Niemann Pick Type C (NPC) disease is a fatal childhood neurological disease caused by mutations in the NPC-1 protein, resulting in cholesterol buildup in the late endosomes. StarD4 and StarD5 are cholesterol binding proteins that play a role in the intracellular cholesterol transport. In this study we overexpress StarD4 and StarD5 in in vitro and in vivo models, and find evidence of amelioration of the NPC phenotype. This study demonstrates that the overexpression of these proteins has the potential to be a therapeutic treatment for NPC disease.

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Niemann-Pick disease type C (NPC) is a rare, severe disease with autosomal recessive inheritance. Disease is caused by pathogenic mutations located in genes NPC1/NPC2. These genes encode lysosomal non enzymatic NPC1/NPC2 proteins that are part of lipid transport. As a result of malfunction of these proteins intracellular accumulation of lipids occurs, in particular free cholesterol and glycolipids. Causal therapy is currently still unsatisfactory therefore new therapies are evolved. However these therapies depend on whether the patient cells contain at least residual amount of transcript NPC1 gene. In a group of patiens, for which a fibroblast culture was available, I analyzed the effect of pathogenic mutations on the expression level of the transcript. Results showed that for all pathogenic mutations transcript level is low, but detectable. Moreover, I characterized the structure of the NPC1 gene promoter. By sequence analysis I found polymorphisms rs8099071, rs28403610, rs2981422, rs1652354, rs1788774, rs1788772 in promoter. On the basis of the composition of polymorphisms in individual patiens, I estimate six different haplotypes. I performed mutation analysis in DNA of recently diagnosed patient. I found only one pathogenic mutation p.I1061T (c.3182T> C) in the NPC1 gene. Therefore I tested...

The Niemann-Pick type C (NPC) disease is a lysosomal lipid storage disorder caused by mutations in one of the two genes NPC1 or NPC2 encoding proteins of the late endosome/lysosome compartment (LE/LY). Defect in these proteins alters vesicular transport and leads to abnormal accumulation of cholesterol (Chol) in LE/LY. There are some lines of evidence suggesting that annexin A6 (AnxA6) participates in vesicular transport of Chol and may interact with membrane domains enriched in Chol and bind Chol. In this work we characterized the membrane microdomains resistant to Triton X-100, i.e., detergent-resistant membranes (DRMs) isolated from NPC patient-derived fibroblasts and from control cells. NPC cells contain a significantly higher amount of DRMs than the control cells that is consistent with the defect in Chol turnover in NPC cells. We also studied the mechanism of AnxA6 involvement in the NPC-induced changes in the membrane organization and showed that in the presence of calcium some AnxA6 molecules associate with the DRMs. This suggests that AnxA6 may play a role in the membrane lateral organization, contributing thus to the etiology of NPC disease. We then focused on the interaction of AnxA6-1 with Chol-rich membranes and on the involvement of its flexible region and VAAEIL sequence in these interactions. For this purpose, kinetics of the interfacial adsorption of human recombinant AnxA6 to Langmuir monolayers containing phosphatidylcholine, Chol and/or cholesteryl acetate were measured. Our data suggest that AnxA6 exhibits the highest affinity to Chol-containing monolayers and that the hydroxyl group of Chol plays a pivotal role in the AnxA6-lipid interactions in vitro.

Thesis (Ph. D.)--University of Washington, 2006. / Vita. Includes bibliographical references (leaves 88-101).

A doença de Nicmann - Pick tipo C (DNPC) é uma desordem genética lisossomal neurodegenerativa causada pelo acúmulo de lipídios, principalmente colesterol, esfingomielina e glicoesfingolipídios no espaço perinuclear. U18666A é um agente inihidor no transporte de colesterol, que vem sendo utilizado em diversos modelos tanto in vivo quanto in vitro para mimificar DNPC, principalmente em fihrohlastos. Diversas doenças ncurodcgcncrativas estão associadas ao estresse oxidativo c acredita-se que radicais livres, produtos de lipoperoxidação e alterações na fluidez da membrana possam inibir a enzima Na+, K+-A TPase, levando a célula a um "déficit" energético. A deficiência de algumas proteínas como a GF AP parecem tornar os astrócitos menos eficientes em lidar com estados de injúrias no SNC, além de algumas pesquisas mostrarem um decréscimo na fosforilação de vimentina em fihrohlastos humanos com NPC. MK-801 é um receptor não competitivo de NMDA (N-mctil D-aspartato), sendo considerado um ncurotransmissor primário do cérebro. O objetivo desse estudo foi observar os efeitos da droga U 18666A, que causam o acúmulo de colesterol no citoplasma de astrôcitos de ratos jovens e a partir daí verificar a atividade de algumas hidrolascs lisossomais, parâmetros do estresse oxidativo, metabolismo energético e a hipelfosforilação de filamentos intermediários (GFAP e vimcntina) em astrócitos de ratos jovens. Através da coloração de Filippin c microscopia de fluorescência e através da utilização do CellM software, foi feita a visualização e quantificação do colesteroL A melhor dose de U18666A que permitiu o acúmulo de colesterol foi de 0,25 j..tg/mL em um período de incubação de 48 horas. Astrócitos de ratos incubados com a droga (DNPC) mostraram um significativo aumento de colesterol em relação aquelas culturas sem a droga. A medida da atividade da csfingomielinasc c enzimas beta-glicosidase em astrócitos de ratos com NPC foi significativamente menor do que astrócitos controle, o que é consistente com a atividade da DNPC humana. Verificando as alterações sofridas em nível de enzimas antioxidantcs c estresse oxidativo observamos que U 18666A leva a um aumento nos gmpos TBARS e Carbonil, porém a uma diminuição nos grupos tióis medidos por ensaios sulfidril. Além disso, ocorre um decréscimo na atividade de CAT e SOD e aumenta a produção de NO, ao analisarmos a atividade de Na+, K+ A TPase verifica-se um efeito inibitório na atividade dessa enzima. Os presentes resultados mostram que o acúmulo de colesterol nas culturas de células, induz o estresse oxidativo, o que indica que é potencialmente tóxico e confirma os resultados observados em outras doenças neurodegenerativas. Por fim, ao utilizarmos 4 grupos diferentes, fazendo uso ou não da droga c do MK-801 verificou-se que com o acúmulo de colesterol nas células ocorre uma hiperfosforilação dos Filamentos Intermediários, tanto de GFAP quanto de vimentina, porém o MK-801, sendo um antagonista de NMDA e agindo sobre os receptores de glutamato demonstram inibirem a cxcitotoxicidadc provocada pelo Ul8666A. Além dos parâmetros que foram testados em nosso trabalho, como extresse oxidativo, enzimas antioxidantcs c metabolismo energético, fazendo uso da droga para minriticar NPC, outros parâmetros bioquímicas das células, os quais ainda não foram testados em nossos estudos, podem ser testados com este modelo animal, contribuindo assim para uma melhor compreensão da doença. Podemos fazer uso ainda de substâncias que diminuam a excitotocicidade causada pelo aumento do colesterol, observados na NPC, a exemplo do antagonista do receptor NMDA, MK-801, podendo se tomar ferramentas viáveis para auxiliar no tratamento de doenças ncurodcgcncrativas relacionadas a cxcitotocicidadc glutamatérgica. / The Niemann - Pick type C (NPC) is a disorder genetic neurodegenerative caused by lysosomal accumulation of lipids, cspccially cholcstcrol, sphingomyclin and glycosphingolipids in the perinuclear space. U 18666A is an inhibitory agent in choiesteroi transport, which has heen used in several models hoth in vivo and in vitro to mimificar NPC, cspccially in fibroblasts. Various ncurodcgencrativc discases are associatcd with oxidative stress and it is believed that the free radicais, lipid peroxidation products and changes in membrane fluidity may inhibit the enzyme Na+, K + -ATPase, causing the cell suftcring a dcficit of cncrgy. Thc dcficiency of ccrtain protcins as GFAP sccm to makc astrocytes iess efficient in dealing with states of injury in the CNS, and some research shows a decrease in phosphorylation of vimentin in human fibroblasts with NPC. MK-801 is a noncompctitive NMDA receptor, bcing considercd a primary ncurotransmitter. Thc ohjective of this study was to observe the effects of U 18666A drug, eausing the accumulation of cholcstcrol in thc eytoplasm of young rat astrocytcs and thus verify thc activity of some lysosomai hydroiases, oxidative stress parameters, energy metabolism and hyperphosphorylation of intermediate filaments (vimentin and GFAP) in astrocytes of young rat. Through Filippin staining and fluorescence microscopy and by using the software Cel!M was made visualization and quantitation of cholesterol. The hest dose U18666A which allowed thc aceumulation of cholcstcrol was 0.25 mg I mL in a 48 hour period of incubation. Rat astrocytes (NPC) incubated with the drug showed a significant increase in total cholesterol relative to the cultures without drug. The measure of activity of sphingomyclinase and bcta-glucosidasc enzymes in rat astroeytcs NPC was signiticantly lower than contrai astrocytes, which is consistent with the activity of the human NPC. Noting the changcs suftcred in thc levei of antioxidant enzymcs and oxidativc stress U 18666A observed that ieads to an increase in TBARS and carbonyl groups, but a decrease in the thiol groups as measured by sulfl1ydryl tests. Moreover, there is a decrease in SOD and CAT activity and incrcascs the production of NO, by analyzing thc activity ofthe Na+, K + -ATPase there is an inhibitory effect on this enzyme. The present results show that the accumulation of cholesterol in cell cultures induces oxidative stress, which indicates that it is potcntially toxic, confirming the results observed in othcr ncurodcgcnerative discascs. Finally, we used four different groups, with or without the use of the dmg MK-801, and found that the accumulation of cholesterol in cells leads to hyperphosphorylation FI both GFAP and vimcntin, howcver, MK-801, an NMDA antagonist acts on the glutamatc receptor, and inhibit excitotoxicity caused by U 18666A. Besides the parameters that were tcstcd in our study, as oxidative stress, antioxidant cnzymcs and encrgy mctabolism, causing the dmg to mimificar NPC other biochemical parameters of the cells, which were not tested in our study may he tested with this model animal, thus contributing to a better undcrstanding of thc diseasc. Wc can still makc use of substances that rcduec thc excitotocicidade caused by increased choiesteroi, observed in NPC, such as the NMDA receptor antagonist, MK-801, which can hecome viahle tools to aid in the treatment of ncurodcgcnerativc diseascs rclatcd to cxcitotoeicidadc glutamatcrgic.

A doença de Nicmann - Pick tipo C (DNPC) é uma desordem genética lisossomal neurodegenerativa causada pelo acúmulo de lipídios, principalmente colesterol, esfingomielina e glicoesfingolipídios no espaço perinuclear. U18666A é um agente inihidor no transporte de colesterol, que vem sendo utilizado em diversos modelos tanto in vivo quanto in vitro para mimificar DNPC, principalmente em fihrohlastos. Diversas doenças ncurodcgcncrativas estão associadas ao estresse oxidativo c acredita-se que radicais livres, produtos de lipoperoxidação e alterações na fluidez da membrana possam inibir a enzima Na+, K+-A TPase, levando a célula a um "déficit" energético. A deficiência de algumas proteínas como a GF AP parecem tornar os astrócitos menos eficientes em lidar com estados de injúrias no SNC, além de algumas pesquisas mostrarem um decréscimo na fosforilação de vimentina em fihrohlastos humanos com NPC. MK-801 é um receptor não competitivo de NMDA (N-mctil D-aspartato), sendo considerado um ncurotransmissor primário do cérebro. O objetivo desse estudo foi observar os efeitos da droga U 18666A, que causam o acúmulo de colesterol no citoplasma de astrôcitos de ratos jovens e a partir daí verificar a atividade de algumas hidrolascs lisossomais, parâmetros do estresse oxidativo, metabolismo energético e a hipelfosforilação de filamentos intermediários (GFAP e vimcntina) em astrócitos de ratos jovens. Através da coloração de Filippin c microscopia de fluorescência e através da utilização do CellM software, foi feita a visualização e quantificação do colesteroL A melhor dose de U18666A que permitiu o acúmulo de colesterol foi de 0,25 j..tg/mL em um período de incubação de 48 horas. Astrócitos de ratos incubados com a droga (DNPC) mostraram um significativo aumento de colesterol em relação aquelas culturas sem a droga. A medida da atividade da csfingomielinasc c enzimas beta-glicosidase em astrócitos de ratos com NPC foi significativamente menor do que astrócitos controle, o que é consistente com a atividade da DNPC humana. Verificando as alterações sofridas em nível de enzimas antioxidantcs c estresse oxidativo observamos que U 18666A leva a um aumento nos gmpos TBARS e Carbonil, porém a uma diminuição nos grupos tióis medidos por ensaios sulfidril. Além disso, ocorre um decréscimo na atividade de CAT e SOD e aumenta a produção de NO, ao analisarmos a atividade de Na+, K+ A TPase verifica-se um efeito inibitório na atividade dessa enzima. Os presentes resultados mostram que o acúmulo de colesterol nas culturas de células, induz o estresse oxidativo, o que indica que é potencialmente tóxico e confirma os resultados observados em outras doenças neurodegenerativas. Por fim, ao utilizarmos 4 grupos diferentes, fazendo uso ou não da droga c do MK-801 verificou-se que com o acúmulo de colesterol nas células ocorre uma hiperfosforilação dos Filamentos Intermediários, tanto de GFAP quanto de vimentina, porém o MK-801, sendo um antagonista de NMDA e agindo sobre os receptores de glutamato demonstram inibirem a cxcitotoxicidadc provocada pelo Ul8666A. Além dos parâmetros que foram testados em nosso trabalho, como extresse oxidativo, enzimas antioxidantcs c metabolismo energético, fazendo uso da droga para minriticar NPC, outros parâmetros bioquímicas das células, os quais ainda não foram testados em nossos estudos, podem ser testados com este modelo animal, contribuindo assim para uma melhor compreensão da doença. Podemos fazer uso ainda de substâncias que diminuam a excitotocicidade causada pelo aumento do colesterol, observados na NPC, a exemplo do antagonista do receptor NMDA, MK-801, podendo se tomar ferramentas viáveis para auxiliar no tratamento de doenças ncurodcgcncrativas relacionadas a cxcitotocicidadc glutamatérgica. / The Niemann - Pick type C (NPC) is a disorder genetic neurodegenerative caused by lysosomal accumulation of lipids, cspccially cholcstcrol, sphingomyclin and glycosphingolipids in the perinuclear space. U 18666A is an inhibitory agent in choiesteroi transport, which has heen used in several models hoth in vivo and in vitro to mimificar NPC, cspccially in fibroblasts. Various ncurodcgencrativc discases are associatcd with oxidative stress and it is believed that the free radicais, lipid peroxidation products and changes in membrane fluidity may inhibit the enzyme Na+, K + -ATPase, causing the cell suftcring a dcficit of cncrgy. Thc dcficiency of ccrtain protcins as GFAP sccm to makc astrocytes iess efficient in dealing with states of injury in the CNS, and some research shows a decrease in phosphorylation of vimentin in human fibroblasts with NPC. MK-801 is a noncompctitive NMDA receptor, bcing considercd a primary ncurotransmitter. Thc ohjective of this study was to observe the effects of U 18666A drug, eausing the accumulation of cholcstcrol in thc eytoplasm of young rat astrocytcs and thus verify thc activity of some lysosomai hydroiases, oxidative stress parameters, energy metabolism and hyperphosphorylation of intermediate filaments (vimentin and GFAP) in astrocytes of young rat. Through Filippin staining and fluorescence microscopy and by using the software Cel!M was made visualization and quantitation of cholesterol. The hest dose U18666A which allowed thc aceumulation of cholcstcrol was 0.25 mg I mL in a 48 hour period of incubation. Rat astrocytes (NPC) incubated with the drug showed a significant increase in total cholesterol relative to the cultures without drug. The measure of activity of sphingomyclinase and bcta-glucosidasc enzymes in rat astroeytcs NPC was signiticantly lower than contrai astrocytes, which is consistent with the activity of the human NPC. Noting the changcs suftcred in thc levei of antioxidant enzymcs and oxidativc stress U 18666A observed that ieads to an increase in TBARS and carbonyl groups, but a decrease in the thiol groups as measured by sulfl1ydryl tests. Moreover, there is a decrease in SOD and CAT activity and incrcascs the production of NO, by analyzing thc activity ofthe Na+, K + -ATPase there is an inhibitory effect on this enzyme. The present results show that the accumulation of cholesterol in cell cultures induces oxidative stress, which indicates that it is potcntially toxic, confirming the results observed in othcr ncurodcgcnerative discascs. Finally, we used four different groups, with or without the use of the dmg MK-801, and found that the accumulation of cholesterol in cells leads to hyperphosphorylation FI both GFAP and vimcntin, howcver, MK-801, an NMDA antagonist acts on the glutamatc receptor, and inhibit excitotoxicity caused by U 18666A. Besides the parameters that were tcstcd in our study, as oxidative stress, antioxidant cnzymcs and encrgy mctabolism, causing the dmg to mimificar NPC other biochemical parameters of the cells, which were not tested in our study may he tested with this model animal, thus contributing to a better undcrstanding of thc diseasc. Wc can still makc use of substances that rcduec thc excitotocicidade caused by increased choiesteroi, observed in NPC, such as the NMDA receptor antagonist, MK-801, which can hecome viahle tools to aid in the treatment of ncurodcgcnerativc diseascs rclatcd to cxcitotoeicidadc glutamatcrgic.

A doença de Nicmann - Pick tipo C (DNPC) é uma desordem genética lisossomal neurodegenerativa causada pelo acúmulo de lipídios, principalmente colesterol, esfingomielina e glicoesfingolipídios no espaço perinuclear. U18666A é um agente inihidor no transporte de colesterol, que vem sendo utilizado em diversos modelos tanto in vivo quanto in vitro para mimificar DNPC, principalmente em fihrohlastos. Diversas doenças ncurodcgcncrativas estão associadas ao estresse oxidativo c acredita-se que radicais livres, produtos de lipoperoxidação e alterações na fluidez da membrana possam inibir a enzima Na+, K+-A TPase, levando a célula a um "déficit" energético. A deficiência de algumas proteínas como a GF AP parecem tornar os astrócitos menos eficientes em lidar com estados de injúrias no SNC, além de algumas pesquisas mostrarem um decréscimo na fosforilação de vimentina em fihrohlastos humanos com NPC. MK-801 é um receptor não competitivo de NMDA (N-mctil D-aspartato), sendo considerado um ncurotransmissor primário do cérebro. O objetivo desse estudo foi observar os efeitos da droga U 18666A, que causam o acúmulo de colesterol no citoplasma de astrôcitos de ratos jovens e a partir daí verificar a atividade de algumas hidrolascs lisossomais, parâmetros do estresse oxidativo, metabolismo energético e a hipelfosforilação de filamentos intermediários (GFAP e vimcntina) em astrócitos de ratos jovens. Através da coloração de Filippin c microscopia de fluorescência e através da utilização do CellM software, foi feita a visualização e quantificação do colesteroL A melhor dose de U18666A que permitiu o acúmulo de colesterol foi de 0,25 j..tg/mL em um período de incubação de 48 horas. Astrócitos de ratos incubados com a droga (DNPC) mostraram um significativo aumento de colesterol em relação aquelas culturas sem a droga. A medida da atividade da csfingomielinasc c enzimas beta-glicosidase em astrócitos de ratos com NPC foi significativamente menor do que astrócitos controle, o que é consistente com a atividade da DNPC humana. Verificando as alterações sofridas em nível de enzimas antioxidantcs c estresse oxidativo observamos que U 18666A leva a um aumento nos gmpos TBARS e Carbonil, porém a uma diminuição nos grupos tióis medidos por ensaios sulfidril. Além disso, ocorre um decréscimo na atividade de CAT e SOD e aumenta a produção de NO, ao analisarmos a atividade de Na+, K+ A TPase verifica-se um efeito inibitório na atividade dessa enzima. Os presentes resultados mostram que o acúmulo de colesterol nas culturas de células, induz o estresse oxidativo, o que indica que é potencialmente tóxico e confirma os resultados observados em outras doenças neurodegenerativas. Por fim, ao utilizarmos 4 grupos diferentes, fazendo uso ou não da droga c do MK-801 verificou-se que com o acúmulo de colesterol nas células ocorre uma hiperfosforilação dos Filamentos Intermediários, tanto de GFAP quanto de vimentina, porém o MK-801, sendo um antagonista de NMDA e agindo sobre os receptores de glutamato demonstram inibirem a cxcitotoxicidadc provocada pelo Ul8666A. Além dos parâmetros que foram testados em nosso trabalho, como extresse oxidativo, enzimas antioxidantcs c metabolismo energético, fazendo uso da droga para minriticar NPC, outros parâmetros bioquímicas das células, os quais ainda não foram testados em nossos estudos, podem ser testados com este modelo animal, contribuindo assim para uma melhor compreensão da doença. Podemos fazer uso ainda de substâncias que diminuam a excitotocicidade causada pelo aumento do colesterol, observados na NPC, a exemplo do antagonista do receptor NMDA, MK-801, podendo se tomar ferramentas viáveis para auxiliar no tratamento de doenças ncurodcgcncrativas relacionadas a cxcitotocicidadc glutamatérgica. / The Niemann - Pick type C (NPC) is a disorder genetic neurodegenerative caused by lysosomal accumulation of lipids, cspccially cholcstcrol, sphingomyclin and glycosphingolipids in the perinuclear space. U 18666A is an inhibitory agent in choiesteroi transport, which has heen used in several models hoth in vivo and in vitro to mimificar NPC, cspccially in fibroblasts. Various ncurodcgencrativc discases are associatcd with oxidative stress and it is believed that the free radicais, lipid peroxidation products and changes in membrane fluidity may inhibit the enzyme Na+, K + -ATPase, causing the cell suftcring a dcficit of cncrgy. Thc dcficiency of ccrtain protcins as GFAP sccm to makc astrocytes iess efficient in dealing with states of injury in the CNS, and some research shows a decrease in phosphorylation of vimentin in human fibroblasts with NPC. MK-801 is a noncompctitive NMDA receptor, bcing considercd a primary ncurotransmitter. Thc ohjective of this study was to observe the effects of U 18666A drug, eausing the accumulation of cholcstcrol in thc eytoplasm of young rat astrocytcs and thus verify thc activity of some lysosomai hydroiases, oxidative stress parameters, energy metabolism and hyperphosphorylation of intermediate filaments (vimentin and GFAP) in astrocytes of young rat. Through Filippin staining and fluorescence microscopy and by using the software Cel!M was made visualization and quantitation of cholesterol. The hest dose U18666A which allowed thc aceumulation of cholcstcrol was 0.25 mg I mL in a 48 hour period of incubation. Rat astrocytes (NPC) incubated with the drug showed a significant increase in total cholesterol relative to the cultures without drug. The measure of activity of sphingomyclinase and bcta-glucosidasc enzymes in rat astroeytcs NPC was signiticantly lower than contrai astrocytes, which is consistent with the activity of the human NPC. Noting the changcs suftcred in thc levei of antioxidant enzymcs and oxidativc stress U 18666A observed that ieads to an increase in TBARS and carbonyl groups, but a decrease in the thiol groups as measured by sulfl1ydryl tests. Moreover, there is a decrease in SOD and CAT activity and incrcascs the production of NO, by analyzing thc activity ofthe Na+, K + -ATPase there is an inhibitory effect on this enzyme. The present results show that the accumulation of cholesterol in cell cultures induces oxidative stress, which indicates that it is potcntially toxic, confirming the results observed in othcr ncurodcgcnerative discascs. Finally, we used four different groups, with or without the use of the dmg MK-801, and found that the accumulation of cholesterol in cells leads to hyperphosphorylation FI both GFAP and vimcntin, howcver, MK-801, an NMDA antagonist acts on the glutamatc receptor, and inhibit excitotoxicity caused by U 18666A. Besides the parameters that were tcstcd in our study, as oxidative stress, antioxidant cnzymcs and encrgy mctabolism, causing the dmg to mimificar NPC other biochemical parameters of the cells, which were not tested in our study may he tested with this model animal, thus contributing to a better undcrstanding of thc diseasc. Wc can still makc use of substances that rcduec thc excitotocicidade caused by increased choiesteroi, observed in NPC, such as the NMDA receptor antagonist, MK-801, which can hecome viahle tools to aid in the treatment of ncurodcgcnerativc diseascs rclatcd to cxcitotoeicidadc glutamatcrgic.

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