Submitted by ALICE HADDAD DO PRADO null (alicehaddadp@gmail.com) on 2016-07-28T18:49:52Z No. of bitstreams: 1 Dissertação Final - Alice Haddad do Prado.pdf: 2393386 bytes, checksum: fa64a942cd6063384776f9d717e0e7d7 (MD5) / Rejected by Felipe Augusto Arakaki (arakaki@reitoria.unesp.br), reason: Solicitamos que realize uma nova submissão seguindo a orientação abaixo: O arquivo submetido está sem a ficha catalográfica. A versão submetida por você é considerada a versão final da dissertação/tese, portanto não poderá ocorrer qualquer alteração em seu conteúdo após a aprovação. Corrija esta informação e realize uma nova submissão contendo o arquivo correto. Agradecemos a compreensão. on 2016-07-29T16:16:30Z (GMT) / Submitted by ALICE HADDAD DO PRADO null (alicehaddadp@gmail.com) on 2016-07-29T16:26:20Z No. of bitstreams: 1 Dissertação - Alice Haddad do Prado.pdf: 2329800 bytes, checksum: 60401746b6bc1cb494e5e3107ef17ec6 (MD5) / Approved for entry into archive by Felipe Augusto Arakaki (arakaki@reitoria.unesp.br) on 2016-08-01T14:37:37Z (GMT) No. of bitstreams: 1 prado_ah_me_arafcf.pdf: 2329800 bytes, checksum: 60401746b6bc1cb494e5e3107ef17ec6 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-08-01T14:37:37Z (GMT). No. of bitstreams: 1 prado_ah_me_arafcf.pdf: 2329800 bytes, checksum: 60401746b6bc1cb494e5e3107ef17ec6 (MD5) Previous issue date: 2016-05-24 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / O p-metoxicinamato de octila (OMC) vem sendo empregado em protetores solares objetivando a prevenção do câncer de pele e envelhecimento precoce. Todavia, estudos têm detectado a presença deste filtro solar em amostras de sangue, urina e leite após sua administração cutânea. Para promover a retenção do OMC nas camadas mais externas da pele, bem como protegê-lo da fotodegradação, sua incorporação em carreador lipídico nanoestruturado (CLN) pode ser interessante, pois este sistema permite maior retenção cutânea do ativo e consequentemente menor permeação pela pele, além de maior proteção e encapsulação. O objetivo deste trabalho foi avaliar o potencial de CLN como estratégia para incorporação do OMC. Os CLNs foram compostos por: miristato de miristila (MM) como lipídeo sólido, triglicerídeo de ácido cáprico e caprílico (TACC) como lipídeo líquido e tween 80 (T80) como tensoativo (F1), associados ou não à fosfatidilcolina de soja (FS) – F2 ou óleo de rícino (OR) – F3. O OMC foi adicionado na fase lipídica na concentração de 1,0%, obtendo-se as formulações F1.OMC, F2.OMC e F3.OMC. A caracterização dos sistemas foi realizada a partir de análises de diâmetro médio, polidispersidade, potencial zeta, calorimetria diferencial exploratória, microscopia de força atômica e microscopia eletrônica de varredura. Foi realizada a eficiência de encapsulação das formulações, além de ensaios de determinação do fator de proteção solar (FPS), liberação, permeação, retenção cutânea e citotoxicidade in vitro. Também, foi desenvolvido um método analítico para a quantificação do OMC por cromatografia líquida de ultra eficiência (UPLC) com fase móvel constituída por 80:20 de acetonitrila e água ácida. As formulações desenvolvidas apresentaram valores de diâmetro hidrodinâmico médio entre 90 e 250 nm, índice de polidispersidade de 0,09 até 0,26 e potencial zeta de aproximadamente -20 mV. As análises de microscopia de força atômica e microscopia eletrônica de varredura sugeriram que as formulações apresentam formato esférico. Os resultados de DSC mostraram que os sistemas apresentaram estrutura cristalina, sofrendo alteração com a incorporação de OMC, além do aumento no ponto de fusão. Os resultados indicaram valores de FPS de aproximadamente 40 para as formulações. Os ensaios de liberação in vitro demonstraram que o OMC foi liberado das formulações seguindo o modelo matemático proposto por Peppas. A formulação F2.OMC foi a que promoveu maior liberação (55%) de OMC dos carreadores e maior permeação (37%) e retenção cutânea (0,17%). A formulação F1.OMC demonstrou menor liberação (30%) e retenção cutânea (0,05%) apresentando maior eficiência de encapsulação (60%), enquanto a formulação F3.OMC foi responsável pela menor permeação (18%). Os ensaios de citotoxicidade in vitro, empregando células HaCaT saudáveis, evidenciaram que as formulações não se apresentaram tóxicas na faixa de IC50 entre 0,08 e 0,004%. Os resultados sugerem que a formulação F3.OMC apresenta potencial aplicação para incorporação de OMC, objetivando sua aplicação em formulações fotoprotetoras. / The octyl methoxycinnamate has been used in sunscreens aiming at the prevention of skin cancer and premature aging. However, studies have detected the presence of this UV filter in samples of blood, urine and milk after topical administration. To promote the retention of the OMC in the outer layers of the skin and protect it from photobleaching, their incorporation into nanostructured lipid carrier (NLC) can be interesting because this system allows greater skin retention of active and therefore less permeation through the skin, besides greater protection and encapsulation. The objective of this study was to evaluate the potential of NLC as a strategy for incorporating the OMC. The NLCs was composed of: myristate miristila as solid lipid, acid triglyceride capric and caprylic as liquid lipid and tween 80 as surfactant (F1), associated or not with soy phosphatidylcholine (F2) or castor oil (F3). OMC was added to the lipid phase in a concentration of 1.0% to yield the F1.OMC, F2.OMC and F3.OMC formulations. The characterization of the systems was conducted from analysis of average diameter, polydispersity, zeta potential, differential scanning calorimetry (DSC), atomic force microscopy and scanning electron microscopy. The encapsulation efficiency of the formulations was carried out, as in vitro assays like sun protection fator (SPF), release, skin permeation, skin retention and cytotoxicity. Also, an analytical method was developed to quantify the OMC using liquid chromatography ultra-efficiency with mobile phase of 80:20 acetonitrile and acidic water. The formulations showed hydrodynamic mean diameter values between 90 and 250 nm, polydispersity of 0.09 to 0.26 and zeta potential of about - 20 mV. The analysis of atomic force microscopy and scanning electron microscopy suggested that the formulations have spherical shape. The DSC results showed that the systems suffering crystalline structure changes with the incorporation of OMC, besides the increase in melting point. The SPF results indicate values about 40 for all formulations. In vitro release tests showed that the OMC was released from formulations following the mathematical model proposed by Peppas. The formulation F2.OMC was that promoted the greatest release of OMC (55%) higher skin permeation (37%) and retention (0.17%). The F1.OMC showed lower release (30%), skin retention (0.05%) and higher encapsulation efficiency (60%), while the F3.OMC formulation was responsible for the lower skin permeation (18%). In vitro cytotoxicity assays employing healthy HaCaT cells, demonstrated that the formulations did not show toxic IC50 in the range between 0.08 and 0.004%. The results suggest that F3.OMC formulation has potential application for incorporation of OMC, aiming their use in sunscreens formulations. / FAPESP: 2014/22426-2

A radiação UV pode causar danos à pele humana, e, evitar estes danos, é uma preocupação crescente para a população e um desafio à comunidade científica. Para uma ação efetiva de fotoproteção, a associação de filtros, como avobenzona (BMBM) e ρ-metoxicinamato de octila (EHMC), são empregados. Devido à semelhança estrutural com os filtros solares químicos, a rutina (RUT), tal como outros flavonoides, apresenta atividade fotoprotetora. Apesar da disponibilidade de diferentes classes de filtros solares, o desenvolvimento de fotoprotetores contendo filtros químicos é um desafio, devido à instabilidade inerente a certos filtros orgânicos. As ciclodextrinas (CDs) são oligossacarídeos cíclicos, de formato tronco-cônico, cuja estrutura externa é hidrófilica e sua cavidade interna central hidrofóbica, com a capacidade de acomodar substâncias lipofílicas, formando complexos de inclusão. A formação dos complexos de inclusão pode levar à alterações de propriedades físico-químicas da molécula hóspede, tais como, solubilidade, fotoestabilidade e biodisponibilidade. O objetivo deste trabalho foi desenvolver, caracterizar e avaliar a formação de complexos de inclusão entre RUT, BMBM e EHMC e as CDs (HPβCD e SBEβCD). Os complexos de inclusão (RUT:HPβCD, RUT:SBEβCD, BMBM:HPβCD, BMBM:SBEβCD, EHMC:HPβCD e EHMC:SBEβCD) foram obtidos pelo método de liofilização e quantificados por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE). Os sistemas binários foram caracterizados em solução, pelo método de equilíbrio de solubilidade, e, no estado sólido, empregando calorimetria exploratória diferencial (DSC), termogravimetria (TG/DTG) e difração de raios-X de pó (PDRX). As substâncias isoladas e os complexos binários foram avaliados quanto à fotoestabilidade em estado sólido, e, em solução. Incremento na solubilidade (X mcg mL-1) foi observado para os complexo RUT:HPβCD (4,13x); RUT:SBEβCD (4,38x); BMBM:HPβCD (43,3x); BMBM:SBEβCD (53,3x); EHMC:HPβCD (12,7x); e EHMC:SBEβCD (70,0x). Os ensaios de DSC, TG/DTG, e P-DRX indicaram a formação de complexos de inclusão para os todos os sistemas, onde a supressão dos eventos endotérmicos característicos das substâncias isoladas foram observados; porém, nos complexos de BMBM, a presença de avobenzona livre no meio foi detectada, sugerindo, que a complexação não foi completa. A formação dos complexos de inclusão promoveu o aumento da fotoestabilidade em todos os sistemas avaliados, tanto no estado sólido, como em solução. Os resultados reportados neste estudo, indicaram que a complexação de substâncias fotoprotetoras com HPβCD e SBEβCD, pode representar, uma estratégia promissora quanto ao aumento da solubilidade e da fotoestabilidade. / UV radiation may cause demage on human skin, and preventing it, is an increasing worry for the population and a challenge to the scientific community. For an effective action of photoprotection, the association of filters, like avobention (BMBM) and octyl ρ-methoxycinnamate (EHMC), are used. Due to the structural similarity with the chemical solar filters, the rutin (RUT), like other flavonoids, shows photoprotective activity. Despite the availability of different classes of sunscreens, the development of photoprotectors containing chemical filters is a challenge, due to the inherent instability of certain organic filters. The cyclodextrins (CD) are cyclic oligosaccharides of truncated conical structure, which external structure is hydrophilic and its internal central hydrophobic cavity, with capacity to accommodate lipophilic substances, forming inclusion complexes. The formation of the inclusion complexes can lead to changes in physicalchemical properties of the host molecule, such as, solubility, photostability and bioavailability. The objective of this work was to develop, characterize and evaluate the formation of the inclusion complexes between RUT, BMBM and EHMC and the CDs (HPβCD and SBEβCD). The inclusion complexes (RUT:HPβCD, RUT:SBEβCD, BMBM:HPβCD, BMBM:SBEβCD, EHMC:HPβCD and EHMC:SBEβCD) were obtained by the lyophilization method and quantified by high performance liquid chromatography (HPLC). The binary systems were characterized in solution, by solubility equilibrium method and in solid state, using differential scanning calorimetry (DSC), thermogravimetry (TG/DTG) and powder X-ray diffraction (P-XRD). The isolated substances and binary complexes were evaluated the photostability in solid state, and in solution. The increase in solubility (X mcg mL-1) was observed for the complexes RUT:HPβCD (4.13x); RUT:SBEβCD (4.38x); BMBM:HPβCD (43.3x); BMBM:SBEβCD (53.3x); EHMC:HPβCD (12.7x); and EHMC:SBEβCD (70.0x). The analysis of DSC, TG/DTG, and P-DRX indicated the formation of inclusion complexes for all systems, where the suppression of the endothermic events characteristic of the isolated substances were observed; however, in the BMBM complexes, the presence of free avobenzone was detected, suggesting that the complexation was not complete. The formation of inclusion complexes promoted the increase of photostability in all evaluated systems, as in solid state as in solution. The results reported in this study indicated that the complexation of photoprotective substances with (HPβCD e SBEβCD). may represent a promising strategy for increasing solubility and photostability.

A radiação UV pode causar danos à pele humana, e, evitar estes danos, é uma preocupação crescente para a população e um desafio à comunidade científica. Para uma ação efetiva de fotoproteção, a associação de filtros, como avobenzona (BMBM) e ρ-metoxicinamato de octila (EHMC), são empregados. Devido à semelhança estrutural com os filtros solares químicos, a rutina (RUT), tal como outros flavonoides, apresenta atividade fotoprotetora. Apesar da disponibilidade de diferentes classes de filtros solares, o desenvolvimento de fotoprotetores contendo filtros químicos é um desafio, devido à instabilidade inerente a certos filtros orgânicos. As ciclodextrinas (CDs) são oligossacarídeos cíclicos, de formato tronco-cônico, cuja estrutura externa é hidrófilica e sua cavidade interna central hidrofóbica, com a capacidade de acomodar substâncias lipofílicas, formando complexos de inclusão. A formação dos complexos de inclusão pode levar à alterações de propriedades físico-químicas da molécula hóspede, tais como, solubilidade, fotoestabilidade e biodisponibilidade. O objetivo deste trabalho foi desenvolver, caracterizar e avaliar a formação de complexos de inclusão entre RUT, BMBM e EHMC e as CDs (HPβCD e SBEβCD). Os complexos de inclusão (RUT:HPβCD, RUT:SBEβCD, BMBM:HPβCD, BMBM:SBEβCD, EHMC:HPβCD e EHMC:SBEβCD) foram obtidos pelo método de liofilização e quantificados por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE). Os sistemas binários foram caracterizados em solução, pelo método de equilíbrio de solubilidade, e, no estado sólido, empregando calorimetria exploratória diferencial (DSC), termogravimetria (TG/DTG) e difração de raios-X de pó (PDRX). As substâncias isoladas e os complexos binários foram avaliados quanto à fotoestabilidade em estado sólido, e, em solução. Incremento na solubilidade (X mcg mL-1) foi observado para os complexo RUT:HPβCD (4,13x); RUT:SBEβCD (4,38x); BMBM:HPβCD (43,3x); BMBM:SBEβCD (53,3x); EHMC:HPβCD (12,7x); e EHMC:SBEβCD (70,0x). Os ensaios de DSC, TG/DTG, e P-DRX indicaram a formação de complexos de inclusão para os todos os sistemas, onde a supressão dos eventos endotérmicos característicos das substâncias isoladas foram observados; porém, nos complexos de BMBM, a presença de avobenzona livre no meio foi detectada, sugerindo, que a complexação não foi completa. A formação dos complexos de inclusão promoveu o aumento da fotoestabilidade em todos os sistemas avaliados, tanto no estado sólido, como em solução. Os resultados reportados neste estudo, indicaram que a complexação de substâncias fotoprotetoras com HPβCD e SBEβCD, pode representar, uma estratégia promissora quanto ao aumento da solubilidade e da fotoestabilidade. / UV radiation may cause demage on human skin, and preventing it, is an increasing worry for the population and a challenge to the scientific community. For an effective action of photoprotection, the association of filters, like avobention (BMBM) and octyl ρ-methoxycinnamate (EHMC), are used. Due to the structural similarity with the chemical solar filters, the rutin (RUT), like other flavonoids, shows photoprotective activity. Despite the availability of different classes of sunscreens, the development of photoprotectors containing chemical filters is a challenge, due to the inherent instability of certain organic filters. The cyclodextrins (CD) are cyclic oligosaccharides of truncated conical structure, which external structure is hydrophilic and its internal central hydrophobic cavity, with capacity to accommodate lipophilic substances, forming inclusion complexes. The formation of the inclusion complexes can lead to changes in physicalchemical properties of the host molecule, such as, solubility, photostability and bioavailability. The objective of this work was to develop, characterize and evaluate the formation of the inclusion complexes between RUT, BMBM and EHMC and the CDs (HPβCD and SBEβCD). The inclusion complexes (RUT:HPβCD, RUT:SBEβCD, BMBM:HPβCD, BMBM:SBEβCD, EHMC:HPβCD and EHMC:SBEβCD) were obtained by the lyophilization method and quantified by high performance liquid chromatography (HPLC). The binary systems were characterized in solution, by solubility equilibrium method and in solid state, using differential scanning calorimetry (DSC), thermogravimetry (TG/DTG) and powder X-ray diffraction (P-XRD). The isolated substances and binary complexes were evaluated the photostability in solid state, and in solution. The increase in solubility (X mcg mL-1) was observed for the complexes RUT:HPβCD (4.13x); RUT:SBEβCD (4.38x); BMBM:HPβCD (43.3x); BMBM:SBEβCD (53.3x); EHMC:HPβCD (12.7x); and EHMC:SBEβCD (70.0x). The analysis of DSC, TG/DTG, and P-DRX indicated the formation of inclusion complexes for all systems, where the suppression of the endothermic events characteristic of the isolated substances were observed; however, in the BMBM complexes, the presence of free avobenzone was detected, suggesting that the complexation was not complete. The formation of inclusion complexes promoted the increase of photostability in all evaluated systems, as in solid state as in solution. The results reported in this study indicated that the complexation of photoprotective substances with (HPβCD e SBEβCD). may represent a promising strategy for increasing solubility and photostability.

Les gènes de l'isocitrate déshydrogénase (IDH) sont mutés dans 70 à 80 % des gliomes de bas grade. Les enzymes mutantes IDH qui en résultent présentent une activité de gain de fonction, produisant du R-2-hydroxyglutarate (R-2-HG), appelé oncométabolite en raison de son accumulation anormale dans les tumeurs et de ses activités oncogéniques potentielles. Parmi les caractéristiques du cancer telles que la reprogrammation métabolique et épigénétique, le stress réplicatif et la stabilité du génome ont été peu caractérisés dans les cancers IDH-mutants. Par conséquent, cette étude vise à étudier l'impact de l'accumulation de R-2-HG sur la réplication de l'ADN et sa contribution au stress réplicatif dans les cancers IDH-mutants. Nous avons étudié la dynamique de la fourche de réplication dans des astrocytes humains normaux et confirmé les résultats dans d'autres lignées cellulaires normales et cancéreuses. Nous avons constaté que le traitement exogène par l'octyl-R-2-HG entravait la progression de la fourche de réplication et retardait par conséquent l'achèvement de la phase S. L'évaluation des niveaux de phosphorylation des protéines RPA, CHK1 et H2AX a révélé que la réponse classique au stress réplicatif (RSR) n'était pas activée. Un état cellulaire dans lequel la réplication de l'ADN est altérée sans activation de la RSR a notamment été décrit dans la littérature comme résultant de l'activation de la réponse au stress intégré (ISR). Cependant, l'activation de la RSI dans les cancers mutants IDH n'est pas bien étudiée. En évaluant les marqueurs d'activation de la RSI, tels que la phosphorylation de l'eIF2α et les niveaux de protéines ATF4, nous avons montré que l'octyl-R-2-HG activait la RSI. De plus, le blocage de l'ISR a partiellement sauvé la fourche de réplication et la progression de la phase S. Nous avons répliqué cette étude oncométrique. Nous avons reproduit ce défaut de réplication de l'ADN lié à l'oncométabolite ainsi que l'effet de sauvetage partiel de l'ISRIB lors de l'induction de la surexpression du gène IDH mutant. Nos résultats indiquent que la production de R-2-HG associée à la mIDH peut inhiber la dynamique normale de réplication de l'ADN via la signalisation ISR. / The isocitrate dehydrogenase (IDH) genes are mutated in 70-80% of low-grade gliomas. The resulting IDH mutant enzymes exhibit gain-of-function activity, producing R-2-hydroxyglutarate (R-2-HG), which is referred to as an oncometabolite due to its abnormal accumulation in tumours and potential oncogenic activities. Among the hallmarks of cancer such as metabolic and epigenetic reprogramming, replicative stress and genome stability have been poorly characterized in IDH-mutant cancer. Therefore, this study aims to investigate the impact of R-2-HG accumulation on DNA replication and its contribution to replicative stress in IDH-mutant cancers. We investigated replication fork dynamics in normal human astrocytes and confirmed the results in other normal and cancer cell lines. We found that exogenous treatment with octyl-R-2-HG impaired replication fork progression and consequently delayed S-phase completion. Assessment of RPA, CHK1 and H2AX protein phosphorylation levels revealed that the classical Replicative Stress Response (RSR) was not activated. Among others, a cell state in which DNA replication was impaired without activation of the RSR has been described in the literature as a result of activation of the Integrated Stress Response (ISR). However, ISR activation in IDH-mutant cancers is not well studied. Hence, by assessing ISR activation markers such as eIF2α phosphorylation and ATF4 protein levels, we showed that octyl-R-2-HG activated ISR. Moreover, blocking ISR partially rescued the replication fork and S-phase progression. We replicated this oncometabolite-related DNA replication defect as well as ISRIB’s partial rescue effect upon induction of mutant IDH gene overexpression. Our results indicate that mIDH-associated R-2-HG production possibly inhibits normal DNA replication dynamics via ISR signalling.