Thesis (Ph. D.)--University of Washington, 2003. / Vita. Includes bibliographical references (leaves 87-99).

Rhipicephalus micropulus, conhecido como carrapato dos bovinos, é um dos parasitas mais importantes para a pecuária, pois causa enormes prejuízos ao produtor. Esses prejuízos se estendem desde a ação espoliativa que o carrapato exerce nos seus hospedeiros até a transmissão de uma diversidade de patógenos. Os carrapatos utilizam vários estímulos térmicos, sonoros, visuais, gustativos, táteis e olfativos na fase de busca pelo hospedeiro. Essas substâncias são conhecidas como semioquímicos e podem atuar em indivíduos de uma mesma espécie como os ferormônios ou entre indivíduos de espécies diferentes como os alomônios e cairomônios. Nos bovinos, já se sabe que uma de suas lipocalinas pode atrair insetos, porém não é sabido se essa atração ocorre para R. microplus. Já é sabido que o carrapato consegue distinguir odores liberados entre bovinos das raças Nelore e Holandês Preto e Branco (HPB), sendo mais atraído para bovinos da raça Holandês. A lipocalina por ser uma proteína globular e estar associada com o transporte de pequenas moléculas hidrofóbicas, tais como odorantes e esteroides, e pode favorecer a atração do R. microplus, uma vez que essa proteína bovina pode ligar a odorantes e desempenhar um papel fundamental na liberação de odores para o ambiente, que por sua vez pode atrair, ou não, o R. microplus. Existem diferentes níveis de infestação de carrapatos entre bovinos das raças Nelore e Holandês, bem como entre os sexos da mesma raça. Além disso, o período do ciclo de vida do bovino também pode influenciar na susceptibilidade a infestação, por exemplo, as vacas no período de lactação são consideradas mais susceptíveis ao parasito. Assim, o objetivo do presente estudo foi avaliar o papel da lipocalina bovina na resistência e suscetibilidade ao carrapato, através da quantificação dessa proteína em líquidos corporais dos bovinos, tais como soro, saliva, urina, suor, secreção nasal e biopsia de pele obtidos de bovinos que apresentam fenótipos contrastantes de infestações, a saber: hospedeiros macho (touros) e fêmea (vacas em lactação) das raças resistentes (Bos indicus) e suscetíveis (Bos taurus). Os resultados deste trabalho tem demonstrado que a lipocalina bovina está presente em todos os fluídos investigados, exceto a urina, como observado por Western blot. Com os resultados deste trabalho podemos concluir que a bcOBP apresenta 9 diferença significativa nos fluidos de saliva e secreção nasal de touros e vacas em lactação da raça HPB quando comparados com touros e vacas em lactação da raça Nelore. Em amostras de biópsia de pele também ocorreu uma maior marcação da bcOBP na raça susceptível (HPB), demonstrando que a bcOBP possivelmente esta auxiliando na susceptibilidade destes bovinos ao carrapato, através do transporte de um maior número de odorantes que estariam atraindo um maior número de carrapatos. Ao analisar os fluidos entre bovinos da mesma raça, porém de sexo diferente, observou-se uma maior quantidade de bcOBP em vacas no período de lactação HPB nos fluidos de saliva e secreção nasal, visto que as vacas estão no período de lactação e são mais susceptíveis a infestações. Consequentemente, a bcOBP poderia estar colaborando para a sua maior susceptibilidade quando comparadas com touros HPB, e o mesmo ocorreu para biopsia de pele. Porém no fluído soro o aumento foi significativo para touro HPB quando comparado às vacas em lactação da raça HPB. Acredita-se que esse fenômeno ocorra devido ao período de lactação nas fêmeas uma vez que a produção da lipocalina bovina esta intimamente relacionada com a produção do leite. Os resultados deste trabalho demonstram que possivelmente a bcOBP na raça HPB está carreando odorantes para o ambiente os quais estariam atraindo mais carrapatos, e auxiliando na susceptibilidade destes bovinos. / Rhipicephalus micropulus, known as bovine tick, is one of the most important parasites for livestock, as they cause enormous damage to the producer. These demages extend from the spoliation action that the tick exerts on the skin of its hosts until the transmission of a diversity of pathogens. Ticks use various thermal, sound, visual, gustatory, tactile and olfactory stimuli in the search phase to the host. These substances are known as semiochemicals and can act within individuals of the same species as the pheromones or among individuals of different species such as alomones and cairomones. In the cattle, it is known that the lipocalin protein may attract insects, but this attraction is not known to influence the R. microplus. It is known that the tick can distinguish released odors between Nelore and Holstein cattle, being more attracted to cattle of the Holstein breed. Lipocalin, being a globular protein and associated with the transport of small hydrophobic molecules, such as odorants and steroids, can favor the attraction of R. microplus, since this bovine protein can bind to odorants and play a key role in the release of odors into the environment, which in turn may or may not attract R. microplus. There are different levels of tick infestation among cattle of the Nelore and Holstein breeds, as well as between the sexes of the same breed. In addition, the life cycle period of the bovine can also influence the susceptibility to infestation. For example, cows in the lactation period are considered more susceptible to the parasite. Thus, the objective of the present study was to evaluate the role of bovine lipocalin in the resistance and susceptibility to tick by quantifying that protein in bovine body fluids such as serum, saliva and urine, sweat, nasal secretions and skin biopsies obtained from resistant (Bos indicus) and susceptible (Bos taurus) cattle breeds. The results of this work have demonstrated that bovine lipocalin is present in all investigated fluids except urine, as observed by Western Blot. With the results of this work we can conclude that bcOBP presents a significant difference in fluids saliva and nasal secretion of bulls and cows in lactation breed HPB when compared to bulls and lactating cows of the Nelore breed. In skin biopsy specimens, there was also a greater labeling of bcOBP in the susceptible strain (HPB), which could then aid in the susceptibility of these cattle to the 11 tick, by transporting a larger number of odorants that would be attracting a greater number of ticks. When analyzing the fluids between bovines of the same breed, but of different sex, a greater amount of bcOBP was observed in cows during the period of HPB lactation in the fluids saliva and nasal secretion, since the cows are in the lactation period and are more susceptible to infestations. Consequently, bcOBP could be contributing to its greater susceptibility when compared to HPB bulls, and the same was done for skin biopsy. However, in the fluid serum, the increase was significant for the bull when compared to the lactating cows of the HPB race. It is believed that this phenomenon occurs due to the lactation period in females since the production of bovine lipocalin is closely related to milk production. The results of this work demonstrate that possibly Lipocalin in Holstein cattle is carrying odorants to the environment which would be attracting more ticks, and enhancing in the susceptibility of these cattle.

Orientador: Fabio Papes / Texto em português e inglês / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-25T08:04:04Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Nakahara_ThiagoSeike_M.pdf: 27685441 bytes, checksum: c755af1be54c3ba9b204bed05559dd88 (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: O Sistema Olfativo é um Sistema Sensorial complexo, composto por diversos subsistemas cuja integração no cérebro resulta na interação entre os animais e seus respectivos ambientes de maneira adequada. Essa adequação pode significar respostas comportamentais e fisiológicas distintas para situações diversas a que esses animais tenham sido expostos. Esse Sistema exibe compartimentos especializados na detecção de estímulos de uma mesma natureza e nesse contexto, o Sistema Olfativo Principal é responsável pela detecção de odorantes voláteis em geral e o Sistema Olfativo Acessório é responsável pela detecção de feromônios. Apesar dessa divisão formal, estudos recentes questionam essa divisão e propõem sobreposição entre a função desses subsistemas. Nesse estudo investigamos a expressão de receptores OR sendo expressos no Órgão Vomerosasal em níveis comparáveis aos receptores V2R ("endógenos"). Desses receptores, isolamos o receptor Olfr692 que possui o nível de expressão mais alto entre os OR estudados ou relatados anteriormente na literatura. As células que expressam o receptor Olfr692 foram caracterizadas molecularmente e foram feitos estudos preliminares a fim de investigar a função do receptor Olfr692 frente a possíveis funções biológicas que fossem capazes de explicar a expressão robusta de um receptor de classe OR no Órgão Vomeronasal / Abstract: The Olfactory System is a complex Sensorial System, comprised of some subsystems whose integration in the brain results in the appropriated interaction between animals and their environment, that is, proper behavioral or physiological answers to diverse situations to which these animals are exposed. This System exhibits specialized features for detection of a given kind of stimuli. The Main Olfactory System detects volatile odorants in general while the Accessory Olfactory System detects pheromones. Apart from this formal distinction, recent studies have questioned this division and propose some overlap between them. In the present study, we have investigated the expression of OR receptors in the Vomeronasal Organ whose expression level is compared to V2R Receptors (endogenous). We have isolated from these genes the Olfr692, which has the higher levels among the VNO-OR here studied and those discussed in the literature. These cells have been molecularly characterized and preliminary functional studies were also performed, searching for the possible biological functions of this Receptor, which could explain its expression in the Vomeronasal Organ / Mestrado / Genetica Animal e Evolução / Mestre em Genética e Biologia Molecular

The mammalian odorant receptor (OR) repertoire is an attractive model to study evolution, because ORs have been subjected to rapid evolution between species, presumably caused by changes of the olfactory system to adapt to the environment. However, functional assessment of ORs in related species remains largely untested. Here we investigated the functional properties of primate and rodent ORs to determine how well evolutionary distance predicts functional characteristics. Using human and mouse ORs with previously identified ligands, we cloned 18 OR orthologs from chimpanzee and rhesus macaque and 17 mouse-rat orthologous pairs that are broadly representative of the OR repertoire. We functionally characterized the in vitro responses of ORs to a wide panel of odors and found similar ligand selectivity but dramatic differences in response magnitude. 87% of human-primate orthologs and 94% of mouse-rat orthologs showed differences in receptor potency (EC50) and/or efficacy (dynamic range) to an individual ligand. Notably dN/dS ratio, an indication of selective pressure during evolution, does not predict functional similarities between orthologs. Additionally, we found that orthologs responded to a common ligand 82% of the time, while human OR paralogs of the same subfamily responded to the common ligand only 33% of the time. Our results suggest that, while OR orthologs tend to show conserved ligand selectivity, their potency and/or efficacy dynamically change during evolution, even in closely related species. These functional changes in orthologs provide a platform for examining how the evolution of ORs can meet species-specific demands. / Dissertation

Odorantes são detectados por centenas de receptores olfatórios (ORs) que pertencem à superfamília dos receptores acoplados à proteína G. Estes receptores são expressos nos neurônios sensoriais olfatórios localizados na cavidade nasal. Cada neurônio sensorial olfatório expressa um único alelo de gene OR de uma grande família de genes OR. Este padrão característico da expressão de genes OR resulta na formação de um mapa olfatório espacial no bulbo olfatório, que é necessário para a discriminação de odorantes pelo sistema olfatório. Os mecanismos envolvidos nesta regulação ainda não são bem conhecidos. O DNA genômico em neurônios olfatórios é coberto com marcas repressivas de metilação de histonas, indicando que a regulação da estrutura da cromatina deve desempenhar um papel importante na regulação da expressão de genes OR. Trabalhos anteriores demonstraram que RNAs não codificadores (ncRNAs) estão envolvidos na deposição de marcas de histonas em determinados genes. No entanto, os ncRNAs expressos no epitélio olfatório ainda não são conhecidos. Neste trabalho, identificamos e catalogamos o repertório completo de ncRNAs anotados, incluindo os miRNAs, expressos no epitélio olfatório de camundongos recémnascidos e adultos. Muitos destes, apesar de já anotados como ncRNAs, ainda não foram descritos na literatura como expressos no MOE. Identificamos ao todo 1161 miRNAs e 295 lincRNAs expressos no epitélio olfatório, e pudemos verificar como os níveis de expressão destes RNAs variam durante o desenvolvimento. A partir deste repertório, selecionamos lincRNAs que são preferencialmente expressos no epitélio olfatório quando comparados a outros tecidos de camundongo. Dez destes lincRNAs foram selecionados para validação utilizando-se RT-PCR. Cinco lincRNAs foram validados e analisados quanto à sua expressão em diferentes tecidos. Nosso trabalho estabelece uma plataforma de dados que permitirá o estudo do papel desempenhado por ncRNAs no epitélio olfatório. Além disto, os nossos resultados mostram que a abordagem utilizada permite a identificação de novos lincRNAs que apresentam expressão restrita ou preferencial no epitélio olfatório, e que, portanto, devem apresentar uma função relevante para o olfato. / Odorants are detected by hundreds of odorant receptors (ORs) which belong to the superfamily of G protein-coupled receptors. These receptors are expressed in the olfactory sensory neurons of the nose. Each olfactory sensory neuron expresses one single OR gene allele from a large family of OR genes. This characteristic pattern of OR gene expression results in the formation of a spatial olfactory map in the olfactory bulb, which is required for odorant discrimination by the olfactory system. The mechanisms involved in this regulation are unknown. OR genomic DNA in olfactory neurons is covered with repressive histone methylation marks, indicating that the chromatin structure should play an important role in the regulation of OR gene expression. Previous studies suggest that noncoding RNAs (ncRNAs) are involved in the deposition of histone marks in certain genes. However, the ncRNAs expressed in the olfactory epithelium are completely unknown. In this work, we used RNA-seq to identify and catalogue the complete repertoire of ncRNAs, including miRNAs, expressed in the olfactory epithelium from newborn and adult mice. In this way, we were able to identify 1161 miRNAs and 295 lincRNAs and analyze how their levels of expression varies during development. Out of these repertoire, we selected lincRNAs that are preferentially expressed in the olfactory epithelium when compared to other mouse tissues. Ten out of these lincRNAs were selected for validation by using RTPCR, and five of them could be validated and further analyzed. Our work establishes a data platform which will enable the study of the role played by ncRNAs in the olfactory epithelium. In addition, our results show that our approach can be successfully used to identify ncRNAs that are restrictedly or preferentially expressed in the olfactory epithelium, and which therefore must be relevant for olfaction.

The remarkable olfactory power of insect species is thought to be generated by a combinatorial action of G-protein-coupled olfactory receptors (ORs) and olfactory carriers. Two such carrier gene families are found in insects: the odorant binding proteins (OBPs) and the chemosensory proteins (CSPs). In olfactory sensilla, OBPs and CSPs are believed to deliver hydrophobic air-borne molecules to ORs, but their expression in non-olfactory tissues suggests that they also may function as general carriers in other developmental and physiological processes. ¶ Bioinformatics and experimental approaches were used to characterise the OBP and CSP gene families in a highly social insect, the western honey bee (Apis mellifera). Comparison with other insects reveals that the honey bee has the smallest set of these genes, consisting of only 21 OBPs and 6 CSPs. These numbers stand in stark contrast to the 66 OBPs and 7 CSPs in the mosquito Anopheles gambiae and the 46 OBPs and 20 CSPs in the beetle Tribolium castaneum. The genes belonging to both families are often organised in clusters, and evolve by lineage specic expansions. Positive selection has been found to play a role in generating a greater sequence diversication in the OBP family in contrast to the CSP gene family that is more conserved, especially in the binding pocket. Expression proling under a wide range of conditions shows that, in the honey, bee only a minority of these genes are antenna-specic. The remaining genes are expressed either ubiquitously, or are tightly regulated in specialized tissues or during development. These findings support the view that OBPs and CSPs are not restricted to olfaction, and are likely to be involved in broader physiological functions. ¶ Finally, the detailed expression study and the functional characterization of a member of the CSP family, uth (unable-to-hatch), is reported. This gene is expressed in a maternal-zygotic fashion, and is restricted to the egg and embryo. Blocking the zygotic expression of uth with double-stranded RNA causes abnormalities in all body parts where this gene is highly expressed. The treated embryos are `unable-to-hatch' and cannot progress to the larval stages. Our ndings reveal a novel, essential role for this gene family and suggest that uth is an ectodermal gene involved in embryonic cuticle formation.

Les symbioses bactérie-légumineuse (nodulation) et champignon-plante (mycorhization) présentent un intérêt agrobiologique et écologique majeur ; elles permettent aux plantes de croître naturellement sur un sol aride et peu fertile. Il a été démontré très récemment que les signaux impliqués dans la mise en place de la symbiose endomycorhizienne à arbuscule (facteurs "Myc") sont très proches de ceux de la nodulation. Il s'agit de molécules appartenant à la famille des lipo-chitooligosaccharides. Afin de réaliser la synthèse de ces molécules, deux nouvelles méthodologies ont été développées. L'ouverture oxydante d'acétals de 4,6-O-benzylidène de plusieurs glycopyranosides (en série gluco, galacto et manno) par le diméthyldioxirane (DMDO) a été étudiée. Le contrôle de la régiosélectivité a été effectué grâce au groupement protecteur introduit sur la fonction alcool de la position 3. La formation directe de β-glycosides de la N-acétyl-D-glucosamine par catalyse au triflate de fer (III) a été étudiée. La réaction a été menée sous irradiation micro-ondes ou en flux continu (système minifluidique Vapourtec®). Une nouvelle stratégie pour la synthèse du facteur [Myc-IV (C16:0, S)] a ensuite été établie. Nous avons utilisé un réactif peu toxique et non odorant pour introduire le motif thio nécessaire à la formation de deux liaisons glycosidiques. Le disaccharide précurseur de l'unité réductrice a été obtenu grâce à la première méthodologie développée au cours de cette thèse.

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Although most odorants we encounter in daily life are mixtures of several chemical substances, we still lack significant information on how we perceive and how the brain processes mixtures of odorants. We aimed to investigate the processing of odor mixtures using behavioral measures and functional magnetic resonance imaging (fMRI). The odor mixture contained a target odor (ambroxan) in a concentration at which it could be perceived by half of the subjects (sensitive group); the other half could not perceive the odor (insensitive group). In line with previous findings on multi-component odor mixtures, both groups of subjects were not able to distinguish a complex odor mixture containing or not containing the target odor. However, sensitive subjects had stronger activations than insensitive subjects in chemosensory processing areas such as the insula when exposed to the mixture containing the target odor. Furthermore, the sensitive group exhibited larger brain activations when presented with the odor mixture containing the target odor compared to the odor mixture without the target odor; this difference was smaller, though present for the insensitive group. In conclusion, we show that a target odor presented within a mixture of odors can influence brain activations although on a psychophysical level subjects are not able to distinguish the mixture with and without the target. On the practical side these results suggest that the addition of a certain compound to a mixture of odors may not be detected on a cognitive level; however, this additional odor may significantly change the cerebral processing of this mixture. In this context, FMRI offers unique possibilities to look at the subliminal effects of odors.

Submitted by Alison Vanceto (alison-vanceto@hotmail.com) on 2017-05-22T12:42:04Z No. of bitstreams: 1 DissDMRG.pdf: 6251788 bytes, checksum: 7ef11e629010aba06934d05d8113712d (MD5) / Approved for entry into archive by Ronildo Prado (ronisp@ufscar.br) on 2017-05-23T20:34:35Z (GMT) No. of bitstreams: 1 DissDMRG.pdf: 6251788 bytes, checksum: 7ef11e629010aba06934d05d8113712d (MD5) / Approved for entry into archive by Ronildo Prado (ronisp@ufscar.br) on 2017-05-23T20:34:41Z (GMT) No. of bitstreams: 1 DissDMRG.pdf: 6251788 bytes, checksum: 7ef11e629010aba06934d05d8113712d (MD5) / Made available in DSpace on 2017-05-25T19:41:50Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DissDMRG.pdf: 6251788 bytes, checksum: 7ef11e629010aba06934d05d8113712d (MD5) Previous issue date: 2016-05-02 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / This dissertation is divided into three chapters. In the first chapter, we provide a concise literature review that discusses key theoretical concepts, the rationale, and main objectives outlined for this study. The second chapter investigates the molecular evolution of the gene family of odor receptors (ORs) identified in the transcriptomes of two species of fruit flies of great economic importance: Anastrepha fraterculus and A. obliqua. The results showed a high percentage of average identities between ORs from these species, as well as recent gene expansions with signs of positive selection. A comparison of rates of synonymous and nonsynonymous substitutions among Anastrepha species detected evidence of positive selection in the gene Or7c, which is associated to an important potential role in aggregation behavior and host choice for oviposition in D. melanogaster. The third chapter investigates patterns of molecular evolution in pheromone binding proteins (PBPs), also identified in A. fraterculus and A. obliqua, as well as studied pattern of polymorphisms, divergence and populational structure of four chemosensory genes amplified in four species of tephritid flies of fraterculus group: A. fraterculus, A. obliqua, A. sororcula and A. turpiniae. This study contrasted previously identified genes with evidence of positive and purifying selection in order to investigate whether they are contributing to the differentiation among some of the species of this group. We found no evidence of positive selection in PBPs studied in a more global comparison, although we found positive selection signals in some of the genes and studied strains. Population analysis of chemosensory genes in different species of Anastrepha detected high levels of intraspecific nucleotide and haplotype diversity. Divergence tests showed that A. obliqua is the most different species of the ones here investigated, having, in general, high levels of nucleotide substitutions, non-synonymous divergence, as well as fixed species specific differences, whereas we failed to find similar differences amongst the other species here studied. The genes Obp28a, Or7c and Or7d were differentiated in A. obliqua, indicating a potential role in the differentiation of other species in the group, or in this species’ diversification and adaptation. / A presente dissertação encontra-se dividida em três capítulos. O primeiro capítulo apresenta uma concisa revisão bibliográfica que aborda os principais conceitos teóricos, a justificativa e os objetivos delineados para este estudo. O segundo capítulo apresenta um estudo da evolução molecular da família gênica dos receptores de odores (ORs) identificados nos transcriptomas de duas espécies de moscas-das-frutas de grande importância econômica: Anastrepha fraterculus e A.obliqua. Os resultados mostraram uma alta porcentagem de identidade média entre os ORs destas espécies, assim como expansões gênicas recentes com sinal de seleção positiva. Quando comparamos as taxas de substituições sinônimas e não-sinônimas entre as espécies de Anastrepha encontramos evidências de seleção positiva no gene Or7c, que está associado em D. melanogaster a um potencial importante papel nos comportamentos de agregação e escolha de frutos para oviposição. No terceiro capítulo apresentamos um estudo do padrão de evolução molecular dos genes que codificam para proteínas ligantes aos feromônios (PBPs), também identificados em A. fraterculus e A. obliqua, assim como também estudamos o padrão de polimorfismos, divergência e estrutura dos genes quimiossensoriais Obp28a, Obp84a, Or7c e Or7d os quais foram amplificados em quatro espécies de moscas-das-frutas do grupo fraterculus, A. fraterculus, A. obliqua, A. sororcula e A. turpiniae. Este estudo foi realizado contrastando genes identificados com sinais de seleção positiva e seleção purificadora com o intuito de investigar se eles estão contribuindo para a diferenciação entre algumas das espécies desse grupo. Não encontramos evidências de seleção positiva nas PBPs estudadas em uma comparação mais global, embora tenhamos encontrado sinais de seleção positiva em alguns dos genes e linhagens estudadas. A análise populacional de genes quimiossensoriais em diferentes espécies de Anastrepha detectou níveis altos de diversidade nucleotídica e haplotípica dentro das espécies. Os testes de divergência mostraram que a espécie A. obliqua é a espécie mais diferenciada, apresentando, em geral, altos níveis de substituições nucleotídicas, divergência não-sinônima, assim como diferenças fixadas quando comparada com as outras espécies. Os genes Obp28a, Or7c e Or7d mostraram-se diferenciados em A. obliqua, indicando um potencial papel na diferenciação desta espécie com respeito às outras espécies estudadas.