Submitted by Maurílio Figueiredo (maurilioafigueiredo@yahoo.com.br) on 2013-03-13T19:56:47Z No. of bitstreams: 1 TESE_InfluênciaMetabolismoExtracelular.PDF: 1475554 bytes, checksum: 99839ae26ebfc2a908a5ac279c901e2b (MD5) / Approved for entry into archive by Neide Nativa (neide@sisbin.ufop.br) on 2013-03-15T15:59:45Z (GMT) No. of bitstreams: 1 TESE_InfluênciaMetabolismoExtracelular.PDF: 1475554 bytes, checksum: 99839ae26ebfc2a908a5ac279c901e2b (MD5) / Made available in DSpace on 2013-03-15T15:59:45Z (GMT). No. of bitstreams: 1 TESE_InfluênciaMetabolismoExtracelular.PDF: 1475554 bytes, checksum: 99839ae26ebfc2a908a5ac279c901e2b (MD5) Previous issue date: 2008 / Variações nos quadros clínicos da leishmaniose, observadas tanto na doença em humanos quanto em murinos, sugerem a existência de uma diferenciação, dependente da espécie, na capacidade de parasitos do gênero Leishmania causarem lesões no hospedeiro. A procura de fatores que diferenciam as espécies de Leishmania quanto à sua virulência se faz, então, necessária para o entendimento dos mecanismos pelos quais esses parasitos causam danos aos seus hospedeiros, possibilitando a descoberta de novas ferramentas de potencial terapêutico contra a leishmaniose. Componentes da via de metabolismo do ATP extracelular são candidatos potenciais para fatores de virulência desses parasitos, visto que tanto o ATP quanto a adenosina, produto da hidrólise de AMP, são capazes de influenciar a resposta imunológica do hospedeiro e, conseqüentemente, o estabelecimento do parasito. Essa hipótese é suportada pelo fato da Leishmania necessitar da utilização da via de salvação de purinas pela ação de enzimas, dentre elas as apirases, sobre o ATP extracelular, que possui propriedades imunoestimulantes, para gerar adenosina, produto da hidrólise do AMP pelas 5’-nucleotidases, cuja importância para o metabolismo do parasito e para a regulação da resposta imune está bem descrita na literatura. Para testar essa hipótese, nós estudamos três espécies de Leishmania com diferentes graus de virulência em camundongos C57BL/6: a mais virulenta L. amazonensis e as espécies L. braziliensis e L. major. Inicialmente, formas promastigotas metacíclicas e procíclicas desses parasitos foram testadas para sua capacidade de hidrolisar ATP, ADP ou AMP. As formas metacíclicas (infectantes) de L. amazonensis mostraram maior capacidade de hidrólise para os três nucleotídeos analisados, quando comparadas com as outras duas espécies menos virulentas. Além disso, sua capacidade de hidrólise de ATP foi maior que a das formas procíclicas da mesma espécie, sugerindo um controle de expressão de ATPases dependente de metaciclogênese. Posteriormente, foi verificado pelas técnicas de RTPCR, e “Western blotting” que, a despeito da ocorrência de expressão de mRNA para as isoformas solúvel e de membrana de apirases nas promastigotas metacíclicas das três espécies estudadas, somente extratos enriquecidos de membrana de L. amazonensis foram capazes de apresentar reação com anticorpo anti-apirase de T. cruzi. O inóculo de promastigotas metacíclicas desse parasito na presença de suramina, um inibidor de ecto ATPases, em camundongos C57BL/6, levou a uma diminuição no tamanho de lesão a partir da quarta semana de infecção e no parasitismo em 7 semanas de infecção. Por outro lado, a indução de maior atividade 5’-nucleotidásica dos parasitos ou a administração simultânea de adenosina ao inóculo levou a um aumento transiente no tamanho de lesão e a um maior parasitismo em 3 ou 4 semanas de infecção da mesma cepa de camundongos por promastigotas metacíclicas de L. braziliensis, resultado oposto ao obtido após o tratamento, no momento do inóculo, com o bloqueador de receptores A2B de adenosina, MRS 1754. Em conjunto, esses resultados sugerem que a redução dos níveis de ATP extracelular pela ação de enzimas expressas pelo parasito e/ou a elevação dos níveis de adenosina podem contribuir para o estabelecimento de parasitos do gênero Leishmania no hospedeiro vertebrado, indicando um possível alvo para futuras intervenções de caráter terapêutico contra as leishmanioses. ____________________________________________________________________________________________________ / ABSTRACT: The observed changes in clinical features of leishmaniasis in humans and mice suggest the existence of a specie-dependent differentiation in Leishmania ability to cause lesions on host. The search of factors that differentiate Leishmania species regarding their virulence is very important to the comprehension of the mechanisms underlying the grade of damage that these parasites may cause to the host, enabling the discovery of new tools with therapeutic potential against leishmaniasis. Components of extracellular ATP metabolism pathway are emerging candidates to determine the virulence of these parasites, since ATP and adenosine, a product of AMP hydrolysis, are able to influence the immunological response of the host and, in consequence, the parasite establishment. This hypothesis is supported by the fact that Leishmania parasites need to use the salvation pathway of purine nucleotides by the action of enzymes, amongst them the apyrases, over extracellular ATP, which display immunestimulatory features, to produce adenosine, a product of AMP hydrolysis by the action of 5’-nucleotidases, whose importance to the parasite metabolism and to the regulation of the immune response has been described in literature. In order to verify this hypothesis, we use three Leishmania species with different degrees of virulence in C57BL/6 mice: the more virulent L. amazonensis and its counterparts L. braziliensis and L. major species. Initially, metacyclic and procyclic promastigotes from these parasites were evaluated regarding their ability in hydrolyze ATP, ADP and AMP. L. amazonensis infective metacyclic forms showed higher hydrolytic ability to the three analyzed nucleotides, when compared to the other two less virulent species. Moreover, its ability to hydrolyze ATP was higher than that from procyclic forms deriving from the same specie, suggesting a metacyclogenesis-dependent control of ATPase expression. Later, using RT-PCR and Western blotting analysis, we observed that, in spite of the occurring expression of mRNA to soluble and membrane-bound apirase isoforms from metacyclic promastigotes in the three species, only enriched membrane extracts from L. amazonensis were capable to react with T. cruzi anti-apyrase antibody. The inoculum of metacyclic promastigotes of this parasite in the presence of suramin, an ecto-ATPase inhibitor, in C57BL/6 mice, lead to a decrease in lesion size 4 weeks of infection onward and in parasitism 7 weeks after infection. Otherwise, the induction of higher 5’-nucleotidasic activity of the parasites or the simultaneous administration of adenosine in the inoculum lead to a transient increasing in lesion size and increased tissue parasitism 3 or 4 weeks after the infection of the same strain of mice with L. braziliensis metacyclic promastigotes, opposite to the effects obtained after the treatment, at the moment of inoculum, with the A2B receptor antagonist MRS 1754. Together, these results suggest that the reduction in the levels of extracellular ATP by the action of enzymes expressed by the parasite and/or the increased levels of adenosine may contribute to the establishment of Leishmania parasites in the vertebrate host, indicating a possible target to future therapeutic interventions against leishmaniasis.

Os nucleotídeos extracelulares modulam uma variedade de ações biológicas via ativação de receptores purinérgicos. Esses efeitos são controlados pela ação de ectonucleotidases, tais como as E-NTPDases e a ecto-5´-NT/CD73, as quais hidrolisam o ATP até adenosina no meio extracelular. Nas células imunes, o ATP pode atuar como uma molécula sinalizadora de perigo enquanto a adenosina, um produto da degradação do ATP, serve como um mecanismo que controla/limita a inflamação. Já, no sistema vascular, o ADP é um agonista fisiológico envolvido na hemostasia normal e na trombose. Considerando que os macrófagos são elementos chave para processos inflamatórios e quando estímulados exibibem um fenótipo pró-inflamatório/defesa (clássico/M1) ou antiinflamatório/reparatório (alterantivo/M2). O objetivo foi investigar a atividade e expressão das ectonuclotidases em diferentes fenótipos de macrófago e avaliar o efeito da homocisteína sobre essas enzimas em macrófagos e plaquetas.. As análises da diferenciação de macrófagos em fenótipo próinflamatório/ M1 e antiinflamatório/M2 revelaram presença igual de receptores purinérgicos. Entretanto, mudança no perfil das ectonucleotidases como E-NTPDase1, E-NTPDase3 e ecto-5’- nucleotidase foram encontradas, sugerindo que os macrófagos devem alterar a casacata purinérgica durante a ativação fenotípica. No fenótipo pró-inflamatório/M1 houve uma diminuição na hidrólise de ATP, sugerindo um acúmulo do mesmo, enquanto no fenótipo antiinflamatório/M2 as enzimas conduzem para uma progressiva diminuição nas concentrações de nucleotídeos (ATP) e aumento na disponibilidade de adenosina. Já os macrófagos expostos a homocisteína apresentaram uma polarização para o fenótipo pro-inflamatório (M1) e nossos achados sugerem o envolvimento da ENTPDase3 e da ecto-5’-nucleotidase em macrófagos nas complicações inflamatórias associadas a homocisteína. Nas plaquetas, as quais são elementos fundamentais no processo de trombogênese, a homocisteína causou uma diminuição na hifrólise de ADP. Essa elevação no nível de ADP ao redor das plaquetas devido a inativação das ectonucleotidases, causada pela homocisteína, deve estar contribuindo para o aumento do risco trombótico descrito em pacientes com hiperhomocisteinemia. Além disso, os animais que receberam homocisteína tiveram um aumento na agregação plaquetária induzida por ADP. Em conclusão, os resultados do presente estudo reforçam o envolvimento do sistema purinérgico em processos inflamatórios/trombóticos e apontam parar o desenvolvimeto de tratamentos para doenças inflamatórias/trobóticas. / Extracellular nucleotides modulate a variety of biological actions via purinergic receptor activation. These effects are modulated by ectonucleotidases, such as ENTPDases and ecto-5´- NT/CD73, which hydrolyze ATP to adenosine in the extracellular milieu. In the cells of the immune system, the ATP can act as danger signaling whereas adenosine, the ATP breakdown product, serves as a negative feedback mechanism to limit inflammation. Already, in the vasculare system, the ADP is a physiological agonist involved in normal hemostasis and thrombosis. Since, macrophages are key to inflammatory process, that depending on the microenvironmental stimulation exhibit proinflammatory/ defense (classical/M1) and antiinflammatory/reparatory (alternative/M2) phenotype. The objective of this study was investigate the activity and expression of the ectonuclotidases in differential macrophage phenotype and evaluate the homocysteine (Hcy) effects on theses enzymes in macrophages and platelets. . The analysis of differential macrophages in phenotype proinflamatory/ M1 and antiinflamatory/M2 showed the same expression to P1 and P2 purinoreceptors. However, change profile of the ectonucleotidases as E-NTPDase1, E-NTPDase3 and ecto-5’- nucleotidase enzymes in macrophages during phenotypic differentiation were found, suggesting that macrophages must alter the purinergic cascade during macrophages differentiation phenotypic. In the pro-inflamatory/M1 phenotype the ATP hydrolysis decreased, suggesting ATP accumulation. On the other hand, the antiinflamatory/M2 phenotype the enzymes lead to a progressive decrease in nucleotides (ATP) concentrations and an increase the adenosine availability. Already, the macrophages exposed to Hcy present a polarized pro-inflammatory profile (M1) and our findings suggest the involvement of the E-NTPDase3 and ecto-5’-nucleotidase in the inflammatory complications associates to homocysteine. In the Platelets, which are fundamental elements to the thrombogenesis process, the homocysteine decreased ADP hydrolysis. This elevation of ADP around of the platelets due inactivating of ectonucleotidase, probably by the indirect action of Hcy, may be contributing to increase thrombotic risk described in individuals with hyperhomocysteinemia. In addition, the animals that received Hcy treatment potentiate platelet aggregation induced by ADP. In conclusion, in the present study the results reinforce purinergic signaling involvement in inflammatory/thrombosis process and point to development of treatments to inflammatory/thrombotic diseases.

Os gliomas são os tumores primários mais comuns e devastadores que atingem o sistema nervoso central. O prognóstico para pacientes com estes tumores é ruim, e apesar de intensos esforços para o desenvolvimento de novas terapias, agentes efetivos ainda não estão disponíveis. A ecto-5‟-nucleotidase/CD73 (ecto-5‟-NT/CD73) regula os níveis extracelulares de AMP e adenosina, a qual tem sido amplamente descrita como fator indutor de proliferação celular. A ecto-5‟-NT/CD73 per se tem sido relatada como proteína envolvida no controle dos processos de crescimento, maturação, diferenciação, invasão e migração celular, além do processo de formação de metástases. No presente estudo nós avaliamos a atividade enzimática e as funções da ecto-5‟-NT/CD73 durante o processo proliferativo em linhagens de glioma C6 e U138-MG. Os resultados obtidos demonstram que ocorre um aumento da atividade da ecto-5‟-NT/CD73 com o aumento da confluência celular, quer seja esta obtida por semeadura de crescentes densidades celulares ou por crescentes dias de cultivo, em ambas as linhagens estudadas. As análises por RT-PCR e citometria de fluxo revelaram um aumento dos níveis de mRNA e proteína da ecto-5‟-NT/CD73, respectivamente quando comparadas culturas confluentes com culturas subconfluentes em linhagem de glioma humano U138-MG. Nesta mesma linhagem, o tratamento com 1 M de APCP, inibidor competitivo da ecto-5‟-NT/CD73 causou uma significativa redução de 20% na proliferação celular, enquanto a adenosina aumentou este processo em 25%. Por outro lado, 1 mM e 3 mM de AMP reduziram a proliferação em 29% e 42% respectivamente. Além disso, o silenciamento estável da ecto-5‟-NT/CD73 pela técnica do RNAi reduziu o processo de migração celular na linhagem de glioma humano U138-MG. Em conjunto, Estes resultados sugerem a participação da ecto-5‟-NT/CD73 na proliferação celular, sendo este processo desencadeado pela geração de adenosina (fator proliferativo), pela remoção dos níveis citotóxicos de AMP e pela participação per se da ecto-5‟-NT/CD73 como proteína de adesão. / Malignant gliomas are the most common and devastating primary tumors in the central nervous system. Despite treatment, patients with these tumors have a poor prognosis. Ecto-5‟-nucleotidase/CD73 (ecto-5‟-NT/CD73) may regulate the extracellular AMP and adenosine levels, which have been described as proliferation factor. The participation of ecto-5‟-NT/CD73 per se has been proposed as a proliferative factor, being involved in the control of cell growth, maturation, differentiation, invasion, migration and metastases processes. In the present study, we evaluate the ecto-5‟-NT/CD73 activity and functions in rat C6 and human U138-MG glioma cell lines proliferation process. Crescent confluences and culture times leads to an increase on ecto-5‟-NT/CD73 activity in both C6 and U138-MG glioma cells. RT-PCR analysis and flow cytometry showed a significant increase on ecto-5‟-NT/CD73 mRNA and protein levels respectively, when compared confluent cultures with subconfluent one in human U138-MG glioma cells. Treatment with 1 M APCP, a competitive ecto-5‟-NT inhibitor, caused a significant reduction in glioma cell proliferation of 20% for U138-MG glioma cell line. In addition, 100 M adenosine increases cell proliferation in 25% and AMP 1m M and 3 mM decrease U138-MG glioma cells proliferation in 29% and 42% respectively. The stable silencement of ecto-5‟-NT/CD73 by RNAi technique reduces cell migration in human U138-MG glioma cell line. Taken together these results suggest the participation of ecto-5‟-NT/CD73 in cell proliferation, being this process dependent of enzymatic activity generating adenosine, a proliferative factor and removing toxic levels of AMP, as well as a function as adhesive molecule.

Os gliomas são os tumores primários mais comuns e devastadores que atingem o sistema nervoso central. O prognóstico para pacientes com estes tumores é ruim, e apesar de intensos esforços para o desenvolvimento de novas terapias, agentes efetivos ainda não estão disponíveis. A ecto-5‟-nucleotidase/CD73 (ecto-5‟-NT/CD73) regula os níveis extracelulares de AMP e adenosina, a qual tem sido amplamente descrita como fator indutor de proliferação celular. A ecto-5‟-NT/CD73 per se tem sido relatada como proteína envolvida no controle dos processos de crescimento, maturação, diferenciação, invasão e migração celular, além do processo de formação de metástases. No presente estudo nós avaliamos a atividade enzimática e as funções da ecto-5‟-NT/CD73 durante o processo proliferativo em linhagens de glioma C6 e U138-MG. Os resultados obtidos demonstram que ocorre um aumento da atividade da ecto-5‟-NT/CD73 com o aumento da confluência celular, quer seja esta obtida por semeadura de crescentes densidades celulares ou por crescentes dias de cultivo, em ambas as linhagens estudadas. As análises por RT-PCR e citometria de fluxo revelaram um aumento dos níveis de mRNA e proteína da ecto-5‟-NT/CD73, respectivamente quando comparadas culturas confluentes com culturas subconfluentes em linhagem de glioma humano U138-MG. Nesta mesma linhagem, o tratamento com 1 M de APCP, inibidor competitivo da ecto-5‟-NT/CD73 causou uma significativa redução de 20% na proliferação celular, enquanto a adenosina aumentou este processo em 25%. Por outro lado, 1 mM e 3 mM de AMP reduziram a proliferação em 29% e 42% respectivamente. Além disso, o silenciamento estável da ecto-5‟-NT/CD73 pela técnica do RNAi reduziu o processo de migração celular na linhagem de glioma humano U138-MG. Em conjunto, Estes resultados sugerem a participação da ecto-5‟-NT/CD73 na proliferação celular, sendo este processo desencadeado pela geração de adenosina (fator proliferativo), pela remoção dos níveis citotóxicos de AMP e pela participação per se da ecto-5‟-NT/CD73 como proteína de adesão. / Malignant gliomas are the most common and devastating primary tumors in the central nervous system. Despite treatment, patients with these tumors have a poor prognosis. Ecto-5‟-nucleotidase/CD73 (ecto-5‟-NT/CD73) may regulate the extracellular AMP and adenosine levels, which have been described as proliferation factor. The participation of ecto-5‟-NT/CD73 per se has been proposed as a proliferative factor, being involved in the control of cell growth, maturation, differentiation, invasion, migration and metastases processes. In the present study, we evaluate the ecto-5‟-NT/CD73 activity and functions in rat C6 and human U138-MG glioma cell lines proliferation process. Crescent confluences and culture times leads to an increase on ecto-5‟-NT/CD73 activity in both C6 and U138-MG glioma cells. RT-PCR analysis and flow cytometry showed a significant increase on ecto-5‟-NT/CD73 mRNA and protein levels respectively, when compared confluent cultures with subconfluent one in human U138-MG glioma cells. Treatment with 1 M APCP, a competitive ecto-5‟-NT inhibitor, caused a significant reduction in glioma cell proliferation of 20% for U138-MG glioma cell line. In addition, 100 M adenosine increases cell proliferation in 25% and AMP 1m M and 3 mM decrease U138-MG glioma cells proliferation in 29% and 42% respectively. The stable silencement of ecto-5‟-NT/CD73 by RNAi technique reduces cell migration in human U138-MG glioma cell line. Taken together these results suggest the participation of ecto-5‟-NT/CD73 in cell proliferation, being this process dependent of enzymatic activity generating adenosine, a proliferative factor and removing toxic levels of AMP, as well as a function as adhesive molecule.

Os nucleotídeos extracelulares modulam uma variedade de ações biológicas via ativação de receptores purinérgicos. Esses efeitos são controlados pela ação de ectonucleotidases, tais como as E-NTPDases e a ecto-5´-NT/CD73, as quais hidrolisam o ATP até adenosina no meio extracelular. Nas células imunes, o ATP pode atuar como uma molécula sinalizadora de perigo enquanto a adenosina, um produto da degradação do ATP, serve como um mecanismo que controla/limita a inflamação. Já, no sistema vascular, o ADP é um agonista fisiológico envolvido na hemostasia normal e na trombose. Considerando que os macrófagos são elementos chave para processos inflamatórios e quando estímulados exibibem um fenótipo pró-inflamatório/defesa (clássico/M1) ou antiinflamatório/reparatório (alterantivo/M2). O objetivo foi investigar a atividade e expressão das ectonuclotidases em diferentes fenótipos de macrófago e avaliar o efeito da homocisteína sobre essas enzimas em macrófagos e plaquetas.. As análises da diferenciação de macrófagos em fenótipo próinflamatório/ M1 e antiinflamatório/M2 revelaram presença igual de receptores purinérgicos. Entretanto, mudança no perfil das ectonucleotidases como E-NTPDase1, E-NTPDase3 e ecto-5’- nucleotidase foram encontradas, sugerindo que os macrófagos devem alterar a casacata purinérgica durante a ativação fenotípica. No fenótipo pró-inflamatório/M1 houve uma diminuição na hidrólise de ATP, sugerindo um acúmulo do mesmo, enquanto no fenótipo antiinflamatório/M2 as enzimas conduzem para uma progressiva diminuição nas concentrações de nucleotídeos (ATP) e aumento na disponibilidade de adenosina. Já os macrófagos expostos a homocisteína apresentaram uma polarização para o fenótipo pro-inflamatório (M1) e nossos achados sugerem o envolvimento da ENTPDase3 e da ecto-5’-nucleotidase em macrófagos nas complicações inflamatórias associadas a homocisteína. Nas plaquetas, as quais são elementos fundamentais no processo de trombogênese, a homocisteína causou uma diminuição na hifrólise de ADP. Essa elevação no nível de ADP ao redor das plaquetas devido a inativação das ectonucleotidases, causada pela homocisteína, deve estar contribuindo para o aumento do risco trombótico descrito em pacientes com hiperhomocisteinemia. Além disso, os animais que receberam homocisteína tiveram um aumento na agregação plaquetária induzida por ADP. Em conclusão, os resultados do presente estudo reforçam o envolvimento do sistema purinérgico em processos inflamatórios/trombóticos e apontam parar o desenvolvimeto de tratamentos para doenças inflamatórias/trobóticas. / Extracellular nucleotides modulate a variety of biological actions via purinergic receptor activation. These effects are modulated by ectonucleotidases, such as ENTPDases and ecto-5´- NT/CD73, which hydrolyze ATP to adenosine in the extracellular milieu. In the cells of the immune system, the ATP can act as danger signaling whereas adenosine, the ATP breakdown product, serves as a negative feedback mechanism to limit inflammation. Already, in the vasculare system, the ADP is a physiological agonist involved in normal hemostasis and thrombosis. Since, macrophages are key to inflammatory process, that depending on the microenvironmental stimulation exhibit proinflammatory/ defense (classical/M1) and antiinflammatory/reparatory (alternative/M2) phenotype. The objective of this study was investigate the activity and expression of the ectonuclotidases in differential macrophage phenotype and evaluate the homocysteine (Hcy) effects on theses enzymes in macrophages and platelets. . The analysis of differential macrophages in phenotype proinflamatory/ M1 and antiinflamatory/M2 showed the same expression to P1 and P2 purinoreceptors. However, change profile of the ectonucleotidases as E-NTPDase1, E-NTPDase3 and ecto-5’- nucleotidase enzymes in macrophages during phenotypic differentiation were found, suggesting that macrophages must alter the purinergic cascade during macrophages differentiation phenotypic. In the pro-inflamatory/M1 phenotype the ATP hydrolysis decreased, suggesting ATP accumulation. On the other hand, the antiinflamatory/M2 phenotype the enzymes lead to a progressive decrease in nucleotides (ATP) concentrations and an increase the adenosine availability. Already, the macrophages exposed to Hcy present a polarized pro-inflammatory profile (M1) and our findings suggest the involvement of the E-NTPDase3 and ecto-5’-nucleotidase in the inflammatory complications associates to homocysteine. In the Platelets, which are fundamental elements to the thrombogenesis process, the homocysteine decreased ADP hydrolysis. This elevation of ADP around of the platelets due inactivating of ectonucleotidase, probably by the indirect action of Hcy, may be contributing to increase thrombotic risk described in individuals with hyperhomocysteinemia. In addition, the animals that received Hcy treatment potentiate platelet aggregation induced by ADP. In conclusion, in the present study the results reinforce purinergic signaling involvement in inflammatory/thrombosis process and point to development of treatments to inflammatory/thrombotic diseases.

Os nucleotídeos extracelulares modulam uma variedade de ações biológicas via ativação de receptores purinérgicos. Esses efeitos são controlados pela ação de ectonucleotidases, tais como as E-NTPDases e a ecto-5´-NT/CD73, as quais hidrolisam o ATP até adenosina no meio extracelular. Nas células imunes, o ATP pode atuar como uma molécula sinalizadora de perigo enquanto a adenosina, um produto da degradação do ATP, serve como um mecanismo que controla/limita a inflamação. Já, no sistema vascular, o ADP é um agonista fisiológico envolvido na hemostasia normal e na trombose. Considerando que os macrófagos são elementos chave para processos inflamatórios e quando estímulados exibibem um fenótipo pró-inflamatório/defesa (clássico/M1) ou antiinflamatório/reparatório (alterantivo/M2). O objetivo foi investigar a atividade e expressão das ectonuclotidases em diferentes fenótipos de macrófago e avaliar o efeito da homocisteína sobre essas enzimas em macrófagos e plaquetas.. As análises da diferenciação de macrófagos em fenótipo próinflamatório/ M1 e antiinflamatório/M2 revelaram presença igual de receptores purinérgicos. Entretanto, mudança no perfil das ectonucleotidases como E-NTPDase1, E-NTPDase3 e ecto-5’- nucleotidase foram encontradas, sugerindo que os macrófagos devem alterar a casacata purinérgica durante a ativação fenotípica. No fenótipo pró-inflamatório/M1 houve uma diminuição na hidrólise de ATP, sugerindo um acúmulo do mesmo, enquanto no fenótipo antiinflamatório/M2 as enzimas conduzem para uma progressiva diminuição nas concentrações de nucleotídeos (ATP) e aumento na disponibilidade de adenosina. Já os macrófagos expostos a homocisteína apresentaram uma polarização para o fenótipo pro-inflamatório (M1) e nossos achados sugerem o envolvimento da ENTPDase3 e da ecto-5’-nucleotidase em macrófagos nas complicações inflamatórias associadas a homocisteína. Nas plaquetas, as quais são elementos fundamentais no processo de trombogênese, a homocisteína causou uma diminuição na hifrólise de ADP. Essa elevação no nível de ADP ao redor das plaquetas devido a inativação das ectonucleotidases, causada pela homocisteína, deve estar contribuindo para o aumento do risco trombótico descrito em pacientes com hiperhomocisteinemia. Além disso, os animais que receberam homocisteína tiveram um aumento na agregação plaquetária induzida por ADP. Em conclusão, os resultados do presente estudo reforçam o envolvimento do sistema purinérgico em processos inflamatórios/trombóticos e apontam parar o desenvolvimeto de tratamentos para doenças inflamatórias/trobóticas. / Extracellular nucleotides modulate a variety of biological actions via purinergic receptor activation. These effects are modulated by ectonucleotidases, such as ENTPDases and ecto-5´- NT/CD73, which hydrolyze ATP to adenosine in the extracellular milieu. In the cells of the immune system, the ATP can act as danger signaling whereas adenosine, the ATP breakdown product, serves as a negative feedback mechanism to limit inflammation. Already, in the vasculare system, the ADP is a physiological agonist involved in normal hemostasis and thrombosis. Since, macrophages are key to inflammatory process, that depending on the microenvironmental stimulation exhibit proinflammatory/ defense (classical/M1) and antiinflammatory/reparatory (alternative/M2) phenotype. The objective of this study was investigate the activity and expression of the ectonuclotidases in differential macrophage phenotype and evaluate the homocysteine (Hcy) effects on theses enzymes in macrophages and platelets. . The analysis of differential macrophages in phenotype proinflamatory/ M1 and antiinflamatory/M2 showed the same expression to P1 and P2 purinoreceptors. However, change profile of the ectonucleotidases as E-NTPDase1, E-NTPDase3 and ecto-5’- nucleotidase enzymes in macrophages during phenotypic differentiation were found, suggesting that macrophages must alter the purinergic cascade during macrophages differentiation phenotypic. In the pro-inflamatory/M1 phenotype the ATP hydrolysis decreased, suggesting ATP accumulation. On the other hand, the antiinflamatory/M2 phenotype the enzymes lead to a progressive decrease in nucleotides (ATP) concentrations and an increase the adenosine availability. Already, the macrophages exposed to Hcy present a polarized pro-inflammatory profile (M1) and our findings suggest the involvement of the E-NTPDase3 and ecto-5’-nucleotidase in the inflammatory complications associates to homocysteine. In the Platelets, which are fundamental elements to the thrombogenesis process, the homocysteine decreased ADP hydrolysis. This elevation of ADP around of the platelets due inactivating of ectonucleotidase, probably by the indirect action of Hcy, may be contributing to increase thrombotic risk described in individuals with hyperhomocysteinemia. In addition, the animals that received Hcy treatment potentiate platelet aggregation induced by ADP. In conclusion, in the present study the results reinforce purinergic signaling involvement in inflammatory/thrombosis process and point to development of treatments to inflammatory/thrombotic diseases.

Os gliomas são os tumores primários mais comuns e devastadores que atingem o sistema nervoso central. O prognóstico para pacientes com estes tumores é ruim, e apesar de intensos esforços para o desenvolvimento de novas terapias, agentes efetivos ainda não estão disponíveis. A ecto-5‟-nucleotidase/CD73 (ecto-5‟-NT/CD73) regula os níveis extracelulares de AMP e adenosina, a qual tem sido amplamente descrita como fator indutor de proliferação celular. A ecto-5‟-NT/CD73 per se tem sido relatada como proteína envolvida no controle dos processos de crescimento, maturação, diferenciação, invasão e migração celular, além do processo de formação de metástases. No presente estudo nós avaliamos a atividade enzimática e as funções da ecto-5‟-NT/CD73 durante o processo proliferativo em linhagens de glioma C6 e U138-MG. Os resultados obtidos demonstram que ocorre um aumento da atividade da ecto-5‟-NT/CD73 com o aumento da confluência celular, quer seja esta obtida por semeadura de crescentes densidades celulares ou por crescentes dias de cultivo, em ambas as linhagens estudadas. As análises por RT-PCR e citometria de fluxo revelaram um aumento dos níveis de mRNA e proteína da ecto-5‟-NT/CD73, respectivamente quando comparadas culturas confluentes com culturas subconfluentes em linhagem de glioma humano U138-MG. Nesta mesma linhagem, o tratamento com 1 M de APCP, inibidor competitivo da ecto-5‟-NT/CD73 causou uma significativa redução de 20% na proliferação celular, enquanto a adenosina aumentou este processo em 25%. Por outro lado, 1 mM e 3 mM de AMP reduziram a proliferação em 29% e 42% respectivamente. Além disso, o silenciamento estável da ecto-5‟-NT/CD73 pela técnica do RNAi reduziu o processo de migração celular na linhagem de glioma humano U138-MG. Em conjunto, Estes resultados sugerem a participação da ecto-5‟-NT/CD73 na proliferação celular, sendo este processo desencadeado pela geração de adenosina (fator proliferativo), pela remoção dos níveis citotóxicos de AMP e pela participação per se da ecto-5‟-NT/CD73 como proteína de adesão. / Malignant gliomas are the most common and devastating primary tumors in the central nervous system. Despite treatment, patients with these tumors have a poor prognosis. Ecto-5‟-nucleotidase/CD73 (ecto-5‟-NT/CD73) may regulate the extracellular AMP and adenosine levels, which have been described as proliferation factor. The participation of ecto-5‟-NT/CD73 per se has been proposed as a proliferative factor, being involved in the control of cell growth, maturation, differentiation, invasion, migration and metastases processes. In the present study, we evaluate the ecto-5‟-NT/CD73 activity and functions in rat C6 and human U138-MG glioma cell lines proliferation process. Crescent confluences and culture times leads to an increase on ecto-5‟-NT/CD73 activity in both C6 and U138-MG glioma cells. RT-PCR analysis and flow cytometry showed a significant increase on ecto-5‟-NT/CD73 mRNA and protein levels respectively, when compared confluent cultures with subconfluent one in human U138-MG glioma cells. Treatment with 1 M APCP, a competitive ecto-5‟-NT inhibitor, caused a significant reduction in glioma cell proliferation of 20% for U138-MG glioma cell line. In addition, 100 M adenosine increases cell proliferation in 25% and AMP 1m M and 3 mM decrease U138-MG glioma cells proliferation in 29% and 42% respectively. The stable silencement of ecto-5‟-NT/CD73 by RNAi technique reduces cell migration in human U138-MG glioma cell line. Taken together these results suggest the participation of ecto-5‟-NT/CD73 in cell proliferation, being this process dependent of enzymatic activity generating adenosine, a proliferative factor and removing toxic levels of AMP, as well as a function as adhesive molecule.

A 5' AMP-degrading activity appears during the course of development in Dictyostelium discoideum between the prestalk and prespore zones. This enzyme is referred as 5'-Nucleotidase (5NT). Given the critical role of cyclic AMP in cell differentiation in this organism, 5NT is thought to be involved in cell positioning during development. Southern blot analysis showed a single form of the gene. The expression of the 5nt gene is known to be developmentally regulated. The message appears first at about 5 hr of the Dictyostelium development and remains constant throughout the rest of the development. Primer extension indicated two potential transcriptional start sites (118 bp and 148 bp upstream of the ATG initiation codon) for the 5nt expression. The 5nt promoter region was cloned and analyzed to investigate the expression of 5nt. Analysis of the cloned 5nt promoter fused to lacZ enabled the localization of the 5nt expression in pstAB cells during development. To identify cis-acting regulatory sequences, a series of 5' and internal promoter deletions were generated and fused to a luciferase reporter gene. The reporter activity driven by the 1,212 bp promoter started at the early aggregation stage, in agreement with temporal expression of the 5nt gene. Also, the expression was induced by exogenous cAMP. The reporter activity was high and relatively equivalent for all deletion constructs that contained 547 bp or more of the promoter region. No luciferase activity was detected using 365 bp or less of the promoter. A gradual decrease in activity was observed when three deletion constructs between -547 and -365 bp were tested suggesting the presence of at least two cis-regulatory elements within this region. Internal deletion analysis indicated another potential regulatory region located between -307 and -226 bp. To identify protein factor(s) that bind specifically to these regulatory sequences, gel shift assays were performed. Two bands, 0.33 Rf and 0.13 Rf, were detected in both cytoplasmic and nuclear extracts using radiolabeled DNA fragments located between -227 and -198 bp and -252 and -203 bp of the promoter region, respectively. Competition experiments confirmed the specificity of binding. The protein factors in these DNA binding activities were purified using various chromatography techniques. Mass spectrometry analysis of the purified 70 kDa protein corresponding to the 0.33 Rf band activity and a subsequent search in the Dictyostelium genomic database revealed that the purified protein was a putative formyltetrahydrofolate synthase. / Ph. D.

Gene regulation is a critical aspect of normal development, energy conservation, metabolic control, and responses to environmental cues, diseases and pathogens in eukaryotic organisms. In order to appropriately respond to environmental changes and advance through the life cycle, an organism must manage the expression levels of a large number of genes by utilizing available gene regulation mechanisms. The developmental control of 5â -nucleotidase (5nt) expression in the model system Dictyostelium discoideum has provided a focal point for studies of gene regulation at the level of transcription. In order to identify temporally-regulated control elements within the promoter of the 5nt gene, 5â and internal promoter deletions were designed and fused to the luciferase and lacZ reporter genes, and reporter enzyme activity was measured in cells from the slug stage of development. The results from these experiments enabled the identification of a 250 bp region of the promoter, which was used as a template for subsequent site-directed mutagenesis experiments. These experiments involved altering 6-12 bp regions of the promoter by substitution. Twelve mutagenized promoters were fused to the luciferase and lacZ reporter genes, and activity was measured at the slug stage of development to more precisely locate cis-acting temporally-regulated control elements. In addition, cAMP induction experiments were performed on amoebae transformed with the mutagenized promoters to identify control elements within the promoter influenced by the presence of cAMP. The regions between -530 and -560 bp and -440 and -460 bp from the ATG translation start site. In order to evaluate the functions of the cis-acting promoter control elements, electromobility gel shift assays were performed to identify specific DNA-protein interactions on the 5nt promoter. These assays enabled the detection of a 0.13 Rf and 0.33 Rf binding activity to specific sites of the promoter. After characterization of these binding activities, both proteins were purified by a series of column chromatography techniques and characterized after mass spectrometry. The proteins purified were identified as formyltetrahydrofolate synthase and hydroxymethylpterin pyrophosphokinase. These enzymes function in the biosynthetic pathway of tetrahydrofolate and the production of folate coenzymes. The specific interactions of these enzymes with the 5nt promoter suggest these proteins may also function in regulating 5nt expression. / Ph. D.

Estudos anteriores realizados no Laboratório de Erros Inatos do Metabolismo demonstraram que fenilalanina (Phe) 2,0 mM ou fenilpiruvato (PP) 5,0 mM, um metabólito desaminado da Phe, reduzem a atividade da ATP-difosfoidrolase em sinaptossomas de córtex cerebral de ratos. Já estudos do efeito da Phe e do fenilactato sobre a atividade da Na+K+-ATPase, enzima envolvida na manutenção do potencial de membrana e na integridade celular no cérebro, demonstraram seus efeitos inibitórios, bem como a reversão destes efeitos pela alanina (Ala), competitivamente. Por outro lado, quando testada isoladamente, a alanina não altera a atividade da enzima. Resultados semelhantes foram observados em relação à fosforilação de proteínas de citoesqueleto neuronal na presença de Phe e/ou Ala. O presente estudo teve como principal objetivo caracterizar a inibição causada por Phe ou PP sobre a atividade da ATP-difosfoidrolase. Considerando que a ATP- difosfoidrolase participa com a 5’-nucleotidase na síntese de adenosina a partir do ATP e do ADP, decidimos investigar também os efeitos “in vitro” da Phe ou do PP sobre a atividade da 5’-nucleotidase na mesma fração. Além disso, considerando que a alanina reverte o efeito inibitório da Phe sobre algumas enzimas, decidimos investigar o efeito daquele aminoácido sobre as atividades da ATP-difosfoidrolase e da 5’-nucleotidase, bem como a possibilidade da alanina reverter efeitos inibitórios provocados pela Phe ou pelo PP sobre a atividade da ATP-difosfoidrolase. Os sinaptossomas foram preparados a partir de córtex cerebral de ratos com idade entre 25 e 35 dias para determinação das atividades da ATP-difosfoidrolase e da 5’-nucleotidase. A Phe ou o PP inibiram a atividade da ATP- difosfoidrolase em aproximadamente 20%, no entanto, a atividade da 5’-nucleotidase não foi afetada pelos dois metabólitos. Os resultados dos estudos cinéticos realizados com ATP-difosfoidrolase sugerem que ADP, Phe e PP agem sobre o mesmo sítio da enzima. A alanina não altera as atividades da ATP-difosfoidrolase e da 5’-nucleotidase e, quando testada em associação com Phe 1,5 mM ou com PP 5,0 mM, não reverteu os efeitos inibitórios provocados pelos mesmos. Considerando a importância da atividade da ATP- difosfoidrolase para a degradação do neurotransmissor ATP em sistema nervoso central, se os efeitos observados “in vitro” também ocorrerem “in vivo”, a inibição da enzima pode ser um dos mecanismos que levam ao dano cerebral característico da fenilcetonúria.