Les nucleotides et nucleosides extracellulaires sont impliqués, via l'activation de récepteurs spécifiques, dans la régulation de diverses fonctions biologiques. Les récepteurs ionotrophes P2X et métabotrophes P2Y répondent aux nucleotides di- et tri-phosphates alors que les récepteurs métabotrophes PI sont activés par l'adénosine. L'activation de ces récepteurs est modulée par la concentration de leurs agonistes dans le milieu. Des enzymes membranaires que l'on nomme ecto-nucléotidases modulent les concentrations en nucleotides extracellulaires en les hydrolysant. À pH physiologique, les nucleosides triphosphates diphosphohydrolases (NTPDases) et l'ecto-5'-nucléotidase sont les plus importantes. La signalisation purinergique est impliquée dans tous les aspects de la digestion, comme par exemple, dans la sécrétion salivaire, gastrique et intestinale, dans le péristaltisme ainsi que dans la relâche des hormones pancréatiques. La localisation des ecto-nucléotidases est une étape essentielle dans la compréhension de leurs fonctions digestives. L'expression digestive des NTPDasel et 2 et de l'ecto-5'-nucleotidase est rapportée, par contre, rien n'est connu en ce qui à trait à la localisation de la NTPDase3. Des buvardages de type northern publiés préalablement montrent que l'ARN messager de la NTPDase3 est présent dans le pancréas et dans l'intestin. L'hypothèse de mes études doctorales est que la NTPDase3 est exprimée dans le système digestif et qu'elle participe à la régulation de l'activation des récepteurs P2 dans différentes fonctions digestives. La localisation de la NTPDase3 dans le système digestif de la souris a été déterminée par histochimie enzymatique et par immunohistochimie. Les résultats obtenus montrent que la NTPDase3 est présente sur les neurones du système nerveux entérique ainsi que sur plusieurs types de cellules épithéliales comme sur les acini séreux des glandes salivaires submandibulaires et des parotides, sur les acini muqueux et l'épithélium des canaux collecteurs des glandes sublinguales ainsi que sur l'épithélium stratifié de l'oesophage et de l'estomac supérieur. De plus, certaine cellules endocrines comme les cellules des îlots de Langerhans et un sous-type de cellules entéroendocrines gastriques expriment aussi la NTPDase3. L'analyse de l'expression des NTPDasel, 2 et de l'ecto-5'-nucleotidase sur les cellules et tissues expriment la NTPDase3 montre que la NTPDase3 est exprimée avec la NTPDase2 et/ou l'ecto-5'-nucleotidase sur plusieurs de ces types cellulaires. Le deuxième volet de mes travaux montre que la NTPDase3 est exprimée par tous les types de cellules des îlots de Langerhans, autant chez le rat, l'humain que la souris, alors que l'ecto-5'-nucleotidase n'est retrouvée que chez le rat. J'ai montré que l'activité nucléotidasique de la NTPDase3 est impliquée dans la modulation de la sécrétion d'insuline par des cellules 0-pancréatique de rat, les cellules INS-1 (832/13). Cette enzyme régule la sécrétion basale d'insuline par l'hydrolyse des nucleotides relâchés de façon basale. En présence d'ATP exogène et de forte concentration de glucose, la NTPDase3 régule la sécrétion d'insulin par la modulation de la production d'adénosine. En conclusion, le profil de localisation de la NTPDase3 dans le système digestif suggère l'implication de la NTPDase3, en association avec la NTPDase2 et l'ecto-5'-nucleotidase, dans la transmission nerveuse entérique et dans la sécrétion épithéliale comme la sécrétion salivaire. De plus, la démonstration de l'implication de la NTPDase3 dans la sécrétion d'insuline représente la première fonction physiologique connue de cette enzyme.

Les ectonucléotidases sont des familles d’enzymes présentes au niveau de la membrane cellulaire et ayant pour rôle d’hydrolyser les nucléotides en nucléosides. L’objectif principal de cette étude était d’abord de caractériser des anticorps produits dans le laboratoire contre les ectonucléotidases afin de les utiliser pour définir l’expression de ces enzymes dans le cordon ombilical et dans le rein humain par immunohistochimie. Les ectonucléotidases qui nous ont intéressées dans ce travail sont les Nucléosides Triphosphates Diphosphohydrolases (NTPDases) de la membrane cytoplasmique, soient les NTPDase1, -2, -3, -8, ainsi que l’ecto-5'-Nucléotidase (CD73). Nous avons aussi localisé ces enzymes dans ces tissus par histochimie enzymatique pour vérifier l’immunolocalisation obtenue et aussi pour vérifier si ces enzymes sont bel et bien actives dans les structures détectées par immunohistochimie. Nos résultats suggèrent que, dans le cordon ombilical, les NTPDase1, -2, -3, et l’ecto-5'-Nucleotidase sont localisées au niveau de l’endothélium des artères et de la veine et au niveau de la gelée de Wharton. Au niveau du rein, la NTPDase1 est localisée dans les vaisseaux sanguins, la NTPDase2 est localisée sur la face apicale des tubules rénaux, la NTPDase3 ainsi que la NTPDase8 sont localisées dans les tubules rénaux. L'identification de la localisation cellulaire de ces enzymes dans le cordon ombilical et dans le rein humain pourra nous aider à définir le rôle de ces enzymes dans ces organes et par extension pourra nous informer sur le rôle potentiel des nucléotides extracellulaires dans ces tissus. / Ectonucleotidases are families of enzymes present in the cell membrane and whose role is to hydrolyse the nucleotides into nucleosides. The main objective of this study was to characterize antibodies produced in the laboratory against ectonucleotidases and then to evaluate the expression of these enzymes in the umbilical cord and in the kidney by immunohistochemistry. The ectonucleotidases that we have selected for this work were the Nucleosides Triphosphates Diphosphohydrolases (NTPDases) of the cytoplasmic membrane, namely NTPDase1, -2, -3, -8, as well as ecto-5'-Nucleotidase (CD73). In addition, we have performed enzymatic histochemistry to verify the immunolocalization obtained and also to verify if these enzymes are active in the structures detected by immunohistochemistry. Our results suggest that, in the umbilical cord, NTPDase1, -2, -3, and ecto-5'-Nucleotidase are located at the endothelium of the arteries and vein and in Wharton frost. In the kidney, NTPDase1 is located in the blood vessels, NTPDase2 is located on the apical surface of the renal tubules, NTPDase3 as well as NTPDase8 are located in the renal tubules. The current identification of these enzymes at the protein and activity level in the umbilical cord and in the kidney is a prerequisite with the goal to define the role of these enzymes and in extension of extracellular nucleotides in these tissues.

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Les O-glycoconjugués et les dérivés glycosidiques sont des composés naturels impliqués dans de nombreux processus biologiques. Cependant, leurs propriétés sont grevées par la médiocre stabilité in vivo de la liaison osidique. Il est donc intéressant de développer des mimes non hydrolysables. Nous nous sommes intéressés au remplacement de l'oxygène intracyclique par un groupement gem-difluorométhylène.La synthèse d'analogues difluorocarbocycliques de 5-désoxypentofuranoses et de 1-amino-5-désoxypentofuranoses a été décrite. La synthèse comporte une addition dePhSeCF2TMS sur des aldéhydes dérivés de sucres ou sur les tert-butanesulfinylimines correspondantes, suivie d'une cyclisation radicalaire. La diastéréosélectivité de ces deux étapes-clés a été étudiée, puis cette stratégie de synthèse a été appliquée à la synthèse deCF2-carbasucres, notamment l'analogue CF2-carbocyclique du D-arabinose.

Les O-glycoconjugués et les dérivés glycosidiques sont des composés naturels impliqués dans de nombreux processus biologiques. Cependant, leurs propriétés sont grevées par la médiocre stabilité in vivo de la liaison osidique. Il est donc intéressant de développer des mimes non hydrolysables. Nous nous sommes intéressés au remplacement de l’oxygène intracyclique par un groupement gem-difluorométhylène.La synthèse d’analogues difluorocarbocycliques de 5-désoxypentofuranoses et de 1-amino-5-désoxypentofuranoses a été décrite. La synthèse comporte une addition dePhSeCF2TMS sur des aldéhydes dérivés de sucres ou sur les tert-butanesulfinylimines correspondantes, suivie d’une cyclisation radicalaire. La diastéréosélectivité de ces deux étapes-clés a été étudiée, puis cette stratégie de synthèse a été appliquée à la synthèse deCF2-carbasucres, notamment l’analogue CF2-carbocyclique du D-arabinose. / O-Glycoconjugates and carbohydrate-based molecules are natural compoundsimplied in many biological processes. However, their properties are burdened by the low invivo stability of the osidic bond. It is thus interesting to develop non hydrolyzable mimetics.We were interested in the replacement of the intracyclic oxygen by a gem-difluoromethylenegroup.The synthesis of difluorinated carbocyclic analogues of 5-deoxypentofuranoses and1-amino-5-deoxypentofuranoses is described. The sequence involves an addition ofPhSeCF2TMS to carbohydrate-derived aldehydes or their corresponding tertbutanesulfinyliminesfollowed by a radical cyclization. The stereochemical outcome of these two key steps was studied, and then this strategy was applied to CF2-carbasugars, inparticular of the CF2-carbocyclic analogue of D-arabinose.

Les analogues nucléosidiques ont prouvé leur efficacité thérapeutique et sont désormais couramment utilisés en chimiothérapies antivirale et anticancéreuse. Depuis, il a récemment été démontré que les analogues de configuration non naturelle L pouvaient présenter des activités biologiques remarquables au même titre que ceux de configuration naturelle D. La recherche de nouveaux analogues nucléosidiques de configuration L apparaît ainsi prometteuse. Dans notre travail, nous nous sommes plus particulièrement intéressés aux dérivés de la L-2'-désoxyuridine substitués en position 5 de la nucléobase. La synthèse de ces composés a été réalisée à partir de la L-5-iodo-2'-désoxyuridine, un intermédiaire clé que nous avons préalablement obtenu à partir du L-ribose. Nous avons ensuite fonctionnalisé ce composé en position 5 via l'utilisation de réactions organopalladées. Les composés obtenus ont été évalués sur divers virus à ADN et à ARN, ainsi que sur des lignées cellulaires tumorales exprimant une enzyme modifiée de la désoxycytidine kinase, enzyme impliquée dans la métabolisation de nombreux nucléosides. Nous avons ensuite réalisé la synthèse des dérivés fluorés en position 2'-arabino. Dans ce cas, les analogues nucléosidiques ont été obtenus dans les deux configurations D et L afin de comparer leurs effets biologiques et de confirmer l'intérêt biologique de la configuration L. / Nucleosidic analogues have proven their therapeutic efficiency and are commonly used in antiviral and cancer chemotherapies. Recently, it has been shown that nucleosidic analogues with a L non-natural configuration could present notable biological activities as well as their D counterparts. Therefore, discovery of new nucleosidic analogues with L configuration appears promising. In our study, we were interested in L-2'-deoxyuridine derivatives including modification on the position 5 of the nucleobase. The synthesis of these compounds was performed from the L-5-iodo-2'-deoxyuridine, a key intermediate which was synthesized from L-ribose. Then, we functionalized the 5 position of this intermediate using palladium-catalyzed cross-couplings. The desired compounds were tested on various DNA and RNA viruses, and on tumor cell lines expressing a modified deoxycytidine kinase, an enzyme responsible for the metabolism of a number of nucleosides. Finally, we synthesized nucleoside derivatives containing a fluorine atom on the 2'-arabino position. In this case, both compounds with D and L configuration were obtained, in order to compare their biological effects and to confirm the biological interest of L configuration.

La leucémie myéloïde chronique (LMC) est une affection hématologique maligne caractérisée par l’apparition dans la moelle osseuse et le sang, d’un nombre important de globules blancs dont certains sont immatures. A l’heure actuelle, le principal traitement est l’Imatinib, commercialisé sous le nom de Glivec®. Ce traitement conduit, chez certains patients, à l'émergence de souches résistantes, ce qui complique la thérapeutique et nécessite un large panel de molécules actives pour contourner les mécanismes de résistance. Par conséquent, la recherche de nouvelles molécules bioactives agissant sur de nouvelles cibles biologiques reste toujours un défi important et d’actualité. Au cours de ce projet de thèse, nous nous sommes intéressés au développement de nouveaux procédés de synthèse pour accéder et découvrir de nouvelles molécules bioactives, en série nucléosidique, pour contourner les mécanismes de résistances dans des modèles de LMC. Nous avons tout d’abord développé une nouvelle méthode de synthèse propre et efficace de nouveaux analogues de C-nucléosides en utilisant une catalyse par le fer. Nous avons ensuite réalisé plusieurs modifications post-synthétiques pour accéder à de nouveaux C-nucléosides hautement fonctionnalisés, en particulier les analogues de la thiophènefurine. Nous avons également développé un nouveau procédé de synthèse d’une famille de O-glycosides, en combinant l’activation par les ultrasons à la catalyse par le fer. Ce procédé a été exploité par la suite pour concevoir et synthétiser les analogues glycosidiques du résvératrol. Enfin, nous avons mis au point une méthode efficace et peu couteuse d’azidation de sucres protégés. / Chronic myeloid leukemia (CML) is a malignant hematological disorder characterized by the formation, in the blood and bone marrow, of an excessive number of white blood cells, some of which are immature. Currently, the main treatment of CML is based on tyrosine-kinase inhibitors, such as Imatinib, the first approved drug of this class of compounds and marketed as Gleevec ®. However, this treatment results, in some patients, to the emergence of resistance, which complicates the treatment and requires a wide range of active molecules to circumvent resistance mechanisms. Therefore, the search for new bioactive molecules featuring new mode of action still remains a challenging.In this thesis project, we were interested in the design and discovery of new bioactive molecules in nucleoside series to circumvent resistance mechanisms in CML models, as well as in the development of new synthetic methods for the preparation of these targeted molecules. We first developed a clean and efficient procedure for the synthesis of new C- nucleoside analogues using iron catalysis. Then, several post-synthetic modifications were carried out, starting from halogenated nucleoside derivatives, to access highly functionalized C- nucleosides, as new analogues of thiophenefurin . We also developed a new procedure for the synthesis of O-glycosides using a cooperative effect of iron catalysis and ultrasound activation. This method has been applied for the synthesis of resveratrol O-glycosides. Finally, we developed an effecient and inexpensive method for anomeric sugar azidation. This method was applied for the synthesis of 1,2,3-triazolyl glycosides using a one-pot azidation-click procedure.

Un très grand nombre de travaux de recherche fait état de l’intérêt des oligonucléotides en tant qu’agents thérapeutiques. Les modes d’actions envisageables sont très variés (thérapie antisens, antigène, interférence ARN, etc.). Cependant, les propriétés pharmacocinétiques et pharmacodynamiques des oligonucléotides naturels ne permettent pas leurs utilisations in vivo. Leurs propriétés peuvent être améliorées par des modifications chimiques. Notre travail consiste à synthétiser une nouvelle génération d’oligoribonucléotides modifiés : les oligomères de nucléosides aminooxy acides. Dans ces oligomères, la liaison phosphodiester de l’ARN est remplacée par une liaison N-oxyamide -CONHO-. Cette liaison est stable vis-à-vis des hydrolyses chimiques et enzymatiques et est facilement engagée dans des liaisons hydrogène. La préparation de différents nucléosides aminooxy esters protégés à partir de l’uridine ou du D-(+)-glucose est présentée. Par ailleurs, les N-oxy PNA constituent une autre famille d’oligonucléotides modifiés présentant une liaison N-oxyamide. L’analyse structurale des monomères et des dimères de N-oxy PNA est détaillée.De plus, un projet en collaboration avec le LBPA s’intéresse à une méthode de détermination de la structure secondaire des ARN. Dans ce but, nous avons conçu, synthétisé et étudié des sondes chimiques ciblant le ribose des nucléotides non appariés d’ARN. L’emploi de catalyseurs nucléophiles comme la DMAP permet d’augmenter la réactivité des sondes. / A large number of researches report the interest of oligonucleotides as therapeutic agents. The modes of actions are very varied (antisense therapy, antigen therapy, RNA interference, etc.). However, the pharmacokinetic and pharmacodynamic properties of natural oligonucleotides do not allow their in vivo uses. Their properties can be improved by chemical modifications. Our work consists to synthesize a new generation of modified oligoribonucleotides: the oligomers of aminooxy acids nucleosides. In such oligomers, the phosphodiester bond of the RNA is replaced with a N-oxyamide bond -CONHO-. This linkage is stable to chemical and enzymatic hydrolysis and is easily engaged in hydrogen bondings. The preparation of different protected aminooxy esters nucleosides starting from uridine or D-(+)-glucose is presented. Furthermore, N-oxy PNA constitute another family of modified oligonucleotides having a N-oxyamide bond. Structural analysis of the monomers and the dimers of N-oxy PNA is detailed.In addition, a project in collaboration with the LBPA focuses on a method for determining the secondary structure of RNA. To this end, we designed, synthesized and studied chemical probes targeting ribose of unpaired nucleotides. The use of nucleophilic catalysts such as DMAP increases the reactivity of the probes.

Isolée d'une bactérie, Streptomyces alboniger, la puromycine est un nucléoside antibiotique naturel présentant une analogie structurale avec l'adénosine terminale de l'extrémité 3' de l'ARNt aminoacylé. Cette similarité confère à cette molécule la faculté de pouvoir s'insérer dans le site A (actif) du ribosome et d'inhiber la synthèse des protéines. Cependant, du fait de la formation d'un produit toxique lors de sa métabolisation, la puromycine n'a jamais été employée à des fins thérapeutiques chez l'homme. Néanmoins, utilisée en tant qu'outil synthétique, elle a largement contribué à une meilleure compréhension du mécanisme du transfert peptidique. Au travers de cette thèse, six analogues carbobicycliques (deux en série ribo et quatre en série 2'-désoxy), mimant de façon optimale les conformations extrêmes nord ou sud de la puromycine, ont été synthétisés puis testés dans le ribosome. Outre confirmer que la présence d'un groupement 2'-hydroxyle améliorait l'activité inhibitrice, ces expériences in vitro ont apporté une preuve que, dans le site actif, le déplacement de l'équilibre conformationnel du ribofuranose de l'adénosine terminale de l'ARNt aminoacylé - analogue structural de la puromycine - en faveur de son conformère nord pourrait être directement impliqué dans la catalyse ribosomale du transfert peptidique. Par ailleurs, un projet annexe sur le développement de nouveaux antipaludiques potentiels a permis la synthèse, en série xylo, de la puromycine et de son métabolite naturel le puromycine aminonucléoside. Ces composés ont été testés sur les souches 3D7 et Dd2 du parasite Plasmodium falciparum.

Cela fait plus de quarante ans que la plupart des modifications des ARNt ont été découvertes mais ce n’est que récemment que les gènes correspondants ont pu être identifié. La modification N6-threonylcarbamoyl adénosine (t6A) est universelle et se trouve à la position 37, adjacente de l’anticodon, dans de nombreux ARNt. Les quatre gènes responsables de la synthèse de cette modification chez les bactéries furent découverts par des approches de génomique comparative mais uniquement deux de ces gènes sont universels, TsaC/Sua5 et TsaD/Kae1/Qri7. Des travaux récents ont révélé qu'il existait différentes voies enzymatiques pour la synthèse de cette modification selon domaine de la vie, les organelles et les espèces considérés. L'étude de ces variations est toujours en cours de caractérisation.Ce travail a identifié quatre autres protéines requises pour la synthèse de t6A dans les ARNt cytoplasmiques de levure (Bud32, Pcc1, Cgi121 et Gon7) et établi que seuls Sua5 et Qri7 sont requis pour modifier les ARNt mitochondriaux. La même enzyme, Sua5, effectue la première étape de la synthèse de t6A à la fois dans le cytoplasme et les mitochondries. Cette protéine peut être localisée dans les deux compartiments grâce à l’utilisation de sites d’initiation de la traduction différents. Cette étude a montré qu’une machinerie de synthèse minimale est requise pour la synthèse de t6A dans les mitochondries, potentiellement similaire à la machinerie présente dans le dernier ancêtre commun. Les rôles de cette modification complexe in vivo semblent également varier. Par exemple, t6A est indispensable chez les procaryotes, mais pas dans la levure. Les causes des phénotypes pléïotropes observés lors de la diminution ou l'absence de t6A ne sont pas encore entièrement comprises. Nous avons pu élucider certains des rôles joués par la modification t6A, en effectuant une analyse globale des erreurs de traduction observées en absence de cette modification par analyse des profils ribosomaux. Par exemple, il semble que la présence de t6A permet aux ARNt rares de concurrencer plus efficacement les ARNt abondants. La complexité et la diversité des voies de synthèse combiné à l’importance fonctionnelle et évolutive de cette modification ont fait de t6A une “décoration” des ARNt particulièrement fascinante à étudier. / The modification of tRNA has a rich literature of biochemical analysis going back more than 40 years; however, the genes responsible for the modifications have only been recently identified. Comparative genomic analysis has allowed for the identification of the genes in bacteria, and subsequent characterization of the enzymes, responsible for the modification N6-threonylcarbamoyladenosine (t6A) located at position 37, adjacent to the anticodon of tRNAs. While the modification is present in all domains of life, only two of the four enzymes responsible for biosynthesis machinery are conserved. In Eukaryotes, both cytoplasmic and mitochondrial tRNAs are modified with t6A, and previously only the two universally conserved members of the cytoplasmic t6A synthesis pathway, TsaC/Sua5 and TsaD/KaeI/Qri7 were known. Recent progress on deciphering the t6A synthesis pathways has revealed that different solutions have been adopted in different kingdoms, species, and organelles, and these variant pathways are still being characterized.This investigation identified the other four proteins required for cytoplasmic synthesis (Bud32, Pcc1, Cgi121, Gon7), and determined that only Sua5 and Qri7 are required for mitochondrial synthesis of t6A in yeast. The same enzyme, Sua5, performs the first step of t6A synthesis in both the cytoplasm and the mitochondria. It is targeted to both the cytoplasm and the mitochondria through the use of alternative, in-frame AUG translational start sites. This study showed that a minimum synthesis machinery is responsible for mitochondrial t6A, implicating a core set of enzymes from the LUCA.The roles of this complex modification in vivo also seem to vary. For example, t6A is essential in prokaryotes, but not in yeast. The causes of the observed pleiotropic phenotypes triggered by the reduction or absence of t6A synthesis enzymes are not yet fully understood. This work used ribosome profiling to map all translation errors occurring when t6A was absent. By examining ribosomal occupancy of every codon, this work indicates that t6A is helping rare tRNAs compete with high copy tRNAs. The complexity and diversity of the t6A pathway combined with the functional and evolutionary importance of this modification have made t6A a particularly fascinating “decoration” of tRNA to study.