PAULO, T. F.; DIÓGENES, I. C. N. 5-(4-PIRIDIL)-1,3,4-(OXADIAZOL)-2-TIOL E Na3[Fe(CN)5Hpyt].3H2O: Síntese, caracterização e estudos de formação de monocamadas automontadas. 2007. 85 f. Dissertação (Mestrado em Química Inorgânica) - Centro de Ciências, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2007. / Submitted by José Jairo Viana de Sousa (jairo@ufc.br) on 2014-10-15T17:50:25Z No. of bitstreams: 1 2007_dis_tfpaulo.pdf: 2052309 bytes, checksum: bfeda1bf390b31ae8ba8c29ee74f6e40 (MD5) / Approved for entry into archive by José Jairo Viana de Sousa(jairo@ufc.br) on 2015-10-22T23:18:53Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2007_dis_tfpaulo.pdf: 2052309 bytes, checksum: bfeda1bf390b31ae8ba8c29ee74f6e40 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-10-22T23:18:53Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2007_dis_tfpaulo.pdf: 2052309 bytes, checksum: bfeda1bf390b31ae8ba8c29ee74f6e40 (MD5) Previous issue date: 2007 / -(4-pyridinyl)-1,3,4-oxadiazole-2-thiol (Hpyt) and [Fe(CN)5Hpyt]3- (FeHpyt) species spontaneously adsorbed on gold forming SAM (Self-Assembled Monolayers) that, based on electrochemical data, contain pinholes through which [Fe(CN)6]4– and [Ru(NH3)6]3+ probe molecules access the underlying gold electrode. From the former molecule and the dependence of the faradaic current on the pH value of the electrolyte solution, the surface pKa of the Hpyt SAM was evaluated as 4.2. Taking into account the STM (Scanning tunneling Microscopy) results obtained for the Hpyt SAM on Au(111), it was possible to estimate that the Hpyt molecules are adsorbed in an hexagonal arrangement with an average distance between the sulfur atoms of 5.5 Å. These images also showed the presence of pinholes, which indicate that a strong lateral interaction does not effectively happen. The thermodynamics parameters ΔHads, ΔGads and ΔSads of the Hpyt and FeHpyt adsorption process were calculated from the correlation between the concentration of the adsorbates on the surface (Γ) and in solution (C) at different temperatures. The surface coverage data were obtained from the reductive desorption process RS-Au + e- �� RS- + Au°, where R = Hpyt or FeHpyt, observed at -555 and -566 mV vs Ag|AgCl|Cl- for Hpyt and FeHpyt SAM, respectively, indicating an enhancement of the Au–S bond as consequence of the π-backbonding interaction from iron metal center toward the Hpyt moiety. The heterogeneous electron transfer reaction of cytochrome c metalloprotein was successfully assessed by Hpyt and FeHpyt and SAM, presenting a quasi-reversible voltammograms with potentials consistent with the native form of the protein. / As espécies 5-(4-piridil)-1,3,4-oxadiazol-2-tiol (Hpyt) e [Fe(CN)5Hpyt]3- (FeHpyt) adsorvem espontaneamente sobre ouro formando monocamadas automontadas (SAM - "Self-Assembled Monolayers") das quais, de acordo com os dados eletroquímicos, apresentam defeitos ou nanoporos por onde as moléculas de prova [Fe(CN)6]4– e [Ru(NH3)6]3+ acessam a superfície do eletrodo de ouro policristalino. A partir dessas moléculas de prova e da dependência entre a corrente faradáica e o pH do eletrólito, o pKa da monocamada de Hpyt foi calculada como 4,2. A partir dos resultados de microscopia de tunelamento STM (Scanning Tunneling Microscopy) obtidos para a monocamada automontada de Hpyt sobre Au(111) foi possível estimar que as moléculas de Hpyt são adsorvidas em um arranjo hexagonal com um espaçamento médio entre os átomo de enxofre de 5,5 Å. Essas imagens também mostraram a presença de nanoporos, do qual indica que fortes interações laterais não ocorrem efetivamente. Os parâmetros termodinâmicos ΔHads, ΔGads e ΔSads para o processo de adsorção das moléculas Hpyt e FeHpyt foram calculados a partir da correlação entre a concentração dos adsorbatos na superfície (Γ) e em solução (C) para diferentes temperaturas. A quantidade de moléculas adsorvidas foi calculada a partir do processo de desorção redutiva, onde R = Hpyt ou FeHpyt, observados em -555 e -566 mV versus Ag|AgCl|Cl- para as monocamadas de Hpyt e FeHpyt, respectivamente, indicando um fortalecimento da ligação Au–S como conseqüência do efeito π-backbonding do centro metálico ferro para o ligante Hpyt. A reação heterogênea de transferência de elétrons da metaloproteína citocromo c foi satisfatoriamente acessada pelas monocamadas de Hpyt e FeHpyt, apresentando um voltamograma quasi-reversível com potenciais consistentes com a forma nativa desta proteína.

Orientador: Marcelo Ganzarolli de Oliveira / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Quimica / Made available in DSpace on 2018-08-03T18:40:46Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Santos_LaisCalixto_M.pdf: 2754582 bytes, checksum: 3e5a0b76c65b57922b3dcf752598ce63 (MD5) Previous issue date: 2003 / Mestrado

Foram investigadas as propriedades, a reatividade e a estrutura eletrônica dos complexos trans-[RuII(NH3)4(L)(NO)](X)3 [(1) L = 4-pic, (2) L = P(OEt)3] e trans-[RuIII(NH3)4(4-pic)(L\')](CF3SO3)3 [(3) L\' = NH3, (4) L\' = H2O] através de técnicas espectroscópicas, eletroquímicas e cálculos teóricos. A reatividade dos complexos foi avaliada com glutationa (GSH) e L-cisteína (CisSH). Nitroxil (HNO) e óxido nítrico (NO•) são os produtos da reação entre os complexos 1 e 2 com GSH e CisSH em solução aquosa (pH 4,0 e 7,5). Óxido nítrico, livre (NO•) e coordenado (RuII-NO•), foi identificado através de quimiluminescência (NOA) e EPR, respectivamente. HNO foi sugerida indiretamente por RMN 15N após a identificação da formação de amônia (NH3), hidroxilamina (NH2OH) e sulfinamida (GS(O)NH2). Os complexos 3 e 4 foram isolados e estudados experimentalmente por EPR, UV-vis, Voltametria Cíclica, Cristalografia de Raios X e teoricamente por LFT e DFT. A acidez (pKa) e a constante de substituição do ligante H2O pelo íon Cl- no complexo 3 foram calculados como 3,65 ± 0.05 (25 °C) e 2,5×10-4 M-1s-1 (55 ºC), respectivamente. Os espectros de EPR do complexo 3 apresentaram uma simetria axial (g⊥ > g||) mas com um crescente componente rômbico que demonstrou ser função da basicidade do solvente e da sua interação com o ligante H2O. Não foi observado efeito similar para o complexo 4 ou mesmo para o complexo [RuIII(NH3)5(H2O)](CF3SO3)3. A partir de cálculos de DFT demonstrou-se que a capacidade doadora π do ligante H2O é intensificada quando a interação com moléculas do solvente promove sua rotação no eixo de ligação N(pic)-Ru-O(aq) contendo o ligante receptor π 4-picolina. Uma análise usando LFT demonstrou que de fato um componente rômbico pode ser evidenciado de uma simetria C2v por uma simples torção do ligante H2O no eixo C2. Os complexos 3 e 4 também foram investigados quanto a sua capacidade de oxidar glutationa em solução aquosa nos pH 4,0 e 7,5. A reação teve como produtos os íons trans-[RuII(NH3)4(4-pic)(H2O)]2+(λmax = 394 nm, ε = 5400 M-1cm-1) e [RuII(NH3)5(4-pic)]2+ (λmax = 399 nm, ε = 6400 M-1cm-1) identificados por UV-vis, além de GSSG, originado da reação do radical GSo, e identificado por RMN 1H. A velocidade da formação dos complexos de Ru(II) nestas reações apresentou-se mais lenta na presença de EDTA porém voltando a aumentar com a adição do captador de radical PBN. Respectivamente, essas variações foram atribuídas ao efeito catalítico promovido por íons de metais de transição em solução e à captação do radical GS•, potencialmente um agente oxidante dos complexos de Ru(II). / The proprieties, reactivity and electronic structure of trans-[RuII(NH3)4(L)(NO)](X)3 [(1) L = 4-pic, (2) L = P(OEt)3] e trans-[RuIII(NH3)4(4-pic)(L\')](CF3SO3)3 [(3) L\' = NH3, (4) L\' = H2O] were studied through spectroscopic and electrochemical techniques, and theoretical calculations. The reactivity study of these complexes was performed with the glutathione (GSH) and L-cysteine (CisSH). Nitroxil (HNO) and nitric oxide (NO •) are the products from the reaction of 1 and 2 with GSH and CisSH in aqueous solution (pH 4.0 and 7.5). Free nitric oxide (NO •) and coordinated nitric oxide (RuII-NO •) were identified by chemiluminescence (NOA) and EPR, respectively. HNO was indirectly suggested by 15N NMR data by identifying ammonia (NH3), hydroxylamine (NH2OH) and sulfinamide (RS(O)NH2). The complexes 3 and 4 were isolated and studied experimentally by EPR, UV-vis, cyclic voltammetry, X-Ray Crystallography and theoretically by DFT and LFT. The acidity (pKa), and the constant replacement of the H2O ligand in the complex 3 by the ion Cl- were calculated as 3,65 ± 0.05 (25 °C) and 2.5 × 10-4 M-1s-1 (55 °C), respectively. The EPR spectra of complex 3 showed an axial symmetry (g⊥ > g||) but with a growing rhombic component that proved to be due to the solvent basicity and its interaction with the H2O ligand. No similar effect was observed for the compound 4 or to the [RuIII(NH3)5(H2O)](CF3SO3)3 complex. According to DFT calculations the H2O π-donor ability increased when the interaction with solvent molecules promotes its rotation on the bonding axis N(pic)-Ru-O(aq) containing the pi;-acceptor ligand 4-picoline. A LFT analysis showed that a rhombic component can be evidenced in a C2v symmetry by a simple twist of the H2O ligand in the C2 axis. The complexes 3 and 4 were also investigated for their ability to oxidize glutathione in aqueous solution at pH 4.0 and 7.5. The reaction produced the trans-[RuII(NH3)4(4-pic)(H2O)]2+ (λ max = 394 nm, ε = 5400 M-1cm-1) and [RuII(NH3)5(4-pic)]2+ (λ ;max = 399 nm, ε = 6400 M-1cm-1), besides of GSSG, originated from GSo radical reaction, which was identified by 1H NMR. The rate for Ru(II) formation in these reactions were slower in the presence than in absence of EDTA. This late effect can be reduce by the addition of the radical scavenger PBN. These variations have been interpreted respectively on basis of the transition metal ions catalytic effect and to the scavenger of GS • radical, a potentially oxidizing agent of Ru(II) complexes.

Foram investigadas as propriedades, a reatividade e a estrutura eletrônica dos complexos trans-[RuII(NH3)4(L)(NO)](X)3 [(1) L = 4-pic, (2) L = P(OEt)3] e trans-[RuIII(NH3)4(4-pic)(L\')](CF3SO3)3 [(3) L\' = NH3, (4) L\' = H2O] através de técnicas espectroscópicas, eletroquímicas e cálculos teóricos. A reatividade dos complexos foi avaliada com glutationa (GSH) e L-cisteína (CisSH). Nitroxil (HNO) e óxido nítrico (NO•) são os produtos da reação entre os complexos 1 e 2 com GSH e CisSH em solução aquosa (pH 4,0 e 7,5). Óxido nítrico, livre (NO•) e coordenado (RuII-NO•), foi identificado através de quimiluminescência (NOA) e EPR, respectivamente. HNO foi sugerida indiretamente por RMN 15N após a identificação da formação de amônia (NH3), hidroxilamina (NH2OH) e sulfinamida (GS(O)NH2). Os complexos 3 e 4 foram isolados e estudados experimentalmente por EPR, UV-vis, Voltametria Cíclica, Cristalografia de Raios X e teoricamente por LFT e DFT. A acidez (pKa) e a constante de substituição do ligante H2O pelo íon Cl- no complexo 3 foram calculados como 3,65 ± 0.05 (25 °C) e 2,5×10-4 M-1s-1 (55 ºC), respectivamente. Os espectros de EPR do complexo 3 apresentaram uma simetria axial (g⊥ > g||) mas com um crescente componente rômbico que demonstrou ser função da basicidade do solvente e da sua interação com o ligante H2O. Não foi observado efeito similar para o complexo 4 ou mesmo para o complexo [RuIII(NH3)5(H2O)](CF3SO3)3. A partir de cálculos de DFT demonstrou-se que a capacidade doadora π do ligante H2O é intensificada quando a interação com moléculas do solvente promove sua rotação no eixo de ligação N(pic)-Ru-O(aq) contendo o ligante receptor π 4-picolina. Uma análise usando LFT demonstrou que de fato um componente rômbico pode ser evidenciado de uma simetria C2v por uma simples torção do ligante H2O no eixo C2. Os complexos 3 e 4 também foram investigados quanto a sua capacidade de oxidar glutationa em solução aquosa nos pH 4,0 e 7,5. A reação teve como produtos os íons trans-[RuII(NH3)4(4-pic)(H2O)]2+(λmax = 394 nm, ε = 5400 M-1cm-1) e [RuII(NH3)5(4-pic)]2+ (λmax = 399 nm, ε = 6400 M-1cm-1) identificados por UV-vis, além de GSSG, originado da reação do radical GSo, e identificado por RMN 1H. A velocidade da formação dos complexos de Ru(II) nestas reações apresentou-se mais lenta na presença de EDTA porém voltando a aumentar com a adição do captador de radical PBN. Respectivamente, essas variações foram atribuídas ao efeito catalítico promovido por íons de metais de transição em solução e à captação do radical GS•, potencialmente um agente oxidante dos complexos de Ru(II). / The proprieties, reactivity and electronic structure of trans-[RuII(NH3)4(L)(NO)](X)3 [(1) L = 4-pic, (2) L = P(OEt)3] e trans-[RuIII(NH3)4(4-pic)(L\')](CF3SO3)3 [(3) L\' = NH3, (4) L\' = H2O] were studied through spectroscopic and electrochemical techniques, and theoretical calculations. The reactivity study of these complexes was performed with the glutathione (GSH) and L-cysteine (CisSH). Nitroxil (HNO) and nitric oxide (NO •) are the products from the reaction of 1 and 2 with GSH and CisSH in aqueous solution (pH 4.0 and 7.5). Free nitric oxide (NO •) and coordinated nitric oxide (RuII-NO •) were identified by chemiluminescence (NOA) and EPR, respectively. HNO was indirectly suggested by 15N NMR data by identifying ammonia (NH3), hydroxylamine (NH2OH) and sulfinamide (RS(O)NH2). The complexes 3 and 4 were isolated and studied experimentally by EPR, UV-vis, cyclic voltammetry, X-Ray Crystallography and theoretically by DFT and LFT. The acidity (pKa), and the constant replacement of the H2O ligand in the complex 3 by the ion Cl- were calculated as 3,65 ± 0.05 (25 °C) and 2.5 × 10-4 M-1s-1 (55 °C), respectively. The EPR spectra of complex 3 showed an axial symmetry (g⊥ > g||) but with a growing rhombic component that proved to be due to the solvent basicity and its interaction with the H2O ligand. No similar effect was observed for the compound 4 or to the [RuIII(NH3)5(H2O)](CF3SO3)3 complex. According to DFT calculations the H2O π-donor ability increased when the interaction with solvent molecules promotes its rotation on the bonding axis N(pic)-Ru-O(aq) containing the pi;-acceptor ligand 4-picoline. A LFT analysis showed that a rhombic component can be evidenced in a C2v symmetry by a simple twist of the H2O ligand in the C2 axis. The complexes 3 and 4 were also investigated for their ability to oxidize glutathione in aqueous solution at pH 4.0 and 7.5. The reaction produced the trans-[RuII(NH3)4(4-pic)(H2O)]2+ (λ max = 394 nm, ε = 5400 M-1cm-1) and [RuII(NH3)5(4-pic)]2+ (λ ;max = 399 nm, ε = 6400 M-1cm-1), besides of GSSG, originated from GSo radical reaction, which was identified by 1H NMR. The rate for Ru(II) formation in these reactions were slower in the presence than in absence of EDTA. This late effect can be reduce by the addition of the radical scavenger PBN. These variations have been interpreted respectively on basis of the transition metal ions catalytic effect and to the scavenger of GS • radical, a potentially oxidizing agent of Ru(II) complexes.

Os recém-nascidos possuem o sistema antioxidante imaturo, por haver baixa tensão de oxigênio no ambiente intrauterino durante a vida fetal. Logo após o nascimento, as alterações súbitas das condições fisiológicas e ambientais causam significativo aumento no consumo de oxigênio, desencadeando, assim, a produção de radicais livres. Tais condições promovem vulnerabilidade dos neonatos ao efeito negativo do estresse oxidativo, o que potencialmente podem prejudicar a vitalidade neonatal. O presente estudo teve como objetivo comparar o perfil antioxidante e estresse oxidativo de neonatos e fêmeas caninas no periparto eutócico vaginal ou cesariana eletiva, e avaliar a influência da condição obstétrica para o estado oxidativo. Foram selecionadas 21 cadelas gestantes, as quais, constituíram dois grupos amostrais, de acordo com a condição obstétrica: Eutocia Vaginal (n = 10) e Cesariana Eletiva (n = 11); e seus respectivos neonatos foram alocados em subgrupos de acordo com a condição obstétrica e momento do nascimento: Eutocia Vaginal Inicial (n=10), Eutocia Vaginal Final (n = 9), Cesariana Eletiva Inicial (n = 11) e Cesariana Eletiva final (n= 10). As cadelas foram avaliadas no período pródromo do parto, intraparto; uma hora e três dias pós-parto, quando amostras de sangue foram colhidas para análise do perfil antioxidante [dosagem das enzimas superóxido dismutase (SOD), glutationa peroxidase (GPx), dosagem da concentração de tióis totais e determinação do status antioxidante total(TAC)] e do estresse oxidativo [dosagem da peroxidação lipídica (TBARS) e da oxidação de proteínas]. Os neonatos foram avaliados quanto ao escore Apgar aos 0 e 60 minutos do nascimento; avaliação clínica (frequências cardíaca e respiratória; escore de tônus muscular, irritabilidade reflexa e coloração de mucosa, aferição da temperatura corporal), lactatemia sanguínea, oximetria de pulso, determinação do perfil antioxidante e do estresse oxidativo e aferição do peso corporal aos 0, 60 minutos, às 12, 24 horas e ao 3º dia pós nascimento. As cadelas do Grupo Eutocia Vaginal apresentaram maior peroxidação lipídica, oxidação de proteínas e atividade de SOD e menor atividade de GPx e concentração de tióis totais em comparação ao Grupo Cesariana Eletiva. A capacidade antioxidante total elevou-se após 1h do parto em comparação aos outros momentos de avaliação no Grupo Cesariana Eletiva. Embora os neonatos do Grupo Eutocia Vaginal tenham apresentado melhores parâmetros de vitalidade neonatal, em comparação ao Grupo Cesariana Eletiva, todos os neonatos apresentaram adequada evolução do escore Apgar, coloração de mucosa, irritabilidade reflexa, tônus muscular e oxigenação periférica após 1h do nascimento. A lactatemia sanguínea foi maior no Grupo Eutocia Vaginal, bem como nos neonatos nascidos ao final do parto. A peroxidação lipídica foi superior nos neonatos nascidos por eutocia vaginal em comparação aos nascidos por cesariana eletiva, enquanto a oxidação de proteínas mostrou-se maior nos primeiros neonatos nascidos por eutocia vaginal em comparação aos nascidos ao final do parto. Porém, resultado contrário foi verificado para o Grupo Cesariana Eletiva, pois os neonatos nascidos ao final da cirurgia apresentaram maior valor de oxidação de proteínas. Ademais, para os neonatos nascidos ao final do parto, o Grupo Cesariana Eletiva apresentou maior oxidação proteica em comparação ao Grupo Eutocia Vaginal. A atividade da GPx foi superior nos neonatos nascidos por cesariana eletiva. Em conclusão, a condição obstétrica impõe diferenças no perfil oxidativo e antioxidante em cadelas e neonatos, os quais apresentam estado oxidativo semelhante, denotando influência materna sobre o equilíbrio oxidativo dos recém-nascidos. / Newborns have an immature antioxidant system, due to low oxygen exposure in intrauterine environment during fetal life. Immediately after birth, sudden changes of physiological and environmental conditions cause a significant increase in oxygen consumption, resulting in the production of free radicals. These conditions turn the newborn vulnerable to the negative effects of oxidative stress, which potentially can impair neonatal vitality. This study aimed to compare the antioxidant profile and oxidative stress of neonates and canine females during vaginal labour or elective cesarean section, and to evaluate whether the obstetric condition influences their oxidative status. For this purpose, 21 pregnant bitches were subjected to two experimental groups, according to the obstetric condition: Vaginal Eutocia (n = 10) and Elective Cesarian Section (n = 11) and their respective newborns were allocated into subgroups according to the obstetric condition and moment of birth: Inicial Vaginal Eutocia (n=10), Final Vaginal Eutocia (n = 9), Inicial Elective Cesarian Section (n = 11) and Final Elective Cesarian Section (n= 10). Bitches were evaluated during the preparatory phase of whelping, intrapartum; one and 72 hours postpartum, when blood samples were collected for analysis of the antioxidant profile [Superoxide Dismutase (SOD) and Glutathione Peroxidase (GPx) activity enzymes assays, Total Antioxidant Capacity (TAC) assay and Total Thiols Concentration assay] and oxidative stress [lipid peroxidation (TBARS) and protein oxidation assays]. Neonates were evaluated for the Apgar score at 0 and 60 minutes of birth; clinical evaluation (heart and respiratory rates; muscle tone, irritability reflex and mucous color score; and body temperature), blood lactate, pulse oximetry, determination of antioxidant profile and oxidative stress, and body weight measurement at 0, 60 minutes, 12, 24 and 72 hours after birth. The Vaginal Eutocia bitches had higher lipid peroxidation, protein oxidation and SOD activity and lower GPx activity and total thiols concentration in comparison to the Elective Cesarian Section Group. Total antioxidant capacity was higher 1 hour postpartum compared to the others evaluation moments in the Elective Cesarian Section Group. Although neonates from the Vaginal Eutocia Group presented better neonatal vitality than those from the Elective Cesarian Section, all neonates presented adequate evolution of the Apgar score, mucous color, irritability reflex, muscle tone and pulse oximetry 1 hour postpartum. Blood lactatemia was higher in the Vaginal Eutocia Group, as well as for the last neonates. Lipid peroxidation was higher in neonates born by vaginal eutocia compared to those born by elective cesarean section, whereas protein oxidation was higher in the first neonates born by vaginal eutocia compared to those born at the end of delivery. Conversely, Elective Cesarian Section neonates born at the end of surgery had higher protein oxidation. In addition, for those neonates born at the end of delivery, the Elective Cesarian Section group presented higher protein oxidation compared to the Vaginal Eutocia group. Furthermore, GPx activity was higher in neonates born by elective caesarean section. In conclusion, the obstetric condition imposes differences in the oxidative and antioxidant profile in bitches and neonates with similar oxidative status, denoting maternal influence on the oxidative balance of the newborns.

Os recém-nascidos possuem o sistema antioxidante imaturo, por haver baixa tensão de oxigênio no ambiente intrauterino durante a vida fetal. Logo após o nascimento, as alterações súbitas das condições fisiológicas e ambientais causam significativo aumento no consumo de oxigênio, desencadeando, assim, a produção de radicais livres. Tais condições promovem vulnerabilidade dos neonatos ao efeito negativo do estresse oxidativo, o que potencialmente podem prejudicar a vitalidade neonatal. O presente estudo teve como objetivo comparar o perfil antioxidante e estresse oxidativo de neonatos e fêmeas caninas no periparto eutócico vaginal ou cesariana eletiva, e avaliar a influência da condição obstétrica para o estado oxidativo. Foram selecionadas 21 cadelas gestantes, as quais, constituíram dois grupos amostrais, de acordo com a condição obstétrica: Eutocia Vaginal (n = 10) e Cesariana Eletiva (n = 11); e seus respectivos neonatos foram alocados em subgrupos de acordo com a condição obstétrica e momento do nascimento: Eutocia Vaginal Inicial (n=10), Eutocia Vaginal Final (n = 9), Cesariana Eletiva Inicial (n = 11) e Cesariana Eletiva final (n= 10). As cadelas foram avaliadas no período pródromo do parto, intraparto; uma hora e três dias pós-parto, quando amostras de sangue foram colhidas para análise do perfil antioxidante [dosagem das enzimas superóxido dismutase (SOD), glutationa peroxidase (GPx), dosagem da concentração de tióis totais e determinação do status antioxidante total(TAC)] e do estresse oxidativo [dosagem da peroxidação lipídica (TBARS) e da oxidação de proteínas]. Os neonatos foram avaliados quanto ao escore Apgar aos 0 e 60 minutos do nascimento; avaliação clínica (frequências cardíaca e respiratória; escore de tônus muscular, irritabilidade reflexa e coloração de mucosa, aferição da temperatura corporal), lactatemia sanguínea, oximetria de pulso, determinação do perfil antioxidante e do estresse oxidativo e aferição do peso corporal aos 0, 60 minutos, às 12, 24 horas e ao 3º dia pós nascimento. As cadelas do Grupo Eutocia Vaginal apresentaram maior peroxidação lipídica, oxidação de proteínas e atividade de SOD e menor atividade de GPx e concentração de tióis totais em comparação ao Grupo Cesariana Eletiva. A capacidade antioxidante total elevou-se após 1h do parto em comparação aos outros momentos de avaliação no Grupo Cesariana Eletiva. Embora os neonatos do Grupo Eutocia Vaginal tenham apresentado melhores parâmetros de vitalidade neonatal, em comparação ao Grupo Cesariana Eletiva, todos os neonatos apresentaram adequada evolução do escore Apgar, coloração de mucosa, irritabilidade reflexa, tônus muscular e oxigenação periférica após 1h do nascimento. A lactatemia sanguínea foi maior no Grupo Eutocia Vaginal, bem como nos neonatos nascidos ao final do parto. A peroxidação lipídica foi superior nos neonatos nascidos por eutocia vaginal em comparação aos nascidos por cesariana eletiva, enquanto a oxidação de proteínas mostrou-se maior nos primeiros neonatos nascidos por eutocia vaginal em comparação aos nascidos ao final do parto. Porém, resultado contrário foi verificado para o Grupo Cesariana Eletiva, pois os neonatos nascidos ao final da cirurgia apresentaram maior valor de oxidação de proteínas. Ademais, para os neonatos nascidos ao final do parto, o Grupo Cesariana Eletiva apresentou maior oxidação proteica em comparação ao Grupo Eutocia Vaginal. A atividade da GPx foi superior nos neonatos nascidos por cesariana eletiva. Em conclusão, a condição obstétrica impõe diferenças no perfil oxidativo e antioxidante em cadelas e neonatos, os quais apresentam estado oxidativo semelhante, denotando influência materna sobre o equilíbrio oxidativo dos recém-nascidos. / Newborns have an immature antioxidant system, due to low oxygen exposure in intrauterine environment during fetal life. Immediately after birth, sudden changes of physiological and environmental conditions cause a significant increase in oxygen consumption, resulting in the production of free radicals. These conditions turn the newborn vulnerable to the negative effects of oxidative stress, which potentially can impair neonatal vitality. This study aimed to compare the antioxidant profile and oxidative stress of neonates and canine females during vaginal labour or elective cesarean section, and to evaluate whether the obstetric condition influences their oxidative status. For this purpose, 21 pregnant bitches were subjected to two experimental groups, according to the obstetric condition: Vaginal Eutocia (n = 10) and Elective Cesarian Section (n = 11) and their respective newborns were allocated into subgroups according to the obstetric condition and moment of birth: Inicial Vaginal Eutocia (n=10), Final Vaginal Eutocia (n = 9), Inicial Elective Cesarian Section (n = 11) and Final Elective Cesarian Section (n= 10). Bitches were evaluated during the preparatory phase of whelping, intrapartum; one and 72 hours postpartum, when blood samples were collected for analysis of the antioxidant profile [Superoxide Dismutase (SOD) and Glutathione Peroxidase (GPx) activity enzymes assays, Total Antioxidant Capacity (TAC) assay and Total Thiols Concentration assay] and oxidative stress [lipid peroxidation (TBARS) and protein oxidation assays]. Neonates were evaluated for the Apgar score at 0 and 60 minutes of birth; clinical evaluation (heart and respiratory rates; muscle tone, irritability reflex and mucous color score; and body temperature), blood lactate, pulse oximetry, determination of antioxidant profile and oxidative stress, and body weight measurement at 0, 60 minutes, 12, 24 and 72 hours after birth. The Vaginal Eutocia bitches had higher lipid peroxidation, protein oxidation and SOD activity and lower GPx activity and total thiols concentration in comparison to the Elective Cesarian Section Group. Total antioxidant capacity was higher 1 hour postpartum compared to the others evaluation moments in the Elective Cesarian Section Group. Although neonates from the Vaginal Eutocia Group presented better neonatal vitality than those from the Elective Cesarian Section, all neonates presented adequate evolution of the Apgar score, mucous color, irritability reflex, muscle tone and pulse oximetry 1 hour postpartum. Blood lactatemia was higher in the Vaginal Eutocia Group, as well as for the last neonates. Lipid peroxidation was higher in neonates born by vaginal eutocia compared to those born by elective cesarean section, whereas protein oxidation was higher in the first neonates born by vaginal eutocia compared to those born at the end of delivery. Conversely, Elective Cesarian Section neonates born at the end of surgery had higher protein oxidation. In addition, for those neonates born at the end of delivery, the Elective Cesarian Section group presented higher protein oxidation compared to the Vaginal Eutocia group. Furthermore, GPx activity was higher in neonates born by elective caesarean section. In conclusion, the obstetric condition imposes differences in the oxidative and antioxidant profile in bitches and neonates with similar oxidative status, denoting maternal influence on the oxidative balance of the newborns.

Submitted by Hellen Luz (hellencrisluz@gmail.com) on 2017-09-21T17:57:32Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Dissertacao_EfeitosFatorCrescimento.pdf: 20205989 bytes, checksum: 44c1e41ad424a7d873f2cf7feb0e9dad (MD5) / Rejected by Edisangela Bastos (edisangela@ufpa.br), reason: on 2017-10-10T17:00:41Z (GMT) / Submitted by Hellen Luz (hellencrisluz@gmail.com) on 2017-10-17T18:31:48Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Dissertacao_EfeitosFatorCrescimento.pdf: 20205989 bytes, checksum: 44c1e41ad424a7d873f2cf7feb0e9dad (MD5) / Approved for entry into archive by Edisangela Bastos (edisangela@ufpa.br) on 2017-11-24T14:54:19Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Dissertacao_EfeitosFatorCrescimento.pdf: 20205989 bytes, checksum: 44c1e41ad424a7d873f2cf7feb0e9dad (MD5) / Made available in DSpace on 2017-11-24T14:54:19Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Dissertacao_EfeitosFatorCrescimento.pdf: 20205989 bytes, checksum: 44c1e41ad424a7d873f2cf7feb0e9dad (MD5) Previous issue date: 2011-04-20 / CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / FAPESPA - Fundação Amazônia de Amparo a Estudos e Pesquisas / O fator de crescimento do nervo (NGF) e o glutamato têm papéis bem definidos durante o desenvolvimento do sistema nervoso e podem atuar de maneira sinérgica para induzir a sobrevivência neuronal. O NGF promove a liberação de glutamato em diferentes áreas corticais, mas pouco é conhecido sobre a regulação da liberação de glutamato por NGF na retina. Por este motivo, investigamos se NGF poderia modular a liberação de glutamato no tecido retiniano durante o seu pico de atividade neurotrófica (E10-E12). Além disso, estudamos os mecanismos de liberação de glutamato com relação a sua dependência de Ca2+ extracelular e a participação de transportadores dependentes e independentes de Na+. Uma vez que, níveis elevados de glutamato estão implicados na ocorrência de estresse oxidativo, investigamos também os efeitos de NGF sobre a liberação de compostos tióis. Para isto, tecidos retinianos íntegros de embrião de galinha (E11) foram incubados com NGF (10, 50, 100 ng/ml) por diferentes períodos de incubação (15, 30, 120). Os níveis extracelulares de glutamato e tióis foram medidos por cromatografia líquida de alta eficácia (CLAE) e ensaio colorimétrico, respectivamente. Observamos que NGF aumenta rapidamente a liberação basal de glutamato e também pode induzir a liberação de tióis em um tempo maior de incubação. De maneira interessante, o aumento dos níveis extracelulares de glutamato induzido por NGF foi revertido em meio sem Ca2+ somente em retinas tratadas por 15 min. Retinas que foram incubadas com NGF por 30 min apresentaram liberação de glutamato independente de Ca2+. Dado que, a liberação de glutamato e tióis induzida por NGF não foi bloqueada por Zn2+ e ocorreu na ausência de Na+, sugerimos o possível envolvimento do sistema independente de Na+, o trocador Xc- em ambos os processos. O aumento de tióis extracelulares induzido por NGF poderia representar um importante mecanismo protetor, possibilitando que os neurônios mantenham seu estado redox durante o desenvolvimento. / Nerve growth factor (NGF) belongs to the neurotrophin family and induces its effects through activation of two distinct receptor types. NGF was first described by Rita Levi-Montalcini and collaborators as an important factor involved in nerve differentiation and survival. Another role for NGF has been established in neurotransmitter release in the hippocampus, developing visual cortex and cerebellar neuron. However, this phenomenon has not been demonstrated in retina to date. We therefore investigated whether NGF can modulate the glutamate release in the retinal tissue at its peak of the neurotrophic activity (E10-E12). In addition this, we aimed to study the mechanisms of this effect about its dependence on extracellular Ca2+ and participation of Na+-dependent and Na+-independent glutamate transporters. Since high levels of glutamate signalization have been implicated in the oxidative stress, we also investigated the effects of NGF on the thiols compounds. We used intact retinal tissue from chicken embryos (E11) incubated with NGF (10, 50, 100 ng/ml) for different periods (15, 30, 45, 60, 120 min). Extracellular glutamate and thiols content was measured by HPLC methods and colorimetric assay, respectively. We found that NGF rapidly enhances the release of basal glutamate and it can induce thiol release in a more prolonged time of incubation, as well. Interestingly, the NGF-induced increase in the extracellular levels of glutamate was blocked by Ca2+-free medium only in retina treated for 15 min. Retina incubated for 30 min showed a non-vesicular NGF-induced glutamate release. Since glutamate and thiol release was not blocked by Zn2+, we suggested the possible involvement of system Xc- in both processes.NGF-induced increase in the extracellular thiol could be an important protective mechanism enabling retinal neurons to maintain their redox status during development.

Orientador: Marcelo Ganzarolli de Oliveira / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Quimica / Made available in DSpace on 2018-08-15T02:21:46Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Sassonia_RogerioCorte_D.pdf: 2947110 bytes, checksum: fc316c83bed9508d2e27063d89528d56 (MD5) Previous issue date: 2009 / Resumo: Este trabalho apresenta os resultados da aplicação da titulação calorimétrica isotérmica na caracterização termodinâmica de reações de S-nitrosação de tióis e de interações proteínaproteína e proteína-íon. Foram estudadas as reações de S-nitrosação da N-acetil-L-cisteína (NAC), L-cisteína (CYS), L-glutationa (GLU) e do ácido mercaptosuccínico. Também foram avaliadas as interações entre a proteína sinalizadora Shc (Src homology collagen-like) e as proteínas glutationa S-transferase (GST) e a ciclofilina A (CypA) e a interação entre a região Cterminal da proteína humana EFHC1 (EFHC1-C) com íons Ca e Mg. Os valores da variação de entalpia revelaram que a S-nitrosação é um fenômeno exotérmico e ocorre com diminuição de entropia. Estes dados termodinâmicos revelam que as reações de S-nitrosação investigadas são entalpicamente dirigidas a 25 °C (1 atm) e possuem valores semelhantes de variações de entalpia, entropia e energia livre, apesar das diferenças entre as estruturas químicas dos tióis. Verificou-se que a proteína EFHC1C liga-se tanto a íons Ca quanto Mg numa estequiometria de 1:1, com afinidades definidas por diferentes contribuições entálpicas e entrópicas. Este dado confirmou a existência de um suposto domínio EF-hand ligante de Ca na porção C-terminal previsto pela seqüência primária da EFHC1C. Por outro lado, a EFHC1C perde sua capacidade de interação com íons Ca e Mg em solução sem 1,4-ditiotreitol (DTT), provavelmente, devido à formação de dímeros. A ausência de sinais térmicos de ITC mostrou que nem a proteína GST, nem a proteína CypA interagem com a proteína Shc nas condições experimentais usadas. / Abstract: This work presents the results of isothermal titration calorimetry application in the thermodynamic characterization of thiol nitrosation reactions, protein-protein and protein-ion interactions. The S-nitrosation reactions of N-acetyl-L-cysteine (NAC), L-cysteine (CYS), Lglutathione (GLU) and acid mercaptosuccinic were studied. The interactions of the signaling protein Shc (Src homology collagen-like) with glutathione S-transferase (GST) and ciclofilina A (CypA) and of the EF-hand motif from human EFHC1C with Caand Mg ions were also evaluated. Enthalpy change values revealed that the S-nitrosation reaction is an exothermic phenomenum associated to a decrease in entropy. These thermodynamic data show that the S-nitrosation reactions investigated are enthalpically driven at 25 °C (1 atm) and have similar enthalpic, entropic and free energy change values, despite the differences among the chemical structures of the thiols. It was verified that the EFHC1C protein binds to both Ca and Mg ions in a 1:1 stoichiometry with affinities defined by different enthalpic and entropic contributions. These data confirmed the presence of a putative EF-hand Ca-binding motif at the C-terminal portion as expected by the primary sequence of EFHC1C. On the other hand, EFHC1C losses its ability to interact with Ca and Mgions in solution without 1,4-ditiotreitol (DTT) likely due to protein dimerization. The absence of ITC thermal signals showed that neither GST nor CypA interact with the Shc protein in the experimental conditions used. / Doutorado / Físico-Química / Doutor em Ciências

Submitted by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2017-10-20T14:11:05Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Dissertacao_GKBBS.pdf: 3063086 bytes, checksum: 53fea91a46cb472e3ac93c6e346cb5f3 (MD5) / Approved for entry into archive by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2017-10-20T18:20:02Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Dissertacao_GKBBS.pdf: 3063086 bytes, checksum: 53fea91a46cb472e3ac93c6e346cb5f3 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-10-20T18:20:03Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Dissertacao_GKBBS.pdf: 3063086 bytes, checksum: 53fea91a46cb472e3ac93c6e346cb5f3 (MD5) Previous issue date: 2012-11-09 / CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Systemic Lupus Erythematosus (SLE) is an autoimmune disease of connective tissue, with etiology and pathogenesis still not fully understood. Among the most important clinical manifestations of SLE is the lupus nephritis (LN), characterized as a serious risk factor for morbidity and mortality, which during the periods of exacerbation occurs the production of autoantibodies and immune complex deposition in glomeruli, favoring the production of reactive oxygen species, which may act as mediators of glomerular damage. To better evaluate the profile of oxidative stress in renal injury in patients with SLE, 93 patients were selected, aged between 15 and 49 years, distributed between the groups: control lupus (n = 30), lupus nephritis (n = 31), and active lupus without kidney injury (n = 21) and without lupus (n = 11), to carry out a cross-sectional study whose blood samples collected were subjected to hematologic (complete hemogram), biochemistry (urea, creatinine, uric acid, total protein and albumin), immunological (complement C3 and C4) and oxidative stress markers (superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT), glutathione peroxidase (GPx), glutathione reductase (GR), total thiol (SH), malondialdehyde (MDA), total oxidant status (TOS), total antioxidant capacity (TAC), index oxidative stress (IEO) and allantoin) dosages. The GPx activity showed increased in SLE control, GR activity showed increased in active SLE without renal injury, the SH concentration showed decreased in NL and active SLE without renal injury, the concentration of MDA showed elevated in active SLE without renal injury, TOS levels showed decreased in the NL, the TAC levels showed increased in the NL, the IEO determination showed decreased in NL and allantoin levels showed increased in patients with SLE (control and activity). SLEDAI score showed positively correlated with GR and negatively with GPx and MDA, TOS, IEO and SH. Prednisone showed positively correlated with GR and negatively with TOS, IEO and SH. Urea showed positively correlated with GR and allantoin and negatively with SH. Creatinine showed positively correlated with TAC and allantoin and negatively with TOS, IEO and SH. Total proteins showed positively correlated with TOS, IEO, SH and negatively with MDA and TAC and allantoin. Albumin showed positively correlated with GPx, TOS, and IEO SH and negatively with allantoin. Uric acid showed positively correlated with allantoin and negatively with SH. C3 showed positively correlated with SH and negatively with GR. SLE patients, regardless of the target organ and in any degree of disease activity had alterations in oxidative stress, possibly due to a high consumption of endogenous antioxidants and reduced antioxidant enzyme activity. Further studies may deepen the knowledge about the possible benefits of antioxidants inclusion in the treatment protocol of this disease. / O Lúpus Eritematoso Sistêmico (LES) é uma doença autoimune do tecido conjuntivo, com etiopatogenia ainda não totalmente compreendida. Dentre as manifestações clínicas mais importantes do LES encontra-se a nefrite lúpica (NL) caracterizada como grave fator de risco de morbimortalidade, que durante os períodos de exacerbação ocorre a produção de autoanticorpos e deposição de imunocomplexos na região dos glomérulos, favorecendo a produção de espécies reativas do oxigênio que possivelmente agem como mediadores do dano glomerular. Para melhor avaliar o perfil do estresse oxidativo na lesão renal de pacientes com LES, foram selecionados 93 pacientes, com idade entre 15 e 49 anos, distribuídos entre os grupos: lúpus controle (n = 30), nefrite lúpica (n = 31), lúpus ativo e sem lesão renal (n = 21) e sem lúpus (n = 11), para realização de um estudo transversal, cujas amostras de sangue coletadas foram submetidas às dosagens hematológica (hemograma completo), bioquímica (ureia, creatinina, ácido úrico, proteínas totais e albumina), imunológica (complemento C3 e C4) e de marcadores de estresse oxidativo (superóxido desmutase (SOD), catalase (CAT), glutationa peroxidase (GPx), glutationa redutase (GR), tióis totais (SH), malondialdeído (MDA), estado oxidante total (TOS), capacidade antioxidante total (TAC), índice de estresse oxidativo (IEO) e alantoína). A atividade da GPx apresentou-se aumentada no LES controle, a atividade da GR apresentou-se aumentada no LES ativo sem lesão renal, a concentração de SH apresentou-se diminuída na NL e no LES ativo sem lesão renal, a concentração de MDA apresentou-se elevada no LES ativo sem lesão renal, os níveis de TOS apresentaram-se diminuídos na NL, os níveis de TAC apresentaram-se aumentados na NL, a determinação do IEO apresentou-se diminuída na NL e os níveis de alantoína apresentaram-se aumentados nos pacientes com LES (controle e em atividade). SLEDAI se correlacionou positivamente com GR e MDA e negativamente com GPx, TOS, IEO e SH. Prednisona se correlacionou positivamente com GR e negativamente com TOS, IEO e SH. Ureia se correlacionou positivamente com GR e alantoína e negativamente com SH. Creatinina se correlacionou positivamente com TAC e alantoína e negativamente com TOS, IEO e SH. Proteínas Totais se correlacionaram positivamente com TOS, IEO, SH e MDA e negativamente com TAC e alantoína. Albumina se correlacionou positivamente com GPx, TOS, IEO e SH e negativamente com alantoína. Ácido úrico se correlacionou positivamente com alantoína e negativamente com SH. C3 se correlacionou positivamente com SH e negativamente com GR. Pacientes com lúpus eritematoso sistêmico, independente do órgão-alvo e em qualquer grau da atividade da doença apresentaram alteração do estresse oxidativo, possivelmente devido a um elevado consumo de antioxidantes endógenos e reduzida atividade de antioxidantes enzimáticos. Novos estudos poderão aprofundar o conhecimento sobre os possíveis benefícios da inclusão de antioxidantes no protocolo de tratamento desta doença.

Proteína dissulfeto isomerase (PDI) é uma ditiol-dissulfeto óxido redutase ubíqua que é responsável por uma série de funções celulares, inclusive na sinalização celular e nas respostas a eventos que causam dano celular. Entretanto, a PDI pode se tornar disfuncional através das modificações pós-traducionais, incluindo as promovidas por oxidantes biológicos. Estes oxidantes são provavelmente os responsáveis pelas modificações oxidativas pós-traducionais da PDI que foram detectadas em várias condições associadas ao estresse oxidativo, levando à disfunção da proteína. Devido a falta de estudos cinéticos com a PDI nativa e a falta de caracterização dos produtos dessas reações, investigamos se a diminuição da fluorescência da PDI nativa pode ser empregada para estudos da cinética de oxidação com peróxido de hidrogênio. Posteriormente, investigamos a cinética e os produtos da reação entre PDI e peroxinitrito. Nossos experimentos mostraram que a oxidação por excesso de peróxido de hidrogênio levava a uma diminuição da fluorescência de forma dependente do tempo e da concentração do oxidante, permitindo a determinação da constante de velocidade de segunda ordem (k = (17,3±1,3) M-1 s-1, pH 7,4, 25 ºC). Relevantemente, mostramos que o processo era totalmente revertido por DDT, mostrando que o peróxido de hidrogênio oxida quase que exclusivamente os grupos ditióis da PDI (Cys53 e Cys56 e Cys397 e Cys400). Utilizando a mesma abordagem para estudar a oxidação da PDI por peroxinitrito, notamos que o decréscimo da fluorescência intrínseca da PDI nativa e a velocidade só era proporcional à concentrações sub-estequiométricas ou estequiométricas do oxidante em relação aos tióis reativos da PDI. Somente nessas condições o processo se mostrava reversível por DDT, indicando que os ditióis da PDI eram o alvo preferencial do peroxinitrito mas que a oxidação de outros resíduos também ocorria. A reação dos tióis reativos da PDI com peroxinitrito foi considerada relativamente rápida (6,9 ± 0,6 × 104 M-1 s-1, pH 7,4, 25 °C), e os resíduos de Cys reativos dos domínios a e a\' aparentam reagir com constantes de velocidade similares. Experimentos de proteólise limitada, simulações cinética e análises de MS e MS/MS confirmaram que o peroxinitrito oxida preferencialmente os tióis redox ativos da PDI para os ácidos sulfênicos correspondentes, que, subsequentemente, reagem com os tióis vizinhos, produzindo dissulfetos (Cys53- Cys56 e Cys397- Cys400). Entretanto, uma fração de peroxinitrito decai para radicais levando à hidroxilação e nitração de outros resíduos próximos ao sítio redox ativo (Trp52 Trp396 e Tyr393). Assim, investigamos também a oxidação da PDI por excesso de peroxinitrito em relação aos grupos tióis reativos por diferentes metodologias. Experimentos de SDS-PAGE, western-blot e atividade redutase mostraram que o peroxinitrito promove inativação, nitração e agregação da PDI de forma dependente da concentração de peroxinitrito. Análises de MS e MS/MS mostraram que, em excesso, o peroxinitrito promove nitração (Tyr43, Tyr49, Tyr196, Tyr393, Trp52, Trp396) e hidroxilação (Trp52, Trp396) da PDI. Em síntese, nossos estudos contribuem para melhor compreensão da oxidação da PDI por peroxinitrito e de suas possíveis consequências biológicas. / Protein disulfide isomerase (PDI) is a ubiquitous dithiol-disulfide oxidoreductase that performs an array of cellular functions, including in cellular signaling and responses to cell-damaging events. Nevertheless, PDI can become dysfunctional by post-translational modifications, including those promoted by biological oxidants. These oxidants are likely responsible for the oxidative post-translational modifications of PDI, which have detected under various conditions associated with oxidative stress, leading to protein dysfunction. However, the kinetics of the reactions of PDI with biological oxidants received limited studies and the products of these reactions were not characterized. Here, we examined whether the decrease in PDI fluorescence can be employed to follow the kinetics of the reaction of the full-length protein with biological oxidants. Also, we investigated the kinetics and products of the reaction between PDI and peroxynitrite. Our experiments showed that oxidation by excess hydrogen peroxide led to a decrease of PDI intrinsic fluorescence in a time- and concentration-dependent manner , permitting the determination of the second-order rate constant of the reaction (k = (17.3 ± 1.3 ) M1 s-1, pH 7.4, 25 ° C). The oxidation was reversed by DDT, indicating that hydrogen peroxide oxidizes mainly PDI dithiols (Cys53 and Cys56 and Cys397 and Cys400). Using the same approach to study PDI oxidation by peroxynitrite we noted that the decrease of the native PDI fluorescence was proportional to sub-stoichiometric or stoichiometric concentrations of the oxidant relative to that of PDI reactive thiols. Only under these conditions, PDI oxidation was reversed by DDT, indicating that PDI dithiols were the preferred target of peroxynitrite but that oxidation of other residues also occurred. The reaction of the active redox thiols of the PDI with peroxynitrite can be considered relatively fast (6.9 ± 0.6 × 104 M-1 s-1, pH 7.4, 25 ° C), and the reactive Cys residues of domains a and a\' were kinetically indistinguishable. Limited proteolysis experiments, kinetic simulations, and MS and MS/MS analyses confirmed that peroxynitrite preferentially oxidizes the redox-active Cys residues of PDI to the corresponding sulfenic acids, which subsequently react with the resolving thiols to produce disulfides (Cys53-Cys56 and Cys397-Cys400). However, a fraction of peroxynitrite decays to radicals leading to hydroxylation and nitration to other residues located close to the active site (Trp52 Trp396 and Tyr393). SDS-PAGE, western blotting and inhibition of the reductase activity experiments confirmed that excess peroxynitrite promotes further PDI oxidation, nitration, inactivation and aggregation in a concentration-dependent manner. MS and MS/MS analyzes showed that peroxynitrite in a ten times excess relative to PDI reactive thiols promote PDI nitration (Tyr43, Tyr49, Tyr196, Tyr393, Trp52, Trp396) and hydroxylation (Trp52, Trp396). In conclusion, our studies contribute to a better understanding of PDI oxidation by peroxynitrite and its possible biological consequences