Thèse d'exercice : Pharmacie : Université de Nantes : 2003. / Bibliogr. f. 71-75.

Thèse (Ph. D.)--Université Laval, 2008. / Bibliogr.: f. 154-182. Publié aussi en version électronique dans la Collection Mémoires et thèses électroniques.

L'objectif de ce travail était de développer une méthode de traitement de l'échantillon permettant l'analyse par LC-MS2 d'adduits formés entre des composés neurotoxiques organophosphorés (OPNA) et la butyrylcholinesterase, protéine plasmatique. En vue d'une automatisation totale du processus analytique, une étape d'immunoextraction a été couplée à un réacteur de digestion enzymatique (IMER), suivie d'une analyse par microLC-MS2 afin de détecter le peptide adduit par l'OPNA. Tout d'abord, la synthèse d'IMER de pepsine a été optimisée. L'IMER le plus performant a été appliqué à la digestion de la BuChE afin d'analyser le peptide biomarqueur d'intoxication, par nanoLC-MS2. Un IMER de pepsine, de dimensions supérieures a pu être rapidement intégré à un système d'analyse microLC-MS2, permettant la digestion de la BuChE et l'analyse en ligne du peptide cible. Dans un second temps, une méthode d'extraction sélective a été développée par immobilisation de différents anticorps anti-BuChE sur un support solide appelé immunoadsorbant. Le protocole d'immunoextraction a été mis au point, puis les immunoadsorbants ont été caractérisés en termes de sélectivité et de rendement d'extraction avant d'envisager son couplage au digesteur enzymatique. La faisabilité du couplage a pu être clairement démontrée et ce dispositif automatisable a été appliqué à l'analyse de la BuChE de plasma humain, dopé par des OPNA. Cela a permis la détection rapide et sensible des adduits OPNA-BuChE, à partir de très faibles quantités de plasma. / The objective of this work was to develop a sample treatment method for the LC-MS2 analysis of adducts formed between organophosphorus nerve agent (OPNA) and butyrylcholinesterase, a plasmatic protein. In order to fully automate the analytical process, an immunoextraction step was coupled to an enzymatic digestion reactor (IMER), followed by microLC-MS2 analysis to detect the OPNA-peptide adduct. First, the synthesis of pepsin-based IMER was optimized. The most powerful pepsin-based IMER was applied to the digestion of HuBuChE to generate the peptide used as biomarker of OPNA intoxication that was further analyzed by nanoLC-MS2. This pepsin-based IMER was then integrated into a microLC-MS2 analytical system, allowing the on-line digestion of HuBuChE and the analysis of the target peptide. In a second step, a selective extraction method was developed by immobilizing anti-HuBuChE antibodies on a solid support, called immunosorbent. The immunoextraction protocol was developed and the immunosorbents were characterized in terms of selectivity and extraction yield before being coupled to the IMER. The feasibility of the coupling was clearly demonstrated and this automatable device was used for the analysis of HuBuChE from human plasma, spiked with OPNA. This allowed the fast and sensitive detection of OPNA-BuChE adducts in very small amounts of plasma.

Ce projet à caractère dual civil et militaire vise à développer de nouvelles contre-mesures médicales d’urgences hautement efficaces en cas d’intoxications accidentelles ou volontaires aux organophosphorés toxiques (gaz de combat et pesticides). Ces poisons agissent comme des inhibiteurs irréversibles de l’acétylcholinestérase, enzyme clé principalement localisé dans notre système nerveux, par phosphorylation du site actif enzymatique. Cependant, un nucléophile puissant capable de pénétrer jusqu’au site actif de la protéine peut également l’hydrolyser. Notre recherche réside sur l’élaboration de molécules hybrides possédant deux systèmes clés : une partie réactivatrice neutre capable de restaurer l’activité enzymatique et un ligand du site périphérique capable de vectoriser la structure hybride à l’entrée du site actif. Une librairie de nouveaux hybrides bifonctionnels a ainsi été synthétisée, évaluée et décrite dans ces travaux de thèse. L’ensemble de ces hybrides démontre une activité égale ou supérieure à celle des réactivateurs de référence. Nous avons même découvert le premier hybride universel surpassant l’activité de réactivation des antidotes actuellement commercialisés pour des intoxications aux gaz de combat et aux pesticides. / Remediation of both acute and chronic intoxications by organophosphorus nerve agents, both chemical warfare agents and pesticides, continues to be a challenge of paramount importance. These manmade poisons act as covalent and irreversible inhibitors of acetylcholinesterase, a key enzyme mostly located in the nervous system, through phosphylation of its active site. The phosphylated active site residues do not undergo spontaneous hydrolysis. However, hydrolysis can be achieved through the use of strong nucleophiles able to enter the buried active site of the protein. Our research is based on the rational design of hybrid structures containing two key elements: a neutral reactivator to restore the enzyme activity, and a peripheral site ligand giving selectivity by targeted binding to a site at the entrance of the enzyme active site gorge. A library of novel reactivators based on acridine, quinoline and original oxoassoanine analogues was synthesised, evaluated and is herein described. Delightfully, most of these hybrids proved to be equally or more potent than the drugs currently in use. Outstandingly, we have discovered the first broad-spectrum reactivator that outperformed all known reactivators for both chemical warfare agent and pesticide intoxications.

Les symptômes moteurs de la maladie de Parkinson sont causés par un déficit dopaminergique progressif au niveau du corps strié, résultant principalement de la dégénérescence des neurones dopaminergiques de la substance noire et de la voie nigrostriée qui contrôle une partie importante du système musculaire volontaire. Les symptômes cliniques cardinaux sont la perte de mobilité, la rigidité musculaire et la difficulté à initier un mouvement volontaire. L'étiologie de la maladie est incomprise jusqu'à ce jour. Tout au long de mes études, l'objectif principal de mes recherches était de démontrer que le stress oxydant est un joueur majeur de la dégénérescence des neurones dopaminergiques. Mon travail de recherche s'est concentré, premièrement, à l'étude des mécanismes cellulaires engendrés par des agonistes dopaminergiques face à un traitement oxydant. Nous avons employé un modèle cellulaire dopaminergique, traité avec des agonistes dopaminergiques et le MPP+ , une neurotoxine dopaminergique connue. Nous avons constaté que non seulement les agonistes dopaminergiques utilisés n'offrent aucune protection contre l'effet oxydant de la neurotoxine, mais qu'ils renforcent la toxicité du MPP+ . Notre hypothèse comporte trois volets : l'activation du récepteur dopaminergique de type D2 (1) favorise l'expression du transporteur de la dopamine, (2) favorise la diminution de l'expression du récepteur de type D3 et (3) facilite l'entrée du MPP+ par le transporteur de la dopamine. Deuxièmement, mes recherches ont démontré que le traitement au MPP+ et/ou aux estrogènes altère l'activité transcriptionnelle des niveaux de neurofilaments. Mes résultats démontrent qu'il y a une corrélation entre l'effet cellulaire du traitement estrogénique et l'expression des protéines du cytosquelette des cellules suite à un traitement oxydant. Troisièmement, j'ai démontré que Nur77, un facteur de transcription nucléaire orphelin favorisant l'expression des gènes de survie de cellules, a la capacité de se transférer du noyau vers le cytoplasme, où il peut agir en tant qu'agent pro-apoptotique lors d'un traitement à la 6-hydroxydopamine. Nous avons également montré que le bêta-estradiol, une hormone neuroprotectrice, retarde la translocation de Nur77, retardant ainsi l'apoptose induite par la 6-hydroxydopamine. Puisque Nur77 est normalement vu comme un agent anti-apoptotique, mes résultats fournissent des nouvelles avenues au sujet du rôle de Nur77 et de sa translocation cytoplasmique sous effets oxydants. / Parkinson's disease is a neurodegenerative disease caused by a progressive cell loss in the striatum, mainly resulting from degeneration of the nigrostriatal pathways. This pathway, thoroughly dopaminergic, provides the necessary inputs to the striatum regarding voluntary muscle regulation. Cardinal symptoms observed in patients are loss of mobility, muscle rigidity and difficulty to initiate any voluntary movement. The etiology of the disease is poorly understood. Throughout my studies, the main objective of my research was designating oxidative stress as a potential lead player of dopaminergic cells' demise. In the first part, my work focused on the molecular players involved in dopaminergic agonist-treated cells undergoing oxidative stress. We used a cellular model of dopaminergic cells treated with dopamine agonists and with MPP+ , a known dopaminergic neurotoxin. Surprisingly, we found that dopamine agonists did not offer any protection against oxidative stress, and that they actually potentiate MPP+ toxicity. After three years of intensive research, we conclude that the D2 dopamine receptor sub-type activation promotes dopamine transporter expression, downregulates the D3 dopamine receptor subtype expression and thus promotes MPP+ -induced cytotoxicity. These in vitro experiments provide a better understanding of D2 dopamine receptor subtype activating cascade. Also, recent evidence suggests that the D3 dopamine receptor subtype is the only receptor offering real protection against oxidative stress. This may explains the discrepancies between in vivo and in vitro data on the neuroprotection conferred by dopamine agonists. My second research topic focused on transcriptional regulation of neurofilaments following MPP+ and/or estrogenic treatments. Our results demonstrate a relationship between estrogenic treatment and cytoskeletal strengthening of the cells. Upon treatment with estradiol, cells readily demonstrated an ability to replace the impaired neurofilaments when sustaining oxidative stress, possibly explaining part of the neuroprotective properties characteristic of estrogens. Thirdly, I demonstrated that Nur77 can translocate from the nucleus to cytoplasm, where it can act as a pro-apoptotic agent, when cells undergo 6-hydroxydopamine toxic treatment. We also showed that p-estradiol delays Nur77 translocation, thus preventing 6- hydroxydopamine-induced apoptosis. Because Nur77 is normally seen as an antiapoptotic agent, my results provide new insights about other roles for this protein and the regulation of its cytoplasmic translocation by oxidative stress.

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.

Les organophosphorés (OPs) sont des neurotoxiques. Leur décontamination est difficile et coûteuse. L’utilisation d’enzymes capables de les détoxifier est une solution élégante. Les enzymes bactériennes sont peu stables et chères à produire. Nous avons identifié des enzymes très résistantes, capable de biodégrader lentement ces composés. Nous avons alors développé une stratégie permettant d'améliorer l'activité de l'enzyme très stable en nous basant sur les enzymes les plus actives. Celle-ci fut améliorée de plus de 1000 fois envers ces insecticides. Enfin, nous avons analysé l'origine de ces améliorations et mis en évidence des concepts émergents dans l'évolution des enzymes. / Organophosphorus compounds are neurotoxic. Their decontamination is difficult and cost prohibitive. An appealing solution resides in the use of enzymes capable of degrading such compounds. Bacterial enzymes are poorly stable and expensive. We identified highly resistant enzymes capable of slowly biodegrading these compounds. We have developped a strategy allowing to increase the activity of our enzyme by using the similarities with the highly active enzymes. The activity was increased by a factor of 1000 against OPs. We analyzed the origins of these ameliorations and showed emergent concepts in enzyme evolution.

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal

Les neurotoxiques organophosphorés (NOPs) sont des inhibiteurs irréversibles de l’acétylcholinestérase, une enzyme jouant un rôle clé dans la transmission de l’influx nerveux. Une intoxication par ces substances provoque de graves symptômes pouvant aboutir au décès des sujets empoisonnés. Bien qu’interdits par une convention internationale ratifiée par 190 pays, le contexte géopolitique actuel ravive la hantise d’une menace chimique contre des populations civiles, renouvelant l’intérêt de développer de nouveaux remèdes contre une intoxication aux NOP. A l’heure actuelle, les antidotes utilisés contre ces intoxications sont les mono- et bis- pyridinium aldoximes portant une ou deux charge(s) positive(s) permanente(s), qui présentent de nombreuses limitations, dont leur très faible capacité à traverser la barrière hémato-encéphalique et à réactiver efficacement les AChEs inhibées par les NOP dans le système nerveux central (SNC). Par ailleurs, leur efficacité est très dépendante de la nature du NOP utilisé, et il n’existe pas, aujourd’hui, de réactivateur universel. Dans ce contexte, le développement de nouveaux réactivateurs efficaces est un réel défi. Au cours de cette thèse, l’optimisation de la synthèse de cinq réactivateurs non chargés incorporant une amine cyclique en tant que ligand du site périphérique et la 3-hydroxypyridine aldoxime en tant que fonction réactivatrice a été développée pour évaluation in vivo. Dans cette continuité, vingt-et-un réactivateurs non chargés inédits comportant un ligand aminé du site périphérique de l’enzyme associée à la même fonction réactivatrice 3-hydroxypyridine aldoxime ont été conçus, synthétisés et testés sur l’AChE humaine inhibée par différents NOPs mais aussi sur les récepteurs nicotiniques. Certains d’entre eux ont été testés in vivo sur la souris. Parmi les réactivateurs synthétisés, certains possèdent des efficacités de réactivation identiques, voire meilleures que les oximes de référence utilisées de nos jours tout en ayant un effet antagoniste des récepteurs nicotiniques ouvrant ainsi la voie aux réactivateurs dits « Multi-cibles ». Avec comme objectif de traverser la barrière hémato-encéphalique en utilisant les transporteurs GLUTs présents sur les cellules endothéliales constituant cette barrière, quatre réactivateurs incorporant un motif carbohydrate ont été resynthétisés et évalués in vivo et in vitro. Enfin, de nouvelles fonctions réactivatrices constituées d’un motif thiadiazole-aldoxime et naphtaldoxime ont été étudiées ouvrant la voie à de nouvelles familles de réactivateurs et, pour la dernière fonction, remettant en cause le cahier des charges utilisé jusqu’alors pour la conception de nouveaux réactivateurs. / Organophosphorus nerve agents (OPNA) are irreversibly acetylcholinesterase (AChE) inhibitors, a key enzyme in the central nervos system playing a pivotal role in neurotransmission. OPNA poisoning induces to serious symptoms that can lead to death by respiratory failure. Despite an international convention prohibiting the use of chemical weapons, the current geopolitical context is reviving the fear of a chemical threat against civilian populations, and has renewed the interest of developing new remedies for OPNA poisoning. Nowadays, medical countermeasure used against OPNA intoxications are based on mono- and bis-pyridinium aldoximes carrying one or two permanent positive charge(s), which present many limitations, including their very low capacity to cross the blood-brain barrier and to reactivate effectively ChEs nhibited by NOPs in the central nervous system (CNS). Moreover, their effectiveness is highly dependent on the nature of the NOP used, therefore, there is no universal reactivator. In this context, the development of new effective reactivators is a real challenge. In this PhD, an optimized synthetic access to five uncharged reactivators incorporating a cyclic amine as peripheral site ligand and 3-hydroxypyridine aldoxime as reactivating function was developed for in vivo evaluation. Following up on this, twenty-one new uncharged reactivators bearing unprecedented cyclic amines as peripheral site ligand associated with our reactivating function were designed, synthetized and evaluated for reactivation on human AChE inhibited by several NOPs but also in vivo on mice and as antagonists on nicotinic receptors in vitro. Among these reactivators, some have identical or better reactivation efficiencies than the reference oximes used today while having a nicotinic receptor antagonist effect ; thus, paving the way for « Multi-target » reactivators. Aiming at an active BBB crossing using the GLUTs receptors, four reactivators including a carbohydrate moiety have been resynthetized and biologically evaluated. Last but not least, new reactivator functions consisting of a thiadazole-aldoxime and naphtaldoxime moieties have been studied, paving the way to new families of uncharged reactivators and, especially for the last function, calling into question design specifications of new reactivators.

Les neurotoxiques organophosphorés (NOP) sont extrêmement toxiques et peu volatils. Dans des conditions normales de température et de pression, ils peuvent pénétrer rapidement la peau sous forme liquide et exercer leurs effets délétères. En milieu civil ou militaire, leur utilisation potentielle est toujours redoutée. Le développement de dispositifs de protection cutanée vis-à-vis de ces agents est donc d’un intérêt majeur pour les armées et la sécurité civile. Dans ce contexte, les objectifs de ce travail ont été de formuler et évaluer la stabilité et l’efficacité de topiques protecteurs cutanés (TP) vis-à-vis des NOP. Le premier objectif a consisté à mettre au point des TP de compositions et de formes galéniques différentes (émulsions, gels) puis à valider leurs stabilités physicochimiques. Cent trente TP ont été formulés et 30 ont montré une stabilité physicochimique satisfaisante. Le second objectif a été d’évaluer l’efficacité des TP les plus prometteurs vis-à-vis des composés organophosphorés. Actuellement il n’existe pas de standardisation de ce type d’étude. Par conséquent, l’utilisation de plusieurs tests in vitro et in vivo (membranes biologiques ou synthétiques, NOP ou simili), dont la pertinence et la fiabilité ont été déterminées, nous a permis d’établir une logique de criblage pour l’évaluation de l’efficacité des TP. Parmi les 13 formulations testées, les résultats ont montré qu’un gel hydro-alcoolique apporte une protection cutanée significative et supérieure aux produits de référence testés vis-à-vis du VX, un NOP d’intérêt / Prevention of exposure to the neurotoxic organophosphorus compounds (OP) that are quickly absorbed in the skin is a major concern both for pesticide users and soldiers. Skin barrier creams are being developed to complement or replace uncomfortable chemical protective suits. The objectives of this work were to formulate and assess physicochemical stability and protective efficacy of topical skin protectant (TSP) against OP compounds. The first objective was to formulate several different TSP (emulsions, gel) and validate their physicochemical stability.The second objective was to determine the consistency of results from in vitro tests and the importance of the formulation composition in the skin protective efficacy. Quick evaluation of formulations efficacy mainly relies on in vitro tests which lead to consistent, complementary and relevant results. Our results indicated that the least effective formulations could be quickly identified by performing in vitro permeation tests with silicone membrane and by evaluating interfacial interactions between formulations and OP. We showed that a hydrogel containing specific hydrophilic polymers was by far the most effective of the formulations evaluated against VX, OP compounds, skin permeation in vitro