Schizophrenia is a severe mental illness that affects 1% of population. The prefrontal cortex appears strongly implicated in its pathophysiology. NMDA receptor (NMDA-R) antagonists such as phencyclidine (PCP) are used as pharmacological models of schizophrenia due to their ability to evoke the symptoms of the illness. Previous work showed that PCP increases the activity of medial prefrontal cortex (mPFC) pyramidal neurons and decreases low frequency oscillations (LFO; <4 Hz) in rats. The antipsychotic drugs haloperidol and clozapine reverse these effects. Also, PCP increases c-fos expression in pyramidal neurons and thalamocortical neurons of centromedial and mediodorsal nuclei (reciprocally connected with mPFC), but not in thalamic reticular nucleus (TRN), which provide feed-forward GABAergic inhibition to the rest of thalamic neurons. Our aim was to examine the action of PCP on neurons from these thalamic nuclei. Additionally, we evaluated the possible reversal effects of PCP disruption of cortical LFO with different representative antipsychotic drugs and glutamatergic and GABAergic agents. Our results showed that 1) PCP excites thalamocortical neurons and decreases LFO in a similar manner than that produced in mPFC and that 2) clozapine reverses these effects. We hypothesized that disinhibition of TRN neurons might trigger such effects. The recording of thalamic reticular GABAergic neurons showed that PCP inhibits these neurons and also decreases LFO. In contrast to thalamic and pyramidal neurons, the posterior administration of clozapine does not reverse these effects, but inhibits even more the discharge rate of TRN neurons and leaves LFO unaltered. In conclusion, we suggest that thalamocortical hyperactivity induced by PCP is probably due to TRN disinhibition and that reversal effects of clozapine are probably due to an activation of cortical receptors. Finally, our results showed that different antipsychotic drugs restore the disruption in cortical LFO induced by PCP probably by a complex mechanism involving dopamine and serotonin receptors and that GABAergic and glutamatergic agents also reverse such disruption probably by restoring the excitation/inhibition balance lost in the PCP-model. In conclusion, this is a valid model to screen potential antipsychotic drugs and to determine possible therapeutic targets.

Tesi realitzada a l'Institut d’investigacions Biomèdiques de Barcelona (IIBB) / Globalment, aquesta tesi mostra diversos fenòmens que s’associen a la reperfusió després de la isquèmia cerebral. Per una banda, la inducció de la proteïna Hsp-70, a la que s’atribueixen propietats anti-apoptòtiques i protectores, promourà la supervivència neuronal en la zona de la penombra. La generació d’animals transgènics que expressen una proteïna fluorescent sota el promotor del gen Hsp-70 ens ha permès visualitzar en animals vius la zona de penombra mitjançant tècniques de microscòpia confocal intravital, així com monitoritzar aquesta expressió en regions cerebrals utilitzant tecnologia FRI. Malgrat la inducció de molècules protectores que facilitaran la supervivència neuronal a la zona de penombra, la reperfusió també comporta danys secundaris que s’associen principalment a estrès oxidatiu i inflamació. Aquests danys per reperfusió no s’observen en tots els animals sinó que es posen de manifest en aproximadament la meitat dels animals sotmesos a isquèmia transitòria seguida de reperfusió. Hem trobat que la hiperèmia reactiva en el moment de la reperfusió és un biomarcador de dany per reperfusió. El subgrup d’animals amb hiperèmia reactiva és el que és susceptible de respondre a tractaments antioxidants, com hem demostrat amb l’anàleg sintètic de la vitamina E, CR-6. L’administració oral de CR-6 dues hores després de l’inici de la isquèmia, protegeix els animals hiperèmics disminuint el volum d’infart cerebral i atenuant els dèficits neurològics. Aquesta protecció està relacionada amb una disminució de l’estrès oxidatiu a nivell de la vasculatura cerebral, menor alteració de la permeabilitat de la barrera hematoencefàlica, menor infiltració leucocitària i menor inflamació. La isquèmia/reperfusió també activa el complement. Hem demostrat que la via de les lectines està implicada en la lesió cerebral donat que els animals deficients en la proteïna MBL d’aquesta via tenen lesions de menor mida i presenten menys alteracions neurològiques. Hem demostrat que els efectes perjudicials de la MBL són deguts a la disminució del flux sanguini cerebral durant les hores que segueixen a la reperfusió post-isquèmia. Aquesta disminució està relacionada amb el dipòsit de fibrina/fibrinògen en la microvasculatura cerebral de la zona afectada i amb l’activació de la trombina, tal com demostren els efectes beneficiosos de l’inhibidor de trombina argatroban, que s’observen en els animals que tenen MBL però no en els animals deficients. Els resultats d’aquest treball permeten concloure que diferents estratègies per minimitzar el dany per reperfusió podrien incloure la inducció de l’expressió de Hsp-70 per afavorir la supervivència de les neurones de la penombra, i la inhibició tant de l’estrès oxidatiu com de l’activació del complement per la via de les lectines per evitar la trombosis secundària durant la reperfusió, atenuar l’estrès oxidatiu a l’endoteli vascular i prevenir la ruptura de la barrera hematoencefàlica i la inflamació tissular. / Stroke induces strong expression of the 72-kDa heat-shock protein (HSP-70) in the ischaemic brain, and neuronal expression of HSP-70 is associated with the ischaemic penumbra. The aim of this study was to image induction of Hsp-70 gene expression in vivo after brain ischaemia using reporter mice. A genomic DNA sequence of the Hspa1b promoter was used to generate an Hsp70-mPlum far-red fluorescence reporter vector. The construct was tested in cellular systems (NIH3T3 mouse fibroblast cell line) by transient transfection and examining mPlum and Hsp-70 induction under a challenge. After construct validation, mPlum transgenic mice were generated. Focal brain ischaemia was induced by transient intraluminal occlusion of the middle cerebral artery and the mice were imaged in vivo with fluorescence reflectance imaging (FRI) with an intact skull, and with confocal microscopy after opening a cranial window. Cells transfected with the Hsp70-mPlum construct showed mPlum fluorescence after stimulation. One day after induction of ischaemia, reporter mice showed a FRI signal located in the HSP-70-positive zone within the ipsilateral hemisphere, as validated by immunohistochemistry. Live confocal microscopy allowed brain tissue to be visualized at the cellular level. mPlum fluorescence was observed in vivo in the ipsilateral cortex 1 day after induction of ischae- mia in neurons, where it is compatible with penumbra and neuronal viability, and in blood vessels in the core of the infarction. This study showed in vivo induction of Hsp-70 gene expression in ischaemic brain using reporter mice. The fluorescence signal showed in vivo the induction of Hsp-70 in penumbra neurons and in the vasculature within the ischaemic core. Several lines of evidence support the involvement of mannose-binding lectin (MBL) in stroke brain damage. The lectin pathway of the complement system facilitates thrombin activation and clot formation under certain experimental conditions. In the present study, we examine whether MBL promotes thrombosis after ischemia/reperfusion and influences the course and prognosis of ischemic stroke. Middle cerebral artery occlusion/reperfusion was performed in MBL-deficient and wild-type mice, and the brain lesion was assessed by MRI at days 1 and 7. Relative cerebral blood flow was monitored up to 6 hours after middle cerebral artery occlusion with laser speckle contrast imaging. Fibrin(ogen) was analyzed in the brain vasculature and plasma, and the effects of thrombin inhibitor argatroban were evaluated to assess the role of MBL in thrombin activation. Infarct volumes and neurological deficits were smaller in MBL knockout mice than in WT mice. Relative cerebral blood flow values during middle cerebral artery occlusion and at reperfusion were similar in both groups, but decreased during the next 6 hours in the WT group only. Also, the WT mice showed more fibrin(ogen) in brain vessels and a better outcome after argatroban treatment. In contrast, argatroban did not improve the outcome in MBL knockout mice. MBL promotes brain damage and functional impairment after brain ischemia/reperfusion in mice. These effects are secondary to intravascular thrombosis and impaired relative cerebral blood flow during reperfusion. Argatroban protects WT mice, but not MBL knockout mice, emphasizing a role of MBL in local thrombus formation in acute ischemia/reperfusion.

El interferón-beta (IFNβ) es un tratamiento parcialmente efectivo en pacientes con esclerosis múltiple remitente-recurrente (EMRR). Disminuye el número de brotes y reduce la actividad y carga lesional de la enfermedad medidas por resonancia magnética. Sin embargo, el coste del IFNβ es elevado, el tratamiento tiene efectos secundarios y, sobretodo, existe una proporción relativamente importante de pacientes que no responden al mismo. En la actualidad, no disponemos de biomarcadores que se puedan asociar de forma fiable con la respuesta al IFNβ. En este contexto, el objetivo principal de esta tesis doctoral es la identificación de biomarcadores moleculares de respuesta al tratamiento con IFNβ en pacientes con EMRR. Mediante la aplicación de tecnologías denominadas “ómicas”, principalmente genómica y transcriptómica, se ha identificado un grupo de biomarcadores que presentan un denominador funcional común, su inducción predominante por los IFNs de tipo 1. De esta forma, las células de sangre periférica de pacientes con EMRR que no responden al tratamiento con IFNβ se caracterizan por una huella de expresión génica formada por genes de inducción predominante o selectiva por los IFNs de tipo 1, que ya se encuentra presente antes del tratamiento con IFNβ. Tambien se observó que algunos polimorfismos de genes que pertenecen a la vía de los IFNs de tipo 1 fueron los que mejor discriminaron entre pacientes con buena y mala respuestal al IFNβ. Los resultados de la presente tesis doctoral permiten concluir que la vía de los IFNs de tipo 1 se encuentra alterada en células de sangre periférica, posiblemente monocitos, de pacientes con mala respuesta al IFNβ, y propone un conjunto de biomarcadores con potencial uso en la práctica clínica para predecir la respuesta al tratamiento con IFNβ en el paciente con EM. / Interferon-beta (IFNβ) is a partially effective treatment for patients with relapsing-remitting multiple sclerosis (RRMS). IFNβ has been shown to decrease clinical relapses and reduce brain magnetic resonance imaging activity. However, the cost of IFNβ is significant, the drug is associated with a number of adverse reactions, and there is a relatively large proportion of patients who do not respond to therapy. At present, there is a lack of biomarkers reliably associated with the response to IFNβ. In this context, the main objective of this doctoral thesis is the identification of IFNβ-treatment response molecular biomarkers in patients with RRMS. By applying omic technologies, particularly genomics and transcriptomics, we identified a group of biomarkers that had in common their predominant induction by type 1 IFNs. In this way, peripheral blood cells from RRMS patients who will not respond to IFNβ are characterized by a gene expression signature composed of genes predominantly or selectively induced by type 1 IFNs, which is already present before treatment with IFNβ. Furthermore, some polymorphisms of genes belonging to the type 1 IFN pathway discriminated well between responders and non-responders to IFNβ. The results from this doctoral thesis point to a dysregulation of the type 1 IFN pathway in peripheral blood cells, most likely monocytes, from patients who will show a lack of response to IFNβ, and propose molecular biomarkers that may potentially be used in clinical practice to predict the response to IFNβ in MS patients.

Las lesiones medulares presentan, como una de las consecuencias principales, una alteración o pérdida de la capacidad de marcha. Basado en modelos animales, a finales de los años 80 se desarrolló el Entrenamiento de la Marcha Asistida con Soporte Parcial del Peso Corporal (EMA-SPPC) utilizando una cinta sin fin y la suspensión parcial del peso corporal mediante un arnés. El desarrollo de tecnología robótica para el EMA-SPPC ha llevado a la introducción de sistemas como el Lokomat® y el Gait Trainer GT I® en los centros de neurorehabilitación. Planteamos un estudio longitudinal en pacientes con una lesión medular utilizando estos dos sistemas (Lokomat® o Gait Trainer GT I®) con una frecuencia y duración del entrenamiento determinadas. La respuesta al entrenamiento la valoramos utilizando escalas clínicas y funcionales ya establecidas que nos permiten objetivar las ganancias obtenidas. Los resultados apoyan el uso preferente de estos sistemas en pacientes con una lesión motora incompleta y que los mayores beneficios se encuentran cuando se inicia el entrenamiento en las fases tempranas, dentro de los 6 primeros meses tras la lesión. Como otra herramienta de valoración de resultados utilizamos también técnicas neurofisiológicas. Es conocida la importancia de la modulación de los reflejos para obtener un control motor adecuado. En concreto examinamos la modulación del reflejo H por estimulación magnética transcraneal (EMT) y su evolución tras el entrenamiento de la marcha. De esta forma encontramos que los pacientes con una lesión medular incompleta motora tienen alteraciones en el control de los reflejos espinales segmentarios, cuyo correlato neurofisiológico se encuentra en una disminución de la facilitación del reflejo H inducida por EMT (en la fase de 20 ms.). La facilitación temprana (20 ms) del reflejo H por EMT aumenta en mayor medida tras la rehabilitación en aquellos pacientes que empezaron su entrenamiento con < 3 meses desde su lesión. Existe una correlación positiva entre el incremento de facilitación del reflejo H por EMT y la mejora en la funcionalidad (escala de marcha WISCI II) tras el entrenamiento en aquellos pacientes con < 3 meses de evolución. La modulación del reflejo H por EMT puede ser otra herramienta para la valoración de los lesionados medulares aportando medidas cuantitativas del control del cortex motor sobre los reflejos de las extremidades inferiores. La EMT además de como herramienta diagnostica puede ser utilizada de forma terapéutica en su modalidad repetitiva (EMTr). La EMTr puede modular la excitabilidad cortical e inducir cambios sobre las vías cortico espinales. De esta forma nos planteamos el uso combinado de la rehabilitación de la marcha con EMTr de alta frecuencia y su influencia en los resultados funcionales del paciente. La EMTr asociada al entrenamiento de la marcha en sujetos con una lesión medular incompleta mejora el balance muscular de las EEII, la espasticidad y la velocidad de marcha. Las ganancias funcionales se mantienen por lo menos 2 semanas tras el tratamiento. Se postula que el mecanismo a través del cual la EMTr produce las mejoras descritas es a través de la facilitación de las proyecciones corticoespinales. Podemos considerar la EMTr como una herramienta prometedora en los programas de rehabilitación de la lesión medular. / Spinal cord injuries (SCI) have as one of the main consequences, the alteration or loss of the ambulation capacity. Based on animal models, in the late 1980s, body weight–supported treadmill training (BWSTT) was developed for gait rehabilitation using a treadmill, body weight support, and manual assistance. The development of robotic technology for the BWSTT, has come to the introduction of new systems like the Lokomat® and the Gait Trainer GT I® in the neurorehabilitation centers. We conducted a longitudinal study in subjects with a spinal cord injury using these two systems (Lokomat® or Gait Trainer GT I®) with the same frequency and duration of training. The response to training was assessed using accepted clinical impairment and functional scales, allowing us to assess the improvement obtained. The results support the preferred use of these systems in patients with an incomplete motor lesion, and that the most benefits are obtained if the training is started in the initial phases, especially in the first 6 months post injury. As another tool for evaluation of outcomes we also use neurophysiological techniques. It is well known, that the modulation of reflexes is an important aspect of motor control. In particularly we studied the H reflex modulation by transcranial magnetic stimulation (TMS) and its change after gait training. We found that the subjects with a motor incomplete SCI have a deficit in the appropriate control of the spinal reflexes, with a neurophysiologic correlation of a reduced H reflex facilitation by TMS (phase of 20 ms). The H reflex modulation by TMS at the early phase (20 ms) improves after gait training on those subjects who stated the training in the first 3 months after injury. There is a good correlation between the increase of H reflex facilitation and the improvement in functional aspects (gait scale WISCI II) after training in the group with less than 3 months after injury. The H reflex modulation by TMS may be another neurophysiological tool to provide quantified measures to the supraspinal control of lower limb reflexes in patients with SCI. Besides being a diagnostic tool, TMS may be used as a therapeutic tool in its repetitive mode (rTMS). rTMS may modulate cortical excitability and induce changes in the corticospinal tracts. We conducted a study combining gait training with high frequency rTMS, in order to assess the influence of the rTMS in the functional outcome of the patient. Our results showed that rTMS combined with gait training are beneficial for motor recovery in the lower limbs, walking speed, and reduction of spasticity in incomplete SCI patients. The functional gains were maintained at least 2 weeks post training. It is possible that the improvements found are induced through the facilitation of corticospinal excitability. We can consider rTMS as a promising tool in the SCI rehabilitation programs.