Les norovirus (NoV) sont considérés comme étant l'agent étiologique le plus impliqué dans les éclosions de gastro-entérite d'origine virale à l'échelle mondiale. À l'heure actuelle, et malgré les efforts fournis, les NoV sont difficilement cultivés in vitro. Vue l'absence d'une étude épidémiologique récente caractérisant les isolats de NoV à l'échelle nationale et le manque d'informations valables sur leur caractérisation moléculaire (détection, survie dans les aliments et sur les surfaces, inactivation...) la présente étude s'est fixée les objectifs suivants : (1) Caractériser, au niveau moléculaire et épidémiologique, une sélection de souches de NoV isolées entre 2004-2005 pendant des éclosions de gastro-entérite rapportées dans plusieurs provinces canadiennes; (2) Développer une approche moléculaire en temps réel de type NASBA (NASBA-TR) pour là détection des NoV dans les échantillons fécaux et comparer aux méthodes ELISA ; RT-PCR en temps réel et conventionnelle ; (3) Optimiser et combiner une digestion enzymatique à la technique NASBA-TR développée afin de distinguer les NoV infectieux des non infectieux; (4) Évaluer la persistance des NoV infectieux dans des échantillons alimentaires réfrigérés; (5) Évaluer la persistance des NoV infectieux sur les surfaces inertes sous différentes conditions de température et d'humidité relative. L'analyse phylogénétique a montré la co-circulation des deux génogroupes (I et il) de NoV, avec prédominance du génogroupe II (95.7 %) représentée principalement par le sous-groupe Lordsdale. Il s'est avéré aussi qu'une caractérisation fiable des isolats de NoV doit être basée sur les informations issues du séquençage du gène de l'ARN polymérase et celui de la capside. La caractérisation moléculaire des échantillons fécaux de NoV a démontré que NASBA-TR assure une meilleure sensibilité que la RT-PCR conventionnelle et l'ELISA, mais semblable à la TaqMan RT-PCR. De plus, une fois combinée avec la digestion enzymatique, NASBA-TR s'est révélé très efficace dans la discrimination des NoV infectieux. Nous avons aussi montré que les NoV infectieux sont stables à 7°C et peuvent survivre dans la laitue et la dinde pendant 10 jours. Cependant, la persistance des NoV infectieux sur les deux surfaces étudiées s'est révélée très importante (56 jours) à une basse température et haute humidité relative

La présence de virus dans les aliments est responsable de nombreuses maladies. Les virus les plus souvent associés aux épidémies recensées sont le norovirus humain (HuNoV) et le virus de l'hépatite A (VHA). Les méthodes de détection moléculaires de type RT-qPCR ne permettent pas de distinguer si les virus sont infectieux ou non. Cependant, des prétraitements peuvent être appliqués aux échantillons pour que seul le génome des virus infectieux soit détecté. Le but de ce projet de maîtrise était de comparer l'efficacité de différents prétraitements appliqués à des virus alimentaires inactivés selon différents procédés. Le VHA a été inactivé totalement ou partiellement par la chaleur, par la lumière pulsée et par l'hypochlorite de sodium (NaOCl). Les prétraitements PMA, PMAxx, PtCl$_\mathsf{4}$, billes de silice et colonne filtrante Amicon® ont été testés et comparés. De plus, différentes dilutions de jus provenant d'aliments ont été mélangées au PMAxx pour évaluer si son efficacité était affectée. Des essais ont également été réalisés avec le PMAxx sur différentes concentrations de VHA. Finalement, des essais avec le HuNoV ont été effectués avec le PMAxx qui s'est révélé être peu efficace. Seuls le PMA et le PMAxx se sont avérés efficaces comme prétraitements utilisés lors de l'inactivation du VHA par la chaleur. Aucun prétraitement ne s'est révélé efficace après une inactivation par la lumière pulsée et par le NaOCl. Les jus concentrés issus d'aliments semblent avoir un effet à la fois sur la RT-qPCR et sur le PMAxx, cet effet disparaît après avoir dilué les jus. De plus, les différentes concentrations du VHA ne semblent pas exercer une influence sur l'efficacité du PMAxx. Les résultats démontrent que davantage d'études sont nécessaires pour améliorer la détection moléculaire des virus infectieux. Bien que certains prétraitements semblent prometteurs, ils ne peuvent empêcher complètement l'amplification d'acides nucléiques provenant de virus non-infectieux. / The presence of viruses in food is responsible for many diseases. Viruses most often associated with reported outbreaks are human norovirus (HuNoV) and hepatitis A virus (HAV). Molecular detection methods, such as RT-qPCR cannot distinguish whether viruses are infectious or not. However, pretreatments can be applied to the samples so that only the genomes of infectious viruses are detected. The aim of this master's project was to compare the effectiveness of different pretreatments applied to inactivated foodborne viruses using different processes. HAV was inactivated totally or partially by heat, pulsed light and sodium hypochlorite (NaOCl). Pretreatments PMA, PMAxx, PtCl$_\mathsf{4}$, magnetic silica beads and Amicon® filter column were tested and compared. Furthermore, different dilutions of food juices were mixed with PMAxx to assess whether its efficacy was affected. Assays were also performed with PMAxx on different loads of HAV. Finally, assays with HuNoV were performed with PMAxx which has proven to be of little effectiveness. Only PMA and PMAxx were shown to be effective as pretreatments used with heat inactivation of HAV. No pretreatment was found to be effective after pulsed light and NaOCl inactivation. Concentrated juices from foods seemed to influence both RT-qPCR and PMAxx, this effect disappears after diluting the juices. Moreover, different HAV loads do not seem to exert an impact on PMAxx effectiveness. The results demonstrate that further studies are needed to improve molecular detection of infectious viruses. Although some pretreatments seemed to be promising, they cannot completely prevent the amplification of nucleic acids from non-infectious viruses.

Introdução: O enfermeiro é responsável em atuar no controle da contaminação do ambiente, visando a prevenção de transmissão de infecções relacionadas à assistência à saúde. Surtos de gastroenterite causados por norovirus (NoV) em locais fechados são caracterizados pela persistência do vírus no ambiente, aerolização das partículas virais e baixa dose infectante, mesmo em indivíduos saudáveis. Portanto, há necessidade de definição de um protocolo seguro para limpeza e desinfecção do piso contaminado com vômito e fezes, considerando a possibilidade de dispersão de aerossóis a partir do piso. Objetivo: Avaliar a presença residual de partículas de NoV-GII no ar e no piso quando implementados diferentes protocolos de descontaminação do piso, após contaminação intencional. Método: Trata-se de um estudo experimental laboratorial. Dois tipos de piso, vinil e granito (matérias primas frequentemente utilizadas nos pisos dos serviços de saúde), foram contaminados intencionalmente com fezes humanas positivas 10% para NoV-GII, dissolvidas em 500ml de solução tampão salino-fosfato. Os pisos foram submetidos a três tipos de tratamento: limpeza padronizada com fricção manual, água e detergente neutro; limpeza seguida de desinfecção com hipoclorito de sódio 1% por 10 minutos; limpeza seguida de desinfecção com dispositivo portátil de luz ultravioleta por cinco minutos (SURFACE-UV®). Amostras foram obtidas do piso, por meio do swab, e do ar, por meio de um coletador de ar (Coriolis® - Bertin Technologies, França), nos seguintes momentos: antes e após a contaminação intencional; após a limpeza e após os métodos de desinfecção. Para detecção de NoV-GII nas amostras, utilizou-se a técnica 4.6.2. Reação em Cadeia pela Polimerase quantitativa precedida de Transcrição Reversa (RT-qPCR), pelo método TaqMan®. Resultados: Não foram encontradas diferenças estatisticamente significantes entre os tipos de piso após os protocolos de descontaminação, tanto para o residual de NoV-GII no piso, quanto no ar. Os valores médios de Cycle Threshold (Ct) após limpeza seguida de desinfecção foram maiores (38,75 40,00) comparados aos de após limpeza (35,67 38,66), comprovando a maior eficácia desse protocolo (p<0,001). Em algumas amostras, a limpeza isolada foi capaz de reduzir a contaminação por NoV do piso até níveis indetectáveis. Quando houve residual de NoV-GII após a limpeza do piso, o protocolo cuja desinfecção foi realizada com hipoclorito de sódio foi mais eficaz do que a luz ultravioleta (p<0,001), sendo que os valores de Ct de todas as amostras foram acima de 40. Em 27 das 36 (75%) amostras de ar coletas após a limpeza do piso, foram detectadas partículas de NoV, com diferenças estatisticamente significantes entre as segundas e terceiras amostras, coletadas a 150cm do piso. Foram identificadas que, em média, 17 cópias de RNA viral/L estavam presentes no ar após a limpeza, com redução gradual após a desinfecção. Conclusões: Quando vômito e fezes com NoV-GII contaminam o piso, há aerolização desse vírus já no ato da limpeza. Essas partículas podem ser inaladas ou depositarem em superfícies frequentemente tocadas pelas mãos, estabelecendo o ciclo de transmissão oro-fecal. As partículas virais residuais no piso após a limpeza, indiscutivelmente devem ser eliminadas, evitando assim a reaerolização do NoV a partir dessa fonte. Nesse sentido, a limpeza seguida de desinfecção com hipoclorito de sódio a 1% por 10 minutos mostra superioridade como protocolo de descontaminação do piso, quando comparado ao protocolo com limpeza seguida de desinfecção com luz ultravioleta por 5 minutos de exposição. / Introduction: Nurses are responsible for controlling contamination of the environment, working to prevent the transmission of health-care-associated infections. Gastroenteritis outbreaks caused by Norovirus (NoV) in closed settings are characterized as the result of persistence of the virus in the environment, aerosolization of viral particles, and small infectious dose, even in healthy individuals. Therefore, a safe protocol to decontaminate the floor after vomit or feces have spilled must be defined, considering that subsequent aerosol dispersal may occur. Objective: To assess the presence of residual NoV-GII particles in the air and on the floor after different decontamination protocols are conducted on a deliberately contaminated floor. Method: This is an experimental laboratory study. Two types of floor, vinyl and granite (materials which are often used in the flooring of healthcare facilities), were intentionally contaminated with 10% NoV-GII-positive human feces dissolved in 500ml of a saline-phosphate buffer solution. The floors received three types of treatment: standard cleaning, with manual friction, water, and neutral detergent; cleaning followed by a ten- minute disinfection procedure using 1% sodium hypochlorite; and cleaning followed by a five- minute disinfection procedure using a portable ultraviolet light device (SURFACE-UV®). Swab samples were taken from the floor, and air samples were obtained using an air sampler (Coriolis® - Bertin Technologies, France) at the following moments: before and after the intentional contamination, after cleaning, and after disinfection. The TaqMan® method for real-time Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction was used to detect NoV-GII in the samples. Results: No statistically significant difference between the two types of floor was found for residual NoV-GII, either in the air or on the floor, after the decontamination protocols. The average Cycle Threshold (Ct) values found after cleaning followed by disinfection were higher (38.75 - 40.00) than those recorded after cleaning (35.67 - 38.66), thus attesting to the greater effectiveness of the latter protocol (p<0.001). In some samples, cleaning alone was enough to reduce floor contamination by NoV to undetectable levels. When residual NoV-GII was found after cleaning the floor, the disinfection protocol that involved using sodium hypochlorite proved more effective than UV-light exposure (p<0.001), and Ct values were higher than 40 for all samples. NoV particles were detected in 27 of the 36 (75%) air samples obtained after cleaning the floor, and significant statistical differences were found between the second and third samples, collected 150cm from the floor. An average of 17 copies of viral RNA/L were identified in the air after cleaning, gradually decreasing after disinfection. Conclusions: When NoV-GII-infected vomit or feces contaminate the floor, the virus is aerosolized even during cleaning. These particles may then be inhaled or settle on frequently touched surfaces, establishing the fecal-oral transmission cycle. Residual viral particles on the floor must undoubtedly be eliminated, thereby preventing NoV aerosolization from this source. Along these lines, cleaning followed by disinfection by 1% sodium hypochlorite for ten minutes proved to be a superior floor decontamination protocol when compared with cleaning followed by disinfection by UV-light exposure for five minutes.

Le norovirus murin (MNV) est un agent pathogène de la souris récemment découvert et représente le contaminant le plus courant dans les animaleries de Recherche. Néanmoins, les effets de l'infection au MNV sur la recherche biomédicale ne sont pas encore clairs. Nous avons testé l'hypothèse que l'infection au MNV pourrait modifier la réponse immunitaire chez les souris atteintes d'une infection pulmonaire aiguë. Nous rapportons ici que la co-infection avec MNV augmente la survie des souris ayant une infection pulmonaire aiguë à Pseudomonas aeruginosa et diminue la production in vivo et in vitro de cytokines pro-inflammatoires. Nos résultats suggèrent que l'infection au MNV peut profondément modifier les paramètres étudiés dans les modèles classiques d'infection et mener à de fausses conclusions dans ces modèles expérimentaux. / The murine norovirus (MNV) is a recently discovered mouse pathogen, this virus represents the most common contaminant in laboratory mouse colonies. Nevertheless, the effects of MNV infection on biomedical research are still unclear. We tested the hypothesis that MNV infection could alter immune response in mice with acute lung infection. Here we report that co-infection with MNV increases survival of mice with Pseudomonas aeruginosa acute lung injury and decreases in vivo and in vitro production of pro-inflammatory cytokines. Our results suggest that MNV infection can deeply modify the parameters studied in conventional models of in-fection and lead to false conclusions in experimental models.

Viren haben als Ursache lebensmittelassoziierter Infektionen eine große Bedeutung. Sie können vor allem über rohe oder unzureichend erhitzte Lebensmittel übertragen werden. In diesem Zusammenhang werden grüner Salat, Erdbeeren, Himbeeren, Frühlingszwiebeln, Muscheln, halbgetrocknete Tomaten, fäkal verunreinigtes Trinkwasser, Backwaren und Rohwürste als häufige Infektionsquellen genannt. Vor allem kurzgereifte Rohwürste gehören aus mikrobiologischer Sicht zu Risikoprodukten. Um eine gleichbleibende Qualität der Produkte zu gewährleisten, ist die Verwendung von Starterkulturen unerlässlich. Als sogenannte Schutzkulturen sollen sie gleichzeitig die Vermehrung unerwünschter bakterieller Pathogene unterbinden. Bisher ist allerdings nicht bekannt, inwieweit diese zur Virusinaktivierung in kurzgereiften Rohwürsten führen bzw. beitragen. Aus diesem Grund war es das Ziel dieser Arbeit, den Einfluss von rohwurstrelevanten Starter- und Schutzkulturen sowie deren Metabolite (Bacteriocine, Milchsäure) auf die Tenazität und Inaktivierungskinetik von Viren zu prüfen. Die Untersuchungen erfolgten mit dem murinen Norovirus (MNV) S 99 sowie dem humanen Influenzavirus H1N1 (A/WSN/33). Antivirale Effekte wurden zum einen anhand von in-vitro-Studien, zum anderen anhand von experimentell mit Viren kontaminierten kurzgereiften Rohwürsten (Mettwurst/Teewurst) geprüft. Die Bacteriocine Sakacin A und Nisin zeigten in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) keine viruzide Wirkung gegenüber MNV S 99 und H1N1 (pH 6,2; 24 °C; Exposition: 3 Tage). Weiterhin wurden anhand von in-vitro-Untersuchungen 29 verschiedene zellfreie Kulturüberstände [Milchsäurebakterien, Staphylococcus spp. (S.), Kocuria (K.) varians] hinsichtlich ihrer antiviralen Wirkung geprüft. Dabei konnte eine signifikante Titerreduktion von MNV S 99 bei Exposition mit dem Kulturüberstand eines Lactobacillus (Lb.) curvatus-Isolates festgestellt werden (p < 0,05). In mit dieser Kultur fermentiertem Tee- und Mettwurstbrät zeigte sich jedoch kein Effekt. Die Virustenazität von H1N1 und MNV S 99 konnte mit D,L-Milchsäure unter rohwurstrelevanten Bedingungen (pH 5,0 bis 6,2) sowohl in-vitro als auch im frischen Mettwurstbrät beeinflusst werden. In-vitro erzielte Titerreduktionen lagen bei 2,5 (H1N1) bzw. 3,25 log-Stufen (MNV S 99) nach drei Tagen (24 °C) Lagerung. Im Gegensatz dazu war MNV S 99 im Vergleich zu H1N1 im Mettwurstbrät stabiler. H1N1 konnte unterhalb von pH 5,5 bereits direkt nach dem Einmischen der Influenzaviren in das Wurstbrät nicht mehr nachgewiesen werden. MNV S 99 wurde hingegen erst nach einem Tag Lagerung (22 °C) maximal um 0,7 log-Stufen reduziert (pH 5,2). Die verwendeten Starter- und Schutzkulturen (Lb. sakei, Lb. curvatus, Lb. paracasei, Lb. plantarum, S. carnosus, S. xylosus, K. varians) zeigten im Mett- und Teewurstbrät im Vergleich zur Kontrolle (ohne Starterkultur) keinen zusätzlichen viruziden Effekt auf MNV S 99. Zunehmende Virustiterreduktionen konnten mit pH-Wert-Erniedrigung beobachtet werden. Nach der Reifung (1 Tag, 22 °C, pH 4,9) von Mettwurst mit Starterkulturen wurde das Virus um maximal 1,65 log-Stufen reduziert. In mit Einzel- beziehungsweise Mehrstamm-Mischkulturen fermentierter Teewurst (7 Tage, 22 °C, pH 4,9) betrug die Titerreduktion maximal 1,10 log-Stufen. Das Influenzavirus H1N1 konnte im Rohwurstbrät mit Starterkulturen auch nach Verwendung hoher Ausgangstiter bereits zu Beginn der Untersuchungen nicht mehr nachgewiesen werden. Aus den erzielten Daten kann geschlussfolgert werden, dass die Bacteriocine Sakacin A und Nisin nicht als antivirale Zusatzstoffe in Lebensmitteln (z. B. Rohwürste) geeignet sind. Das antivirale Potential von zellfreien Kulturüberständen war Bakterienstamm-spezifisch und nur in-vitro ersichtlich. Daher muss die Nutzung des Lb. curvatus 1-Stammes nicht anderen rohwurstrelevanten Starterkulturen vorgezogen werden. Die Verwendung von Milchsäure als Zusatzstoff im Rohwurstbrät eignet sich nur zum Ausschluss einer viralen Exposition im Zusammenhang mit H1N1. Frische Mettwurst muss allerdings hierzu adäquat gesäuert (pH < 5,5) werden. Neben dem antiviralen Effekt durch gebildete Säure, konnte keine weitere spezies-spezifische antivirale Wirkung verwendeter Starter- und Schutzkulturen auf MNV S 99 festgestellt werden. Die Säureleistung einzelner Kulturen ist demzufolge für eine Virusinaktivierung entscheidend. Das antivirale Potential verwendeter Starter- und Schutzkulturen in Rohwürsten ist im Zusammenhang mit MNV S 99 als gering einzuschätzen. Unter der Annahme, dass murine und humane Noroviren eine ähnliche Tenazität in kurzgereiften Rohwürsten aufweisen, sollten diese Produkte im Zusammenhang mit Noroviren als Risikoprodukte eingestuft werden.

Introdução: O enfermeiro é responsável em atuar no controle da contaminação do ambiente, visando a prevenção de transmissão de infecções relacionadas à assistência à saúde. Surtos de gastroenterite causados por norovirus (NoV) em locais fechados são caracterizados pela persistência do vírus no ambiente, aerolização das partículas virais e baixa dose infectante, mesmo em indivíduos saudáveis. Portanto, há necessidade de definição de um protocolo seguro para limpeza e desinfecção do piso contaminado com vômito e fezes, considerando a possibilidade de dispersão de aerossóis a partir do piso. Objetivo: Avaliar a presença residual de partículas de NoV-GII no ar e no piso quando implementados diferentes protocolos de descontaminação do piso, após contaminação intencional. Método: Trata-se de um estudo experimental laboratorial. Dois tipos de piso, vinil e granito (matérias primas frequentemente utilizadas nos pisos dos serviços de saúde), foram contaminados intencionalmente com fezes humanas positivas 10% para NoV-GII, dissolvidas em 500ml de solução tampão salino-fosfato. Os pisos foram submetidos a três tipos de tratamento: limpeza padronizada com fricção manual, água e detergente neutro; limpeza seguida de desinfecção com hipoclorito de sódio 1% por 10 minutos; limpeza seguida de desinfecção com dispositivo portátil de luz ultravioleta por cinco minutos (SURFACE-UV®). Amostras foram obtidas do piso, por meio do swab, e do ar, por meio de um coletador de ar (Coriolis® - Bertin Technologies, França), nos seguintes momentos: antes e após a contaminação intencional; após a limpeza e após os métodos de desinfecção. Para detecção de NoV-GII nas amostras, utilizou-se a técnica 4.6.2. Reação em Cadeia pela Polimerase quantitativa precedida de Transcrição Reversa (RT-qPCR), pelo método TaqMan®. Resultados: Não foram encontradas diferenças estatisticamente significantes entre os tipos de piso após os protocolos de descontaminação, tanto para o residual de NoV-GII no piso, quanto no ar. Os valores médios de Cycle Threshold (Ct) após limpeza seguida de desinfecção foram maiores (38,75 40,00) comparados aos de após limpeza (35,67 38,66), comprovando a maior eficácia desse protocolo (p<0,001). Em algumas amostras, a limpeza isolada foi capaz de reduzir a contaminação por NoV do piso até níveis indetectáveis. Quando houve residual de NoV-GII após a limpeza do piso, o protocolo cuja desinfecção foi realizada com hipoclorito de sódio foi mais eficaz do que a luz ultravioleta (p<0,001), sendo que os valores de Ct de todas as amostras foram acima de 40. Em 27 das 36 (75%) amostras de ar coletas após a limpeza do piso, foram detectadas partículas de NoV, com diferenças estatisticamente significantes entre as segundas e terceiras amostras, coletadas a 150cm do piso. Foram identificadas que, em média, 17 cópias de RNA viral/L estavam presentes no ar após a limpeza, com redução gradual após a desinfecção. Conclusões: Quando vômito e fezes com NoV-GII contaminam o piso, há aerolização desse vírus já no ato da limpeza. Essas partículas podem ser inaladas ou depositarem em superfícies frequentemente tocadas pelas mãos, estabelecendo o ciclo de transmissão oro-fecal. As partículas virais residuais no piso após a limpeza, indiscutivelmente devem ser eliminadas, evitando assim a reaerolização do NoV a partir dessa fonte. Nesse sentido, a limpeza seguida de desinfecção com hipoclorito de sódio a 1% por 10 minutos mostra superioridade como protocolo de descontaminação do piso, quando comparado ao protocolo com limpeza seguida de desinfecção com luz ultravioleta por 5 minutos de exposição. / Introduction: Nurses are responsible for controlling contamination of the environment, working to prevent the transmission of health-care-associated infections. Gastroenteritis outbreaks caused by Norovirus (NoV) in closed settings are characterized as the result of persistence of the virus in the environment, aerosolization of viral particles, and small infectious dose, even in healthy individuals. Therefore, a safe protocol to decontaminate the floor after vomit or feces have spilled must be defined, considering that subsequent aerosol dispersal may occur. Objective: To assess the presence of residual NoV-GII particles in the air and on the floor after different decontamination protocols are conducted on a deliberately contaminated floor. Method: This is an experimental laboratory study. Two types of floor, vinyl and granite (materials which are often used in the flooring of healthcare facilities), were intentionally contaminated with 10% NoV-GII-positive human feces dissolved in 500ml of a saline-phosphate buffer solution. The floors received three types of treatment: standard cleaning, with manual friction, water, and neutral detergent; cleaning followed by a ten- minute disinfection procedure using 1% sodium hypochlorite; and cleaning followed by a five- minute disinfection procedure using a portable ultraviolet light device (SURFACE-UV®). Swab samples were taken from the floor, and air samples were obtained using an air sampler (Coriolis® - Bertin Technologies, France) at the following moments: before and after the intentional contamination, after cleaning, and after disinfection. The TaqMan® method for real-time Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction was used to detect NoV-GII in the samples. Results: No statistically significant difference between the two types of floor was found for residual NoV-GII, either in the air or on the floor, after the decontamination protocols. The average Cycle Threshold (Ct) values found after cleaning followed by disinfection were higher (38.75 - 40.00) than those recorded after cleaning (35.67 - 38.66), thus attesting to the greater effectiveness of the latter protocol (p<0.001). In some samples, cleaning alone was enough to reduce floor contamination by NoV to undetectable levels. When residual NoV-GII was found after cleaning the floor, the disinfection protocol that involved using sodium hypochlorite proved more effective than UV-light exposure (p<0.001), and Ct values were higher than 40 for all samples. NoV particles were detected in 27 of the 36 (75%) air samples obtained after cleaning the floor, and significant statistical differences were found between the second and third samples, collected 150cm from the floor. An average of 17 copies of viral RNA/L were identified in the air after cleaning, gradually decreasing after disinfection. Conclusions: When NoV-GII-infected vomit or feces contaminate the floor, the virus is aerosolized even during cleaning. These particles may then be inhaled or settle on frequently touched surfaces, establishing the fecal-oral transmission cycle. Residual viral particles on the floor must undoubtedly be eliminated, thereby preventing NoV aerosolization from this source. Along these lines, cleaning followed by disinfection by 1% sodium hypochlorite for ten minutes proved to be a superior floor decontamination protocol when compared with cleaning followed by disinfection by UV-light exposure for five minutes.

Der Replikation des NV-Genoms geht die kotranslationale Spaltung des vom ORF1 kodierten Polyproteins durch die viruseigene Protease, voraus. Erst in cis und in trans Prozessierungen an definierten Spaltmotiven innerhalb des Polyproteins ermöglichten die Freisetzung der strukturellen und nicht-strukturellen Proteine, die für den Aufbau des Replikationskomplexes und für die Initiation der Replikation essentiell sind. Die Regulation der Polyproteinprozessierung war allerdings bislang unbekannt. In der Charakterisierung der sequentiellen und differentiellen Prozessierung des Polyproteins bestand demnach die Hauptaufgabe dieser Arbeit. Dafür wurde zunächst ein NV-Volle-Länge-cDNA-Klon aus sechs sich überlappenden cDNA-Einzelfragmenten, unter Verwendung der overlap-extension PCR, hergestellt. Dieser Volle-Länge cDNA-Klon diente als Template für die Generierung von Vorläuferkonstrukten, die für die Charakterisierung der in cis und in trans Prozessierung des Polyproteins verwendet wurden. Die cis-Spaltung des Polyproteins konnte sowohl in E.coli als auch in humanen 293-T Zellen anhand eines Vorläuferproteins, das die komplette Sequenz der 3CLpro enthält, die 5`-seitig von der Spaltstelle zum VPg Protein und 3`-seitig vom N-Termins der 3DLpol flankiert ist, verifiziert werden. Infolge der kotranslationalen cis-Spaltung dieses Vorläuferproteins kam es zur Freisetzung der 3CLpro, die anschließend aufgereinigt wurde. Zusätzlich wurde das Fusionsprotein 3CLproµE1189A3DLpol aufgereinigt, bei dem das Spaltmotiv E/G zwischen der 3CLpro und der 3DLpol so mutiert wurde, dass die kotranslationale Spaltung des Fusionsproteins verhindert wurde. Anhand der 3CLpro sowie dessen Vorläufers 3CLproµE1189A3DLpol sollte die differentielle und sequentielle Spaltung des Polyproteins in trans charakterisiert werden. Dafür wurden synthetisch hergestellte Peptide, die die authentischen Spaltmotive innerhalb des Polyproteins aufwiesen, sowohl mit der 3CLpro als auch mit der 3CLproµE1189A3DLpol in einem trans-Spaltungsassay inkubiert und anschließend die Spaltung mit Hilfe der reversed-phase Chromatographie analysiert. Im Rahmen dieser Versuche konnte gezeigt werden, dass nur die Spaltmotive zwischen dem N-terminalem Protein p37 und der 2CNTPase sowie zwischen der 2CNTPase und dem Protein p20 in trans von der 3CLpro gespalten wurden. Massenspektrometrische Analysen wiesen nach, dass die Spaltungen jeweils zwischen den Aminosäureresten Q/G stattgefunden hatte. Zusätzlich zu den Peptiden p37/2CNTPase und 2CNTPase/p20 konnte das Peptid VPg/3CLpro durch das Fusionsprotein 3CLproµE1189A3DLpol an der Schnittstelle E/G prozessiert werden. Anhand von Berechnungen zur relativen Spalteffizienz von 3CLpro und 3CLproµE1189A3DLpol wurde nachgewiesen, dass 3CLpro eine signifikant höhere Spezifität zu den Spaltmotiven der Peptide p37/2CNTPase und 2CNTPase/p20 aufwies als das Fusionsprotein 3CLproµE1189A3DLpol. Die Spaltspezifität der 3CLpro war dabei an dem Spaltmotiv zwischen der 2CNTPase und dem Protein p20 signifikant höher als an dem Spaltmotiv zwischen dem N-terminalem Protein p37 und der 2CNTPase. In vitro Translationsstudien des NV-ORF1 im zellfreien System bestätigten, dass die kotranslationale in trans-Spaltung des Polyproteins nur zwischen dem Protein p37 und der 2CNTPase und der 2CNTPase und dem Protein p20 stattfand. Darüber hinaus konnte anhand dieses Versuches gezeigt werden, dass die initiale Prozessierung des Polyproteins auf der trans-Aktivität der 3CLpro beruht, was in der Freisetzung der Proteine p37, 2CNTPase und des Fusionsproteins VPg3CLpro[delta]3DLpol resultiert. Eine weitere Spaltung von VPg3CLpro[delta]3DLpol konnte im Rahmen dieses Versuches nicht gezeigt werden. Mit Hilfe des humanen Zellkultursystems sollte anschließend untersucht werden, ob zelluläre Faktoren in die Prozessierung des p20VPg Vorläuferproteins involviert sind. Dafür wurden Koexpressionsstudien des Vorläuferproteins p20VPg mit dem 3CLpro Vorläuferprotein [delta]VPg3CLpro[delta]3DLpol durchgeführt. Doch auch in dieser Expressionsstudie konnte eine Spaltung des Vorläuferproteins nicht beobachtet werden. Interessanterweise wurde allerdings die cis-Spaltung des Vorläuferproteins [delta]VPg3CLpro[delta]3DLpol durch die Koexpression mit [delta]VPg3CLpro[delta]3DLpol verhindert. Unter Verwendung des trans-Spaltungsassays konnte daraufhin in vitro verifiziert werden, dass p20VPg die Aktivität der 3CLpro am Peptid p37/2CNTPase signifikant reduzierte. Der initiale Schritt der NV-Replikation basiert auf der Aktivität der 3CLpro. Eine Inaktivierung dieses Enzyms würde demnach den Replikationszyklus verhindern. Somit stellt dieses Enzym ein geeignetes Target für anti-NV Medikamente dar. Aus diesem Grund wurden in dieser Arbeit mögliche 3CLpro Inhibitoren getestet. Anhand dieser Testreihen konnte gezeigt werden, dass die Substanz CMK eine mögliche Grundlage, für die Entwicklung von NV-3CLpro spezifischen Chlormethylketon-Peptidanaloga als Inhibitoren, darstellen könnte.

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Aptamere besitzen als nahezu universelle Binder ein großes Anwendungspotential in Biotechnologie und Medizin; ihre Selektion aus zufälligen Sequenzbibliotheken liefert jedoch nur suboptimale Ergebnisse. Während der Selektion schlagen sich in der Bibliothek Bindungsinformationen nieder, die zur Optimierung des Verfahrens eingesetzt werden können. Die vorliegende Arbeit widmet sich der bioinformatischen Erschließung dieser Informationen. Für die initiale Auswertung der gewonnenen Aptamersequenzdaten erwiesen sich unter Zuhilfenahme von n-Gramm-Deskriptoren und Affinitäten die Regressionsanalyse und auf statistisch-symbolischer Ebene die Mustersuche als wirkungsvolle Verfahren. Für die Aufklärung der Komplexstruktur aus Aptamer und Zielprotein wurde eine Bewertungsfunktion gefunden, die die Identifikation sogenannter nahe-nativer Bindungskonformationen unter den Ergebnissen einer Dockingsimulation erlaubt. Nach dieser methodischen Evaluation erfolgte die Selektion eines Aptamers gegen das Kapsid des humanen Norovirus. Auf Basis der erhobenen Sequenzdaten wurde die Bindegeometrie zwischen Aptamer und Zielprotein durch Anwendung der im Verfahrensprotokoll festgehaltenen Kombination der Analysemethoden aufgeklärt. Das dabei als bindungsrelevant identifizierte Sequenzmotiv kann bei der Erzeugung targetspezifisch optimierter Selektionsbibliotheken als a priori-Information einfließen.:Inhaltsverzeichnis Abbildungsverzeichnis Tabellenverzeichnis Formelverzeichnis Abkürzungsverzeichnis Vorwort 1 Thematische Einleitung 1.1 Hypothesen und Fragestellungen 1.2 Aufbau der Arbeit 2 Allgemeine Grundlagen 2.1 Protein-Nukleinsäure-Komplexe 2.1.1 Aufbau von Proteinen 2.1.2 Aufbau von Nukleinsäuren 2.1.3 Interaktionen zwischen Proteinen und Nukleinsäuren 2.2 Aptamere und deren Gewinnung 2.2.1 Aptamere als universelle Binder 2.2.2 Das Grundverfahren der Aptamerselektion 2.2.3 Methodische Modifikationen des Selektionsverfahrens 3 Auswertung der Primär- und Sekundärstruktur von Nukleinsäuren 3.1 Numerische Beschreibung von Nukleinsäuren 3.1.1 Nukleobasendeskriptoren 3.1.2 Transformationsstrategien 3.1.3 Direkt anwendbare Beschreibungskonzepte 3.2 Konzeption einer Strategie zur Evaluation der Beschreibungskonzepte 3.2.1 Beschreibung und Vorverarbeitung des Datensatzes 3.2.2 Zusammenstellung von Deskriptorensets 3.2.3 Eingesetzte Methoden 3.3 Ergebnisse der Evaluation 3.3.1 Gegenüberstellung der Beschreibungskonzepte 3.3.2 Überprüfung der Plausibilität 3.3.3 Verhältnismäßigkeit 3.3.4 Abschließende Betrachtung 4 Mustersuche in biologischen Sequenzen 4.1 Sequenzmuster 4.1.1 Definition der Sequenzmuster 4.1.2 Bewertung konkreter Musterfunde 4.1.3 Bewertung einzelner Musterinstanzen 4.1.4 Visualisierung 4.2 Algorithmus zur Mustersuche 4.2.1 Suche in Suffixbäumen 4.2.2 Durchsuchen des Musterraumes 4.2.3 Optimierung der Suchstrategie 4.2.4 Ordnung der Ergebnisse 4.2.5 Zusammenfassung 5 Auswertung der Tertiärstruktur von Protein-Nukleinsäure-Komplexen 5.1 Übersicht der Bewertungsmodelle für Protein-Nukleinsäure-Komplexe 5.1.1 Wissensbasierte Paarpotentiale 5.1.2 Molekularmechanische Bewertung 5.1.3 Auswahl der Konzepte für die weitere Betrachtung 5.2 Vorstellung und Herleitung der ausgewählten Bewertungsmodelle 5.2.1 Die SPA-PN-Potentiale 5.2.2 Die modifizierten SPA-PN Potentiale 5.2.3 Die ITScore-PR Potentiale 5.2.4 Molekularmechanische Bewertung 5.3 Konzeption des Vergleichs der Bewertungsmodelle 5.3.1 Auswahl und Vorstellung der Referenzkomplexe 5.3.2 Generierung von Decoy-Strukturen 5.3.3 Quantifizierung der strukturellen Abweichung 5.4 Ergebnisse des Vergleichs 5.4.1 Referenzkomplex 4PDB 5.4.2 Referenzkomplex 5CMX 5.4.3 Gewichtung der HADDOCK-Bewertung 5.4.4 Visualisierung der Bewertung 5.5 Zusammenfassung 6 Selektion und Analyse eines Norovirus-Aptamers 6.1 Der Norovirus als Zielstruktur der Aptamerselektion 6.1.1 Epidemiologische Aspekte 6.1.2 Aufbau des Norovirus 6.1.3 Nachweis des Norovirus 6.1.4 Eingesetzter Norovirusstamm 6.2 Experimentelle Durchführung und Auswertung 6.2.1 Aptamerselektion 6.2.2 Evaluation der Anreicherung von Aptamerkandidaten 6.2.3 Experimentelle Verifikation der Bindung 6.2.4 Entwurf eines bioinformatischen Analyseprotokolls 6.3 Bioinformatische Analysen auf Basis der Primär- und Sekundärstruktur 6.3.1 Vorhersage der Sekundärstrukturen für die Aptamerkandidaten 6.3.2 Untersuchung der Anreicherung über die Clusteranalyse 6.3.3 Untersuchung der n-Gramm-Zusammensetzung 6.3.4 Durchführung einer Mustersuche 6.3.5 Validierung der Musterfunde 6.4 Bioinformatische Analyse auf Basis der Tertiärstruktur 6.4.1 Bestimmung der Struktur des Zielproteins 6.4.2 Bestimmung der Aptamerstruktur 6.4.3 Bildung eines Komplexes aus Aptamer und Zielprotein 6.4.4 Einschätzung der Relevanz für die Epitope der Proteinoberfläche 6.5 Konzepte für die spezifische Anreicherung von Oligonukleotidbibliotheken 6.5.1 Ableitbare Unterräume des Sequenz- und Strukturraumes 6.5.2 Zusammensetzung einer Bibliothek 7 Abschließende Betrachtung 7.1 Zusammenfassung der Ergebnisse 7.2 Ausblick Literatur Versicherung

Master of Science / Department of Chemistry / Duy H. Hua / Graphene oxide (GO) has attracted many researchers in the past years because of its unique electrical and chemical properties which showed the potential applications in many fields such as electronic materials and biology. Increasing research efforts in the biomedical field are bringing to light new discoveries in areas such as drug delivery, treatment of cancers, and biosensors, and are therefore attractive. The purpose of this work is to prepare GO and modify the surface of GO in order to achieve a new functionalized GO for biosensor applications in the future. GO was synthesized from the flake graphite by using a modified Hummer’s method to achieve higher quality and yield. The flake graphite was first exfoliated by using a microwave reactor. The exfoliated flake graphite then was oxidized by K[subscript]2S[subscript]2O[subscript]8, P[subscript]2O[subscript]5, and KMnO[subscript]4 under acidic conditions, followed by H[subscript]2O[subscript]2 to form GO. The following steps were to attach carboxylic acid and benzoic acid groups onto the surface of GO. Atomic force microscopy (AFM), Fourier transform infrared spectroscopy (FTIR), and Raman spectroscopy were used to identity the modified GO and determine the sizes of the materials after a sequence of reactions. The modified GO will be used in the study of electronic sensing of biomolecules in Hua’s laboratory.