Doctor of Philosophy / Department of Anatomy and Physiology / Timothy I. Musch / Nitric oxide (NO) is synthesized via distinct NO synthase (NOS) enzymes and constitutes an essential cardiovascular signaling molecule. Whereas important vasomotor contributions of endothelial NOS (eNOS) have been well-described, the specific vasomotor contributions of nNOS-derived NO in healthy subjects during exercise are unknown. The purpose of this dissertation is to test the global hypothesis that nNOS-derived NO is a critical regulator of exercising skeletal muscle vascular control. Specifically, we utilized the selective nNOS inhibitor S-methyl-L-thiocitrulline (SMTC) to investigate the effects of nNOS-derived NO on skeletal muscle vascular function within established rodent models of exercise performance. The first investigation (Chapter 2) identifies that nNOS inhibition with SMTC increases mean arterial pressure (MAP) and reduces rat hindlimb skeletal muscle blood flow at rest whereas there are no effects during low-speed (20 m/min) treadmill running. In Chapter 3 it is reported that nNOS inhibition with SMTC reduces blood flow during high-speed treadmill running (>50 m/min) with the greatest relative effects found in highly glycolytic fast-twitch muscles and muscle parts. Chapter 4 demonstrates that nNOS-derived NO modulates contracting skeletal muscle blood flow (increases), O2 consumption (VO2, increases), and force production (decreases) in the rat spinotrapezius muscle and thus impacts the microvascular O2 delivery-VO2 ratio (which sets the microvascular partial pressure of O2, PO2mv, and represents the pressure head that drives capillary-myocyte O2 diffusion). In Chapter 5 we report that systemic administration of the selective nNOS inhibitor SMTC does not impact lumbar sympathetic nerve discharge. This reveals that the SMTC-induced peripheral vascular effects described herein reflect peripheral nNOS-derived NO signaling as opposed to centrally-derived regulation. In conclusion, nNOS-derived NO exerts exercise-intensity and muscle fiber-type selective peripheral vascular effects during whole-body locomotor exercise. In addition, nNOS-derived NO modulates skeletal muscle contractile and metabolic function and, therefore, impacts the skeletal muscle PO2mv. These data identify novel integrated roles for nNOS-derived NO within healthy skeletal muscle and have important implications for populations associated with reduced NO bioavailability and/or impaired nNOS structure and/or function specifically (e.g., muscular dystrophy, chronic heart failure, advanced age, etc.).

Satellite precursor cells are normally quiescent but once activated they support skeletal muscle growth and regeneration by proliferating and differentiating into myoblasts. When an animal suffers from a muscle injury, quiescent satellite precursor cells are activated by nitric oxide (NO). MyoNovin (1-(3,4-Bis-nitrooxy-butoxy)-2-methoxy-benzene), as a NO donor, was developed to provide nitric oxide directly to the skeletal muscle and has been shown to promote satellite cell activation. A potential drawback of the current MyoNovin molecule is its poor water solubility. The aim of this work was to enhance the water-solubility of MyoNovin in order to improve its ease of formulation and possibly enhance its biological activity. The structure of MyoNovin (MN1) was modified with three different functional groups - methanesulfonyl (MN2), benzoic acid (MN3) and acetamide (MN4). The three novel MyoNovin analogs were identified and shown to have similar biological activity as with MyoNovin. All three MyoNovin analogs were found to have better water solubility.#Based on these results, two of the MyoNovin analogs (MN2 and MN3) had much better biological activity with respect to satellite activation and much improved water solubility and may be the most promising candidates for future studies. / May 2015

The principle product of each NOS is nitric oxide. However, under conditions of substrate and cofactor deficiency the enzymes directly catalyze superoxide formation. Considering this alternative chemistry of each NOS, the effects of each single enzyme on key events of atherosclerosis are difficult to predict. Here, we evaluate nitric oxide and superoxide production by all three NOS isoforms in atherosclerosis. ESR measurements of circulating and vascular wall nitric oxide production showed significantly reduced nitric oxide levels in apoE/eNOS double knockout (dko) and apoE/iNOS dko animals but not in apoE/nNOS dko animals suggesting that eNOS and iNOS majorly contribute to vascular nitric oxide production in atherosclerosis. Pharmacological inhibition and genetic deletion of eNOS and iNOS reduced vascular superoxide production suggesting that eNOS and iNOS are uncoupled in atherosclerotic vessels. Though genetic deletion of nNOS did not alter superoxide production, acute inhibition of nNOS showed that nNOS contributes significantly to superoxide production. In conclusion, uncoupling of eNOS occurs in apoE ko atherosclerosis but eNOS mediated superoxide production does not outweigh the protective effects of eNOS mediated nitric oxide production. We show that although nNOS is not a major contributor of the vascular nitric oxide formation, it prevents atherosclerosis development. Acute inhibition of nNOS showed a significant reduction of superoxide formation suggesting that nNOS is uncoupled. The exact mechanism of action of nNOS in atheroprotection is yet to be elucidated. Genetic deletion of iNOS reduced NADPH oxidase activity. Thus, iNOS has both direct and indirect proatherosclerotic effects, as it directly generates both nitric oxide and superoxide simultaneously resulting in peroxynitrite formation and indirectly modulates NADPH oxidase activity. We hypothesize that eNOS is coupled in the disease free regions of the vessel and contributes to nitric oxide generation whereas in the diseased region of the vessel it is uncoupled to produce superoxide (Figure 16). nNOS expressed in the smooth muscle cells of the plaque contributes to the local superoxide generation. iNOS expressed in smooth muscle cells and leukocytes of the plaque generates superoxide and nitric oxide simultaneously to produce the strong oxidant peroxynitrite. / Stickstoffmonoxid (NO) ist das prinzipielle Produkt aller Stickstoffmonoxid-Synthasen (NOS). Im Falle eines Mangels an Substrat (L-arginin) und Kofaktoren (Tetrahydrobiopterin, BH4) katalysieren die NOS-Enzyme direkt Superoxid (O2-). Diese Veränderung in der Radikalproduktion wird auch als Entkopplung der NOS bezeichnet. Die alternative Produktion von NO oder O2- durch die NOS bedingen, dass eine Voraussage über die Schlüsselfunktion der einzelnen Enzyme in der Entstehung der Atherosklerose schwierig ist. In unserer Studie evaluieren wir die Produktion von NO sowie O2- in atherosklerotischen Läsionen von apoE ko Mäusen und apoE/NOS doppel knockout (dko) Mäusen denen jeweils eine NOS-Isoform fehlt. Elektronen Spin Resonanz (ESR) Messungen konnten eine signifikante Reduktion sowohl des zirkulierenden, als auch der Gefäßwand eigenen Produktion von NO in apoE/eNOS dko und apoE/iNOS dko Mäusen zeigen, nicht jedoch in apoE/nNOS dko Mäusen. Dies lässt darauf schließen, dass eNOS und iNOS den hauptsächlichen Anteil der vaskulären NO-Produktion in atherosklerotischen Läsionen bewerkstelligen. Die pharmakologische Inhibierung wie auch die genetische Deletion von eNOS und iNOS führten ebenfalls zu einer reduzierten vaskulären O2- produktion, was die partielle Entkopplung beider Enzyme in atherosklerotisch veränderten Gefäßen nahe legt. Obwohl die chronische genetische Deletion von nNOS in apoE/nNOS dko die O2- Produktion nicht verändert, zeigte sich bei der akuten pharmakologischen Inhibierung von nNOS (durch L-NAANG) eine maßgebliche Beteiligung von nNOS an der O2- produktion in apoE ko Mäusen. Schlussfolgernd lässt sich sagen, dass in atherosklerotischen Gefäßen von apoE ko Tieren eine Entkopplung von eNOS statt findet, diese jedoch zu keinem Ausgleich der protektiven Effekte der eNOS vermittelten NO-Produktion führt. Unsere Ergebnisse in apoE/nNOS dko Mäusen zeigen eine atheroprotektive Rolle der nNOS, die sich nicht allein durch eine lokale, vaskuläre NO-Produktion durch das Enzym erklären lässt. Wir postulieren weitere systemisch atheroprotektive Eigenschaften der nNOS. Die signifikante Reduktion der Superoxidproduktion durch eine akute Inhibierung der nNOS weist auf eine Entkopplung der nNOS hin. Der exakte Wirkungsmechansimus von nNOS in der Atheroskleroseprävention ist weiterhin noch zu eruieren. Die genetische Deletion von iNOS führt zu einer reduzierten Aktivität der NADPH-Oxidase. Demnach sind für iNOS direkte sowie indirekte atherosklerosefördernde Effekte anzunehmen, da sie auf direktem Wege gleichzeitig NO und O2- produziert, was in einer Peroxynitritbildung resultiert. Wir stellen die Hypothese auf, dass eNOS in den läsionsfreien Gefäßregionen gekoppelt ist und dort seine atheroprotektiven Effekte durch die NO-Produktion vermittelt, während die eNOS in atherosklerotischen Läsionen entkoppelt vorliegt und hier O2- produziert (Fig. 16). iNOS, welches vor allem in den Plaques, in glatten Muskelzellen und Leukozyten zu finden ist, produziert gleichzeitig hohe Konzentrationen von O2- und NO, die als gemeinsames Endprodukt das stark oxidierende Peroxynitrit ergeben und die von uns dokumentierte proatherosklerotische Wirkung der iNOS vermittelt.

O hormônio melatonina produzido pela glândula pineal no período de escuro, participa na regulação circadiana de processos, fisiológicos e fisiopatológicos envolvendo vasos sanguíneos. Alguns destes estudos sugerem que as células endoteliais, que revestem os vasos sanguíneos são alvo para a melatonina circulante e medeiam a regulação do tônus vascular, em condições fisiológicas, e da interação neutrófilo-endotélio, em resposta a um estímulo injuriante. O óxido nítrico produzido pelas células endoteliais é um dos responsáveis por grande parte dos eventos vasculares, e a melatonina inibe a produção de óxido nítrico em diversos modelos. O objetivo deste estudo foi verificar o efeito da melatonina na produção de óxido nítrico induzido por bradicinina em células endoteliais em cultura. Para tanto, utilizamos uma técnica de cultura primária de células endoteliais de rato e através de um marcador fluorescente de óxido nítrico intracelular, mensuramos a fluorescência em microscópio confocal. Foi verificado que a melatonina e seu precursor N-acetilserotonina inibem a produção de óxido nítrico induzido por bradicinina e este efeito não ocorre pela inibição do aumento de cálcio que induz a produção de óxido nítrico. O análogo de receptores MT2 (4P-PDOT) e MT3 (5-MCA-NAT) não provocaram qualquer alteração sobre o aumento de óxido nítrico induzido por bradicinina, e a utilização do antagonista de receptores MT1 e MT2 (luzindol) não reverteu o efeito inibitório da melatonina. Portanto, nossos dados indicam que o efeito da melatonina sobre a atividade da NOS constitutiva não é mediado por receptores de membrana. Considerando que a melatonina é capaz de ligar-se à calmodulina, inibindo desta maneira a atividade da NOS endotelial constitutiva, poderíamos sugerir que este seria o mecanismo de ação. No entanto, é preciso ressaltar que tal atividade não é comprovada para a N-acetilserotonina, assim, apesar de ser este um possível mecanismo de ação, há a necessidade de demonstrar que a N-acetilserotonina está se ligando a calmodulina extraída de células endoteliais. Em resumo, neste trabalho mostramos que a melatonina em concentrações compatíveis com o pico noturno encontrado na circulação, pode modular eventos vasculares no organismo, através da inibição da produção de óxido nítrico em células endoteliais induzida por bradicinina. / Melatonin, the hormone synthesized by the pineal gland at night, signalizes darkness and modulates, in a circadian basis, blood vessels activity. Previous studies suggest that endothelial cells are the target for circulating melatonin and mediate changes in vascular tone and leukocyte-endothelial adherence properties. Melatonin effects can be mediated by several pathways, such as G protein-coupled receptors (MT1 and MT2 receptors), a putative membrane receptor, most probably an enzyme-binding site (MT3 receptor), and several intracellular mechanisms, including calmodulin binding and inhibition of constitutive and induced nitric oxide synthase. The aim of the present study was to characterize melatonin effect on the production of nitric oxide by bradykinin-stimulated endothelial cells in culture. Nitric oxide production was measured in real time at cellular level by detecting fluorescent stimulation of the probe DAF by confocal microscopy. After determining the ideal conditions for recording cumulative dose-response curves for bradykinin (1 – 100 nM) the effect of pre-incubated (1 min) melatonin and analogs was evaluated. Melatonin and its precursor, N-acetylserotonin, but not the selective ligands for receptors MT2 (4P-PDOT) and MT3 (5-MCA-NAT) receptors inhibited bradykinin-stimulated nitric oxide production. This effect was not blocked by the classical antagonist of MT1 and MT2 receptors, luzindol; excluding therefore the participation of membrane receptors. Taking into account that melatonin inhibits calmodulin activation of several enzymes, including constitutive nitric oxide synthase in brain and cerebellum, it could be suggested a similar mechanism for endothelial cells. However, this hypothesis is discussed taking into account that N-acetylserotonin was shown to do not bind neural cells calmodulin. In addition, here we discuss the relevance of the present finding according to physiological and physiopathological roles of endothelial nitridergic system. This analysis point melatonin modulation of constitutive nitric oxide synthase activity as a putative mechanism for explaining melatonin control of vascular tone.

A melatonina é produzida pela glândula pineal somente durante o escuro e atinge rapidamente a circulação, além disso, outros tecidos e células são capazes de produzir melatonina. As células endoteliais, devido a sua localização, são excelentes alvos para as ações da melatonina. O entendimento dos mecanismos de ação pelos quais a melatonina desenvolve seus efeitos sobre as células endoteliais, possibilitaria o uso desta indolamina e de seus análogos como uma importante ferramenta farmacológica. No presente trabalho, demonstramos que a melatonina em concentrações compatíveis com as encontradas na circulação durante o pico noturno de produção pela pineal, atua sobre as células endoteliais inibindo a produção de NO proveniente da enzima constitutiva (eNOS), enquanto altas concentrações de melatonina, que podem ser atingidas por exemplo pela produção por células imunocompetentes ativadas, inibem a produção induzida de NO mediada pela iNOS. A melatonina (1 nM) inibe a produção constitutiva de NO induzida por agonistas que atuam através da ativação de receptores acoplados à proteína G (histamina, carbacol e ATP/P2Y), e este efeito deve-se à inibição do aumento de [Ca2+]i por liberação de estoques intracelulares, sendo independente da ativação de receptores de melatonina. A melatonina inibe os efeitos decorrentes da produção de NO induzida por bradicinina como a produção de GMPc por células endoteliais e a vasodilatação de arteríolas \"in vivo\". A melatonina inibe a produção de NO induzida por LPS também de maneira independente da ativação de seus receptores, porém, em concentrações muito maiores (1-10 µM) do que a necessária para inibir a produção constitutiva. Estes efeitos devem-se à inibição da expressão da enzima iNOS por impedir a translocação do NF-kB ao núcleo. A vasodilatação de aortas induzida por LPS também é inibida por melatonina. Podemos concluir até o momento que as células endoteliais, devido a sua localização, são excelentes sensores para as ações da melatonina e podem auxiliar no melhor entendimento do conceito \"eixo imune-pineal\". Os estudos sobre os mecanismos pelos quais a melatonina atua em condições fisiológicas e fisiopatológicas são essenciais para se conhecer o potencial terapêutico da melatonina. / Melatonin, the darkness hormone, produced at night by the pineal gland, is also synthesized in a non-rhythmic manner by other cells. Pineal and extra-pineal melatonin reaches endothelial layer, and the understanding of its mechanism of action will improve the possibilities of using this indolamine and derivates as pharmacological tools. Here we showed that melatonin, in concentrations compatible to nocturnal melatonin surge impairs the activity of eNOS, while much higher concentrations, which can be attained by activated immune competent cells, impair the induction of iNOS synthesis. As a consequence of inhibiting eNOS we showed that melatonin inhibits vasodilation of the microcirculation induced by bradykinin. The inhibitory effect of melatonin is observed only when eNOS is activated by triggering G protein-coupled receptors (bradykinin B2, muscarinic and P2Y purine receptors). Activation of eNOS by calcium-channel operated receptors (P2X) is not blocked by melatonin. Inhibition of the transcription of iNOS results in inhibition of the LPS-induced vasodilation of rat aorta. As a matter of fact, here we show that LPS effect is dependent on the endothelial layer. The mechanism of action of melatonin in inhibiting iNOS transcription is due to block of the NF-kB pathway. Our work contributed to unravel the role of endothelium cells as targets for melatonin and as a key player in the \"immune-pineal axis\". The understanding of the concentrations ranges reached by endogenous production, i.e., the discrimination between the levels achieved during physiological and physiopathological responses, are essential for using these substances as analogous therapeutical tools.

Foram estudadas as reações de formação do NO- / HNO, estados de spin e reatividade frente a redutores dos complexos trans-[RuII(NO+)(NH3)4(L)](X)n onde L = N-heterocíclicos (IsN, Nic e ImN) ou éster de fósforo (P(OEt)3). O potencial para o par redox [RuII(NO0)]n+ / [RuII(NO-)](n-1)+ foi identificado somente para L = P(OEt)3 com valor de Ep = -0,41V. Cálculos DFT indicaram que após a redução, a espécie singleto coordenada (NO-) é formada por ser mais estável que forma tripleto (3NO-), sendo imediatamente protonada, dando origem a espécie singleto protonada (1HNO) não havendo, portanto proibição de spin para a reação de protonação do ligante, indicando comportamento diferente do observado para o ligante livre, onde a espécie 3NO- é a mais estável. Após a redução química por Zn(Hg), a espécie N2O, produto da dimerização do HNO, pôde ser identificada indicando a liberação de HNO pelo complexo trans-[RuII(NO+)(NH3)4(L)]n+. A reação de transferência de óxido nítrico entre os nitrosilo complexos onde L = IsN, Nic, ImN, P(OEt)3, P(OMe)3, P(OIsp)3 e P(OH)(OEt)2 e espécies de Fe(III) (mioglobina, hemoglobina e [FeIII(H2O)TPPS]) foi investigada, indicando a reação de nitrosilação redutiva das espécies de Fe(III), gerando como produtos os respectivos nitrosilo complexos de Fe(II) e trans-[RuIII(H2O)(NH3)4(L)]n+. A espécie binuclear [RuII(μ-NO)FeIII] foi proposta com base em resultados obtidos por polarografia de pulso diferencial (PPD) e a analise do comportamento cinético desta reação cujas constantes de velocidade específica para a formação e decaimento foram calculadas. Diferentemente das outras reações de transferência de NO descritas na literatura, foi observada a oxidação do centro metálico (RuII), indicando que o ligante NO+ pode agir como ponte para a transferência de elétrons. Esta reação pode ser uma via alternativa para a nitrosilação redutiva de heme proteínas, uma das principais vias de ação biológica do NO. / The formation reaction of NO- / HNO, spin states and reactivity towards reducing agents of the complex trans-[RuII(NO+)(NH3)4(L)]n+ where L = N-heterocyclic (IsN, Nic and ImN) or phosphorus ester (P(OEt)3). The redox potential for the redox pair [RuII(NO)]n+ / [RuII(NO-)](n-1)+ was identified only for L = P (OEt)3 with Ep = -0.41 V. DFT calculations have indicated that upon reduction, the coordinated singlet species (1NO-) is formed to be more stable than the triplet form (3NO-), being immediately protonated giving rise to singlet protonated species (1HNO). The protonation of coordinated 1NO- is not a spin forbidden reaction, indicating the different behavior observed for the free ligand, 3NO- where the species is more stable. After the chemical reduction of Zn(Hg), the s N2O, a HNO dimerization product, could be identified, indicating HNO release from the complex trans-[RuII(NO+)(NH3)4(L)]n+. The nitric oxide transfer reaction between nitrosyl complexes where L = IsN, Nic, ImN, P(OEt)3, P(OMe)3, P(OIsp)3 e P(OH)(OEt)2 and Fe(III) species (myoglobin, hemoglobin, and [FeIII(H2O)TPPS]) was investigated, indicating the reductive nitrosylation reaction of species of Fe(III) species, generating as by-products iron-nitrosyl complexes and trans-[RuIII(H2O)(NH3)4(L)]n+. The binuclear species [RuII(μ-NO)FeIII] could be identified through electrochemical techniques and their specific rate constants for its formation and decay were calculated. Unlike other NO transfer reactions described in the literature, was observed the oxidation of the metallic center (RuII), indicating that the NO+ ligand can act as a bridge for electron transfer. This reaction may be an alternative pathway for the reductive nitrosylation of heme proteins, one of the major routes for biological action of NO.

O Óxido Nítrico inalatório (iNO) é uitlizado para tratamento de várias doenças pulmonares, porém algumas evidências apóiam que esses efeitos farmacológicos do iNO podem alcançar outros leitos vasculares. Desse modo, esse estudo tem como objetivo investigar o possível efeito anti-inflamatório do iNO no modelo de edema de pata induzido por carragenina em camundongos e identificar por qual via ele desempenha essa resposta. Concluimos que o iNO foi eficaz na redução de sinais inflamatórios e houve indícios que o NO desempenha seus efeitos pela via do GMPc, pelo fato de ter aparecido um efeito potencializador na redução do edema quando associoado ao sildenafil e não com o rolipram. Esses resultados indicam que a terapia com iNO vai além dos efeitos vasculares pulmonares inicialmente descritos. / Inhaled Nitric Oxide (iNO) is useful to treat many lung diseases, but some evidences support that these pharmacological effects of iNO can reach other vasculature, beyond the pulmonary vasculature. Thus, this study aimed to investigate the possible antiinflammatory effect of inhaled nitric oxide on the mice paw edema induced by carrageenan and investigate for which way iNO is acting. We conclude that iNO was effective in reducing inflammatory signs and there are some traces that this responses occurred by cGMP way. These results indicate that the beneficial effect of inhaled nitric oxide therapy goes beyond the initially described pulmonar vascular effects.

Uma nova e promissora alternativa quimioterápica para o tratamento da doença de Chagas usando tetraaminas de rutênio (II) como transportadoras de óxido nítrico (NO) ou Benznidazol (Bz) são apresentados aqui. Os resultados mostraram que os complexos do tipo trans-[Ru(NO)(NH3)4L]n+ e cis-[Ru(NO)(bpy)2L] n+ são mais eficientes para tratar casos agudos da doença (modelo murino) que o Bz livre. Os nitrosilos trans-[Ru(NO)(NH3)4isn](BF4)3, trans-[Ru(NO)(NH3)4imN](BF4)3, cis-[Ru(NO)(bpy) 2imN](PF6)3 e cis-[Ru(NO)(bpy) 2SO3]PF6 são capazes de eliminar in vivo as formas extracelulares e intracelulares do T. cruzi tanto na corrente sanguínea quanto no tecido miocárdio, assegurando a sobrevida de 60-100% dos animais infectados em doses de 900 (400 nmol kg-1) até 3.850 vezes menores (100 nmol kg-1) que a dose considerada ótima para o Bz (385 µmol kg-1 = 100 mg kg-1). Além disso, uma concentração de trans-[Ru(NO)(NH3)4imN](BF4)3 ou cis-[Ru(NO)(bpy) 2imN](PF6)3 dez vezes menor que a recomendada pela Organização Mundial de Saúde (OMS) para tratar sangue infectado com o violeta de genciana (Vg) é capaz de eliminar 100% dos parasitos após 1 hora de incubação a 37 oC. Os experimentos conduzidos in vitro demonstraram que o NO liberado após redução ou reativos intermediários do NO são os responsáveis pelo efeito anti-proliferativo ou tripanocida. O nitrosilo trans-[Ru(NO)(NH3)4isn](BF4)3 (IC50epi = 67 µmol L-1) foi mais ativo que o nitroprussiato de sódio (SNP) (IC50epi = 244 µmol L-1) e o trans-[Ru(NO)(NH3)4imN](BF4)3 e o cis-[Ru(NO)(bpy) 2imN](PF6)3 (IC50tri = 52 e 58 µmol L-1, respectivamente) foram mais eficientes que o Vg (IC50tri = 536 µmol L-1). O transportador do Bz, trans-[Ru(Bz)(NH3)4S(IV)]n+, S(IV) = SO2, HSO3- ou SO32- (RuBz), é mais hidrosolúvel e mais ativo (IC50tri/1h = 79 ± 3 µmol L-1) que o Bz livre (IC50tri/1h = 4,800 ± 70 µmol L-1). Este complexo exibiu baixa citotoxicidade in vitro (IC50esplenócitos > 1 mmol L-1) e in vivo (400 µmol kg-1 < LD50 < 600 µmol kg-1) e a formação do derivado hidroxilamínico é mais favorável no RuBz que no Bz em 9,6 Kcal mol-1. Em diversos modelos murinos de infecção aguda, o RuBz também foi mais ativo que o Bz ainda quando somente uma dose foi administrada. Analogamente, o RuBz a uma dose 1.000 vezes que a dose ótima para o Bz provou ser suficiente para proteger todos os animais infectados, eliminando os ninhos de amastigotas nos seus corações, fígados e músculos esqueléticos. Em experimentos conduzidos com células Vero, os nitrosilos trans-[Ru(NO)(NH3)4imN](BF4)3, cis-[Ru(NO)(bpy)2imN](PF6)3 e o RuBz foram capazes de eliminar as formas intracelulares do T. cruzi e reduzir a porcentagem de células infectadas. Portanto, todos os dados observados sugerem a maior solubilidade em água somada à acessibilidade do potencial de redução do par NO2/NO3.- no RuBz são os responsáveis pela maiores atividades anti-proliferativa e tripanocida com respeito ao Bz ou Vg. Adicionalmente, cis-[Ru(NO)(bpy)2imN](PF6)3, cis-[Ru(NO)(bpy) 21-miN](PF6)3 e cis-[Ru(NO)(bpy) 2SO3]PF6 provaram ser capazes de inibir a atividade catalítica da gGAPDH de 89-97% a uma concentração de 260 µmol L-1, enquanto os complexos da série trans-[Ru(NO)(NH3)4L]n+, os precursores cis-[Ru(bpy) 2L(NO2)]n+, cis-[Ru(H2O)(bpy) 2L]n+ bem como os complexos RuBz, cis-[Ru(NO)(NH3)4 (NO2)]Cl2 não exibiram atividade inibitória significativa. / A novel and promising chemotherapeutic alternatives for the treatment of Chagas\' disease by use of ruthenium tetraammnine complexes as a carrier of nitric oxide (NO) or Benznidazole (Bz) are presented herein. The results showed that the trans- [Ru(NO)(NH3)4L]n+ and cis-[Ru(NO)(bpy) 2L] n+ compounds are more efficient in the treatment of acute cases of the disease (mouse model) than free Bz. The trans- [Ru(NO)(NH3)4isn](BF4)3, trans-[Ru(NO)(NH3)4imN](BF4)3, cis- [Ru(NO)(bpy) 2imN](PF6)3, and cis-[Ru(NO)(bpy) 2SO3]PF6 are able to eliminate, in vivo, extracelullar as well as intracellular forms of T. cruzi in the bloodstream and myocardium tissue and to assure the survival of 60-100% of infected mice at doses of 900 (400 nmol kg-1) up to 3,850 fold smaller (100 nmol kg-1) than that considered the optimal dose for Bz (385 µmol kg-1 = 100 mg kg-1). Furthermore, a dose of trans-[Ru(NO)(NH3)4imN](BF4)3 or cis-[Ru(NO)(bpy) 2imN](PF6)3 ten-fold smaller than that recommended by World Health Organization (WHO) for gentian violet, Vg, a phenyl methane currently recommended by WHO in the treatment of blood banks in endemic and non-endemic areas to prevent the transmission of Chagas\' disease by blood transfusion, is able to lyses 100% of the parasites after 1 hour of incubation. The tests conducted in vitro demonstrated that the NO liberated upon reduction of these nitrosyls is responsible for the observed antiproliferative and trypanocidal activities. The trans-[Ru(NO)(NH3)4isn](BF4)3 (IC50epi = 67 µmol L-1) was found to be more efficient than the classic NO-donor, sodium nitroprusside (SNP) (IC50epi = 244 µmol L-1) and trans-[Ru(NO)(NH3)4imN](BF4)3 and cis-[Ru(NO)(bpy) 2imN](PF6)3 (IC50try = 52 and 58 µmol L-1, respectively) were more efficient than the gentian violet (IC50try = 536 µmol L-1). The Bz carrier, trans-[Ru(Bz)(NH3)4S(IV)] n+, S(IV) = SO2, HSO3 - or SO3 -2 (RuBz), is more hydrosoluble and more active (IC50try/1h = 79 ±?3 µmol L-1) than free Bz (IC50try/1h = 4,800 ±?70 µmol L-1). This complex exhibits low acute citotoxicity in vitro (IC50trysplenocytes > 1 mmol L-1) and in vivo (400 µmol kg-1 < LD50try < 600 µmol kg-1) and the formation of hydroxylamine is more favorable in RuBz than in Bz by 9.6 Kcal mol-1. In murine acute models of Chagas\' disease, RuBz also was more active than Bz even when only one dose was administrated. Moreover, RuBz at a thousand-fold smaller concentration than the considered optimal dose for Bz proved to be sufficient to protect all infected mice, eliminating the amastigotes nests in their hearts, livers, and skeletal muscles as observed in H?E micrographics. Experiments conduced with infected Vero cells, the trans- [Ru(NO)(NH3)4imN](BF4)3, cis-[Ru(NO)(bpy) 2imN](PF6)3, and RuBz are able to eliminate the intracellular forms of T. cruzi and to reduce the percentage of infected cells. In all, the observed data strongly suggest that the higher solubility in water and accessibility for reduction of NO2/NO2 .- couple in RuBz are responsible for higher antriproliferative and trypanocidal activities regarding to Bz or Vg. Additionally, the cis- [Ru(NO)(bpy) 2imN](PF6)3, cis-[Ru(NO)(bpy) 21-miN](PF6)3, and cis- [Ru(NO)(bpy) 2SO3]PF6 proved to be able to inhibit the catalytic activity of gGAPDH of 89-97% at a concentration of 260 µmol L-1, whereas their precursors cis- [Ru(bpy) 2L(NO2)]n+ and cis-[Ru(H2O)(bpy) 2L]n+ and the trans-[Ru(NO)(NH3)4L] 3+ and cis-[Ru(NO)(NH3)4 (NO2)]Cl2 nitrosyls and RuBz complex do not exhibited significative inhibition.

O ancoramento do complexo trans-[RuIII(NH3)4(SO4)ina]Cl em dendrímeros PAMAM de geração 0 e 2 (G0 e G2) foi realizada por meio de uma ligação peptídica, e esses produtos foram submetidos à reação com NO(g) gerando os respectivos nitrosilo complexos G0/RuNO e G2/RuNO. A caracterização desses compostos por infravermelho, UV-vis, voltametria cíclica, RMN de 1H e 13C, e análise elementar indica que os nitrosilo complexos foram imobilizados na superfície dos PAMAM G0 e G2. Os espectros de infravermelho para G0/RuNO e G2/RuNO apresentaram apenas um estiramento &nu;NO+, respectivamente em 1933 e 1937 cm-1, e para o produto RuNO (não ligado ao dendrímero) em 1933 cm-1. O espectro eletrônico para esses três compostos apresentou bandas nas regiões de 230, 270 e 330 nm, e por meio de voltametria cíclica observou-se o processo eletroquímico relativo a NO+/NO0 com ENO+/NO0 vs ECS igual a -0,173 V para G0/RuNO, -0,178 V G2/RuNO e -0,175 V para RuNO. O espectro de 1H RMN do complexo RuNO apresentou dois dubletos com deslocamentos químicos centrados em 8,73 e 8,35 ppm, referentes aos hidrogênios aromáticos respectivamente nas posições orto e meta do ligante ina coordenado ao metal. Para G0/RuNO e G2/RuNO esses sinais foram observados em 8,73 e 8,36 ppm, e os sinais referentes aos dendrímeros nesses produtos foram verificados entre 2,7 e 4,0 ppm. O espectro de RMN 13C para o complexo RuNO apresentou quatro sinais, e para G0/RuNO e G2/RuNO, respectivamente, dez e doze sinais, conforme esperado para esses compostos. Apesar dos resultados supracitados indicarem que o ancoramento ocorreu de forma satisfatória, os dados de análise elementar apresentaram desvios significativos entre o valor teórico e o experimental, principalmente para G2/RuNO. Em adição, foram realizados ensaios em células do baço de camundongos para verificar a toxicidade dos nitrosilo complexos às células saudáveis, e os resultados indicaram baixa citotoxicidade (<15%) para RuNO, G0/RuNO e G2/RuNO. Também foram realizados experimentos sobre a atividade in vitro desses compostos contra os parasitos Trypanosoma cruzi e Leishmania major. Os melhores resultados, ainda que preliminares, foram obtidos com a maior concentração, 200&micro;M (em relação à Ru), em que observou-se atividade tripanocida (média) em torno de 88% para G2/RuNO, 82% para G0/RuNO e 72% para RuNO, enquanto que para o Bz (referência) esse valor foi de 96%. Já a atividade leishmanicida (concentração de 200&micro;M) desses compostos ficou entre 60 a 70% (65% para G2RuNO, 69% para G0/RuNO e 60% para RuNO). / The anchoring of the complex trans-[RuIII(NH3)4(SO4)ina]Cl on PAMAM dendrimers of generation 0 and 2 (G0 and G2) was performed by a peptide bond, and the products were submitted to reaction with NO (g) generating the related nitrosyl complexes G0/RuNO and G2/RuNO. The characterization of these compounds by IR, UV-vis, cyclic voltammetry, 1H and 13C NMR, and elemental analysis indicated that the nitrosyl complexes were immobilized on the surface of PAMAM G0 and G2. Infrared spectra for G0/RuNO and G2/RuNO showed only one &nu;NO+ band in 1933 and 1937 cm-1 respectively, and for RuNO (complex not bounded to the dendrimer) at 1933 cm-1. Electronic spectra for these three compounds showed bands in the regions of 230, 270 and 330 nm, and by cyclic voltammetry it was possible to observe the electrochemical process relative to NO+/NO0 with ENO+/NO0 equal to -0.173 V vs SCE for G0/RuNO , -0.178 V for G2/RuNO and -0.175 V for RuNO. The 1H NMR spectra for RuNO complex showed two doublets with chemical shifts centered at 8.73 and 8.35 ppm, respectively referring to the aromatic hydrogens in the ortho and meta positions of the ina ligand coordinated to the metal. The same signals obtained for G0/RuNO and G2/RuNO were observed in 8.73 and 8.36 ppm, and signals related to dendrimers between 2.7 and 4.0 ppm. The 13C NMR spectrum for RuNO exhibited four signals, and for G0/RuNO and G2/RuNO, respectively, ten and twelve signals, as expected for these compounds. Despite the results above, which indicate that anchoring occurred satisfactorily, the elemental analysis showed significant deviations between the theoretical and experimental values, especially for G2/RuNO. In adition, in vitro assays were performed on mice spleen cells to determine the toxicity of the nitrosyl complex to healthy cells, and the results showed low cytotoxicity (<15%) for RuNO, G0/RuNO and G2/RuNO. In vitro experiments were also carried out to determine the activity of these compounds against the parasite Trypanosoma cruzi and Leishmania major. The best results (preliminary) were obtained with the highest concentration 200&micro;M (relative to Ru), which was observed trypanocidal activity (average) around 88% for G2/RuNO, 82% for G0/RuNO and 72% for RuNO, while for Bz (reference) it was around 96%. The leishmanicidal activity (concentration of 200&micro;M) of these compounds was in the range of 60 to 70% (65% for G2RuNO, 69% for G0/RuNO and 60% for RuNO).

Foram investigadas as propriedades, a reatividade e a estrutura eletrônica dos complexos trans-[RuII(NH3)4(L)(NO)](X)3 [(1) L = 4-pic, (2) L = P(OEt)3] e trans-[RuIII(NH3)4(4-pic)(L\')](CF3SO3)3 [(3) L\' = NH3, (4) L\' = H2O] através de técnicas espectroscópicas, eletroquímicas e cálculos teóricos. A reatividade dos complexos foi avaliada com glutationa (GSH) e L-cisteína (CisSH). Nitroxil (HNO) e óxido nítrico (NO&bull;) são os produtos da reação entre os complexos 1 e 2 com GSH e CisSH em solução aquosa (pH 4,0 e 7,5). Óxido nítrico, livre (NO&bull;) e coordenado (RuII-NO&bull;), foi identificado através de quimiluminescência (NOA) e EPR, respectivamente. HNO foi sugerida indiretamente por RMN 15N após a identificação da formação de amônia (NH3), hidroxilamina (NH2OH) e sulfinamida (GS(O)NH2). Os complexos 3 e 4 foram isolados e estudados experimentalmente por EPR, UV-vis, Voltametria Cíclica, Cristalografia de Raios X e teoricamente por LFT e DFT. A acidez (pKa) e a constante de substituição do ligante H2O pelo íon Cl- no complexo 3 foram calculados como 3,65 ± 0.05 (25 °C) e 2,5×10-4 M-1s-1 (55 ºC), respectivamente. Os espectros de EPR do complexo 3 apresentaram uma simetria axial (g&perp; &gt; g||) mas com um crescente componente rômbico que demonstrou ser função da basicidade do solvente e da sua interação com o ligante H2O. Não foi observado efeito similar para o complexo 4 ou mesmo para o complexo [RuIII(NH3)5(H2O)](CF3SO3)3. A partir de cálculos de DFT demonstrou-se que a capacidade doadora &pi; do ligante H2O é intensificada quando a interação com moléculas do solvente promove sua rotação no eixo de ligação N(pic)-Ru-O(aq) contendo o ligante receptor &pi; 4-picolina. Uma análise usando LFT demonstrou que de fato um componente rômbico pode ser evidenciado de uma simetria C2v por uma simples torção do ligante H2O no eixo C2. Os complexos 3 e 4 também foram investigados quanto a sua capacidade de oxidar glutationa em solução aquosa nos pH 4,0 e 7,5. A reação teve como produtos os íons trans-[RuII(NH3)4(4-pic)(H2O)]2+(&lambda;max = 394 nm, &epsilon; = 5400 M-1cm-1) e [RuII(NH3)5(4-pic)]2+ (&lambda;max = 399 nm, &epsilon; = 6400 M-1cm-1) identificados por UV-vis, além de GSSG, originado da reação do radical GSo, e identificado por RMN 1H. A velocidade da formação dos complexos de Ru(II) nestas reações apresentou-se mais lenta na presença de EDTA porém voltando a aumentar com a adição do captador de radical PBN. Respectivamente, essas variações foram atribuídas ao efeito catalítico promovido por íons de metais de transição em solução e à captação do radical GS&bull;, potencialmente um agente oxidante dos complexos de Ru(II). / The proprieties, reactivity and electronic structure of trans-[RuII(NH3)4(L)(NO)](X)3 [(1) L = 4-pic, (2) L = P(OEt)3] e trans-[RuIII(NH3)4(4-pic)(L\')](CF3SO3)3 [(3) L\' = NH3, (4) L\' = H2O] were studied through spectroscopic and electrochemical techniques, and theoretical calculations. The reactivity study of these complexes was performed with the glutathione (GSH) and L-cysteine (CisSH). Nitroxil (HNO) and nitric oxide (NO &bull;) are the products from the reaction of 1 and 2 with GSH and CisSH in aqueous solution (pH 4.0 and 7.5). Free nitric oxide (NO &bull;) and coordinated nitric oxide (RuII-NO &bull;) were identified by chemiluminescence (NOA) and EPR, respectively. HNO was indirectly suggested by 15N NMR data by identifying ammonia (NH3), hydroxylamine (NH2OH) and sulfinamide (RS(O)NH2). The complexes 3 and 4 were isolated and studied experimentally by EPR, UV-vis, cyclic voltammetry, X-Ray Crystallography and theoretically by DFT and LFT. The acidity (pKa), and the constant replacement of the H2O ligand in the complex 3 by the ion Cl- were calculated as 3,65 ± 0.05 (25 °C) and 2.5 × 10-4 M-1s-1 (55 °C), respectively. The EPR spectra of complex 3 showed an axial symmetry (g&perp; &gt; g||) but with a growing rhombic component that proved to be due to the solvent basicity and its interaction with the H2O ligand. No similar effect was observed for the compound 4 or to the [RuIII(NH3)5(H2O)](CF3SO3)3 complex. According to DFT calculations the H2O &pi;-donor ability increased when the interaction with solvent molecules promotes its rotation on the bonding axis N(pic)-Ru-O(aq) containing the pi;-acceptor ligand 4-picoline. A LFT analysis showed that a rhombic component can be evidenced in a C2v symmetry by a simple twist of the H2O ligand in the C2 axis. The complexes 3 and 4 were also investigated for their ability to oxidize glutathione in aqueous solution at pH 4.0 and 7.5. The reaction produced the trans-[RuII(NH3)4(4-pic)(H2O)]2+ (&lambda; max = 394 nm, &epsilon; = 5400 M-1cm-1) and [RuII(NH3)5(4-pic)]2+ (&lambda; ;max = 399 nm, &epsilon; = 6400 M-1cm-1), besides of GSSG, originated from GSo radical reaction, which was identified by 1H NMR. The rate for Ru(II) formation in these reactions were slower in the presence than in absence of EDTA. This late effect can be reduce by the addition of the radical scavenger PBN. These variations have been interpreted respectively on basis of the transition metal ions catalytic effect and to the scavenger of GS &bull; radical, a potentially oxidizing agent of Ru(II) complexes.