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Construcao e caracterizacao in vitro de um vetor retroviral bicistronico codificando endostatina e interleucina-2 para utilizacao em terapia genica / Construction and characterization in vitro of a bicistronic retroviral vector coding endostatin and interleukin-2 for use in gene therapyCALVO, FERNANDA B. 09 October 2014 (has links)
Made available in DSpace on 2014-10-09T12:27:15Z (GMT). No. of bitstreams: 0 / Made available in DSpace on 2014-10-09T13:57:04Z (GMT). No. of bitstreams: 0 / Dissertacao (Mestrado) / IPEN/D / Instituto de Pesquisas Energeticas e Nucleares - IPEN-CNEN/SP
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Construcao e caracterizacao in vitro de um vetor retroviral bicistronico codificando endostatina e interleucina-2 para utilizacao em terapia genica / Construction and characterization in vitro of a bicistronic retroviral vector coding endostatin and interleukin-2 for use in gene therapyCALVO, FERNANDA B. 09 October 2014 (has links)
Made available in DSpace on 2014-10-09T12:27:15Z (GMT). No. of bitstreams: 0 / Made available in DSpace on 2014-10-09T13:57:04Z (GMT). No. of bitstreams: 0 / A terapia gênica tem sido empregada em estudos pré-clínicos e clínicos, com o intuito de amenizar ou curar uma doença. Vetores retrovirais são uma ferramenta de transferência gênica largamente utilizada. Vetores bicistrônicos são uma alternativa interessante para o tratamento de doenças complexas. Na construção de um vetor bicistrônico pode-se empregar várias estratégias dentre elas a utilização da sequência IRES. A endostatina, fragmento do colágeno XVIII, tem sido muito utilizada na terapia anti-angiogênica devido sua ação inibitória no crescimento de células endoteliais. A imunoterapia tem sido utilizada como tratamento coadjuvante de tumores. Dentre as citocinas utilizadas, a interleucina-2 promovendo a proliferação de linfócitos T, tem sido utilizada em diversos estudos pré-clínicos e clínicos. O objetivo deste projeto foi construir e caracterizar in vitro um vetor retroviral bicistrônico codificando endostatina e interleucina-2 utlizando a sequência IRES. A construção do vetor foi realizada em três etapas, sendo comprovada a construção final por análise de restrição e seqüenciamento. Células de empacotamento foram transfectadas com o vetor, e posteriormente realizada a transdução na célula alvo. A endostatina e a interleucina-2 foram determinadas por Dot blot, seguido de análise da expressão por RT-PCR e ensaio de atividade. O vetor construído apresentou altos níveis de titulação viral, variando de 4.20x105 a 1.53x106UFC/mL. A determinação da endostatina e da interleucina-2 variaram entre 1.08 a 2.08g/106cels.24h e 0.66 a 0.89μg/106cels.24h, respectivamente. A expressão da endostatina no clone NIH3T3-pLend-IRES-IL2SN foi 2 vezes superior á apresentada pelo clone NIH3T3-pLend-IRES-IL2SN. A endostatina produzida promoveu uma inibição da proliferação de 40% das células endoteliais; e a interleucina-2 promoveu uma proliferação de 10.6% de linfócitos CD4 e 8.9% de CD8. Desta forma, a construção obtida neste trabalho representa uma excelente ferramenta para estudos da biologia celular do câncer e novas estratégias terapêuticas. / Dissertacao (Mestrado) / IPEN/D / Instituto de Pesquisas Energeticas e Nucleares - IPEN-CNEN/SP
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Interação de oncoproteínas virais E6 e E7 de HPV16/18 com alvos celulares potenciais para o desenvolvimento de estratégias terapêuticas. / Interaction of E6 and E7 viral oncoproteins of HPV16/18 with potential cellular targets to the development of therapeutic strategies.Erica Akemi Kavati 08 November 2012 (has links)
O potencial oncogênico do papilomavírus humano (HPV) baseia-se na capacidade das oncoproteínas virais E6 e E7 alterarem o ciclo celular, levando à imortalização e malignidade das células. O importante papel das oncoproteínas na progressão tumoral e na interação com inúmeros alvos celulares tem relevância em estudos para o desenvolvimento de vacinas e terapias contra os cânceres associados ao HPV. Este estudo investigou a localização intracelular das oncoproteínas E6 e E7 de HPV16/18 e seus possíveis alvos celulares. Demonstrou a presença de E6 nuclear, citoplasmática e intramitocondrial, tanto em células naturalmente transformadas por HPV, como em células transfectadas com o oncogene E6 viral. E7 foi detectada no núcleo e citoplasma, porém nunca ocorreu E7 intramitocondrial. Confirmou a hipótese da presença intramitocondrial da oncoproteína viral E6 de HPV16/18 de alto risco. Dado inédito cuja relevância está relacionada com a aplicação clínica, no desenvolvimento de imunobiológicos e fármacos capazes de neutralizar a ação deste importante alvo terapêutico. / The oncogenic potential of HPV is based on the capacity of viral oncoproteins E6 and E7 to change cellular cycle leading to immortality and malignancy. The important role of oncoproteins in tumor progression and its interaction with numerous cellular targets have relevance in studies to the development of vaccines and therapies against HPV associated cancers. This study investigated intracellular localization of E6 and E7 HPV16/18 oncoproteins and its possible cellular targets. It showed the presence of E6 in the cellular nucleus, cytoplasm, and intramitochondrial in naturally HPV transformed cell, as well as in cells transfected with E6 viral oncogene. E7 was detected inside nucleus and cytoplasm, but E7 intramitochondrial did not occur. This study confirmed the hypothesis of the intramitochondrial presence of E6 viral oncoprotein from high risk HPV. This is an original data whose relevance is directly related to clinical application in the development of immunobiologicals and drugs, which are able to neutralize the action of this important therapeutic target.
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Co-infection of cells with SV40 and polyoma virusAunins-Roll, Dace A. January 1979 (has links)
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Caracterização de partículas semelhantes ao vírus HPV16 produzidas em células HEK293T. / Characterization of HPV16 virus-like particles produced in HEK293T cellsMarigliani, Bianca 15 August 2013 (has links)
O HPV (Papilomavírus Humano) causa verrugas anogenitais e alguns tipos de câncer, como o câncer de colo do útero. Seu capsídeo é composto pelas proteínas L1 e L2. A L1 se autoestrutura em VLPs, utilizadas nas atuais vacinas comerciais. Para a geração de vacinas com maior espectro de proteção, a L2 é promissora, pois gera proteção cruzada. Para caracterizar VLPs de L1L2 do HPV16, células HEK293T cotransfectadas tiveram a expressão proteica analisada por citometria de fluxo, Western blotting, microscopia confocal a laser e eletrônica de transmissão. As proteínas L1 (60kDa) e L2 (100kDa) estavam presentes no núcleo e no citoplasma celular, formando VLPs de L1L2 de conformação heterogênea, cuja máxima expressão ocorre 12h após a transfecção. As VLPs extraídas estavam em diferentes estágios de estruturação. Foi possível estabelecer um sistema eficaz de produção heteróloga das proteínas de VLPs de L1L2, que poderão ser utilizadas em testes pré-clínicos, na pesquisa básica e contribuir no desenvolvimento de uma vacina profilática de amplo espectro de ação contra o HPV. / HPV (Human Papillomavirus) is the causative agent of anogenital warts and several types of cancer, as cervical cancer. The HPV capsid is composed of L1 and L2 proteins. L1 can self-assemble into VLPs (virus-like particles), the basis for HPV commercially available vaccines. To generate broad-spectrum vaccines L2 shows the greatest promise, due to cross-protection. To characterize VLPs composed of HPV16 L1 and L2 proteins, cotransfected HEK293T cells were analyzed by flow cytometry, confocal laser scanning microscopy, transmission electron microscopy and Western blotting. Proteins L1 (60kDa) and L2 (100kDa) were present in cell nucleus and cytoplasm, forming heterologous L1L2 VLPs with highest expression at 12h post-transfection. Extracted VLPs were at different maturation stages. It was possible to establish an efficient system of heterologous L1, L2 and L1L2 VLPs production. After some adjustments in protocols, these particles could be used in preclinical tests, HPV basic research and also in the development of an HPV broad-spectrum vaccine.
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Caracterização de partículas semelhantes ao vírus HPV16 produzidas em células HEK293T. / Characterization of HPV16 virus-like particles produced in HEK293T cellsBianca Marigliani 15 August 2013 (has links)
O HPV (Papilomavírus Humano) causa verrugas anogenitais e alguns tipos de câncer, como o câncer de colo do útero. Seu capsídeo é composto pelas proteínas L1 e L2. A L1 se autoestrutura em VLPs, utilizadas nas atuais vacinas comerciais. Para a geração de vacinas com maior espectro de proteção, a L2 é promissora, pois gera proteção cruzada. Para caracterizar VLPs de L1L2 do HPV16, células HEK293T cotransfectadas tiveram a expressão proteica analisada por citometria de fluxo, Western blotting, microscopia confocal a laser e eletrônica de transmissão. As proteínas L1 (60kDa) e L2 (100kDa) estavam presentes no núcleo e no citoplasma celular, formando VLPs de L1L2 de conformação heterogênea, cuja máxima expressão ocorre 12h após a transfecção. As VLPs extraídas estavam em diferentes estágios de estruturação. Foi possível estabelecer um sistema eficaz de produção heteróloga das proteínas de VLPs de L1L2, que poderão ser utilizadas em testes pré-clínicos, na pesquisa básica e contribuir no desenvolvimento de uma vacina profilática de amplo espectro de ação contra o HPV. / HPV (Human Papillomavirus) is the causative agent of anogenital warts and several types of cancer, as cervical cancer. The HPV capsid is composed of L1 and L2 proteins. L1 can self-assemble into VLPs (virus-like particles), the basis for HPV commercially available vaccines. To generate broad-spectrum vaccines L2 shows the greatest promise, due to cross-protection. To characterize VLPs composed of HPV16 L1 and L2 proteins, cotransfected HEK293T cells were analyzed by flow cytometry, confocal laser scanning microscopy, transmission electron microscopy and Western blotting. Proteins L1 (60kDa) and L2 (100kDa) were present in cell nucleus and cytoplasm, forming heterologous L1L2 VLPs with highest expression at 12h post-transfection. Extracted VLPs were at different maturation stages. It was possible to establish an efficient system of heterologous L1, L2 and L1L2 VLPs production. After some adjustments in protocols, these particles could be used in preclinical tests, HPV basic research and also in the development of an HPV broad-spectrum vaccine.
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Potencial oncogênico de variantes naturais de papilomavírus humano / Oncogenic potential of natural variants of human papillomavirusSichero, Laura 19 December 2003 (has links)
O principal fator etiológico da neoplasia do colo do útero é a infecção por HPVs (papilomavírus humano) de alto risco oncogênico, principalmente HPVs 16 e 18. A variabilidade intra-típica de ambos tipos virais tem sido extensivamente estudada. A análise da diversidade genética de isolados oriundos de diferentes regiões dos cinco continentes permitiu traçar a origem e filogenia destes vírus, e sugeriu-se que a evolução destes reflete a relação dos mesmos com seu hospedeiro. Considera-se uma variante molecular de um tipo de HPV um genoma que possui 98% ou mais de identidade nos genes Ll , E6 e E7 com um genoma já descrito. Entretanto, variantes moleculares apresentam aproximadamente 5% de diferença na seqüência da LCR (long contral region). Alguns grupos de pesquisa de diferentes partes do mundo relataram a associação epidemiológica entre variantes específicas de HPVs 16 e 18 e o risco aumentado de infecção persistente e de desenvolvimento de lesão do colo uterino de alto grau. No Brasil foi observada a associação positiva entre variantes não-européias de HPVs 16 e 18 e o risco de lesão do colo uterino em um estudo epidemiológico prospectivo que vem sendo conduzido em São Paulo. Neste estudo foi analisada a atividade transcricional dos promotores P97 e P105 de variantes moleculares de HPVs 16 e 18, respectivamente. A variante asiático-americana de HPV-18, B18-3, apresentou a maior atividade transcricional entre todos os isolados testados. Entre as variantes moleculares de HPV-18, o isolado europeu B18-2 foi o menos ativo transcricionalmente. Entre as amostras de HPV-16, a variante européia B-12 foi a que apresentou a maior atividade transcricional. Foi observado, também, que o promotor P105 de HPV-18 é mais ativo transcricionalmente que o promotor P97. Adicionalmente, foi analisada a capacidade de imortalização de queratinócitos humanos primários por E6/E7 de variantes moleculares de HPV-16. Essas variantes não diferiram muito quanto a eficiência de formação de colônias de queratinócitos crescidos em baixa densidade. Entretanto, a variante asiático-americana gerou um maior número de colônias potencialmente imortalizadas. Esses resultados têm implicações importantes na determinação do risco de desenvolvimento de lesões de colo uterino associadas ao HPV. / Infection by high-risk HPV (human papillomavirus) types, especially HPVs 16 and 18, is the major etiological factor of cervical neoplasia. Intratypic nucleotide variability of both HPV types has been extensively studied. Genetic diversity analyses of isolates from different regions of the five continents permitted to reconstruct the origin and phylogeny of this virus, and suggested that viral evolution reflects the relation between the virus and their host. A molecular variant of HPV possess 98% or more identity in L1, E6 and E7 genes with another viral genome. However, molecular variants have approximately 5% differences within the LCR (long control region). Some research groups from different parts of the world have described the epidemiologic association between specific variants of HPVs 16 and 18 and increased risk of persistent infection and development of squamous intraepithelial lesions. In Brazil, we observed a positive association between non-European variants of HPVs 16 and 18 and risk of cervical lesion in a prospective epidemiologic study that is being conducted in São Paulo. In this study we analyzed P97 and P105 transcriptional activity of molecular variants of HPVs 16 and 18, respectively. The Asian-American variant of HPV-18, B18-3, exhibited the highest transcriptional activity among all isolates tested. Among HPV-18 molecular variants, the B 18-2 European isolate was the less transcriptionally active. Among HPV-16 samples, the B-12 European variant exhibited the highest transcriptional activity. We also observed that the HPV-18 P105 promoter was more active than the HPV-16 P97 promoter. Furthermore, we analyzed the capacity of immortalization of primary human keratinocytes by E6/E7 molecular variants of HPV-16. These variants did not differ much in the efficiency of colony formation by low density keratinocyte plating. However, the Asian-American variant yielded a higher number of colonies potentially immortalized. These results have important implications in the determination of risk for development of HPV -associated cervical lesions.
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Autoregulatory feedback control of c-Rel by IkB[alpha] loss of IkB[alpha]-mediated control over nuclear import and DNA-binding enables oncogenic activation of c-Rel /Sachdev, Shrikesh January 1998 (has links)
Thesis (Ph. D.)--University of Missouri--Columbia, 1998. / Typescript. Vita. Includes bibliographical references (leaves : 325-355). Also available on the Internet.
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Potencial oncogênico de variantes naturais de papilomavírus humano / Oncogenic potential of natural variants of human papillomavirusLaura Sichero 19 December 2003 (has links)
O principal fator etiológico da neoplasia do colo do útero é a infecção por HPVs (papilomavírus humano) de alto risco oncogênico, principalmente HPVs 16 e 18. A variabilidade intra-típica de ambos tipos virais tem sido extensivamente estudada. A análise da diversidade genética de isolados oriundos de diferentes regiões dos cinco continentes permitiu traçar a origem e filogenia destes vírus, e sugeriu-se que a evolução destes reflete a relação dos mesmos com seu hospedeiro. Considera-se uma variante molecular de um tipo de HPV um genoma que possui 98% ou mais de identidade nos genes Ll , E6 e E7 com um genoma já descrito. Entretanto, variantes moleculares apresentam aproximadamente 5% de diferença na seqüência da LCR (long contral region). Alguns grupos de pesquisa de diferentes partes do mundo relataram a associação epidemiológica entre variantes específicas de HPVs 16 e 18 e o risco aumentado de infecção persistente e de desenvolvimento de lesão do colo uterino de alto grau. No Brasil foi observada a associação positiva entre variantes não-européias de HPVs 16 e 18 e o risco de lesão do colo uterino em um estudo epidemiológico prospectivo que vem sendo conduzido em São Paulo. Neste estudo foi analisada a atividade transcricional dos promotores P97 e P105 de variantes moleculares de HPVs 16 e 18, respectivamente. A variante asiático-americana de HPV-18, B18-3, apresentou a maior atividade transcricional entre todos os isolados testados. Entre as variantes moleculares de HPV-18, o isolado europeu B18-2 foi o menos ativo transcricionalmente. Entre as amostras de HPV-16, a variante européia B-12 foi a que apresentou a maior atividade transcricional. Foi observado, também, que o promotor P105 de HPV-18 é mais ativo transcricionalmente que o promotor P97. Adicionalmente, foi analisada a capacidade de imortalização de queratinócitos humanos primários por E6/E7 de variantes moleculares de HPV-16. Essas variantes não diferiram muito quanto a eficiência de formação de colônias de queratinócitos crescidos em baixa densidade. Entretanto, a variante asiático-americana gerou um maior número de colônias potencialmente imortalizadas. Esses resultados têm implicações importantes na determinação do risco de desenvolvimento de lesões de colo uterino associadas ao HPV. / Infection by high-risk HPV (human papillomavirus) types, especially HPVs 16 and 18, is the major etiological factor of cervical neoplasia. Intratypic nucleotide variability of both HPV types has been extensively studied. Genetic diversity analyses of isolates from different regions of the five continents permitted to reconstruct the origin and phylogeny of this virus, and suggested that viral evolution reflects the relation between the virus and their host. A molecular variant of HPV possess 98% or more identity in L1, E6 and E7 genes with another viral genome. However, molecular variants have approximately 5% differences within the LCR (long control region). Some research groups from different parts of the world have described the epidemiologic association between specific variants of HPVs 16 and 18 and increased risk of persistent infection and development of squamous intraepithelial lesions. In Brazil, we observed a positive association between non-European variants of HPVs 16 and 18 and risk of cervical lesion in a prospective epidemiologic study that is being conducted in São Paulo. In this study we analyzed P97 and P105 transcriptional activity of molecular variants of HPVs 16 and 18, respectively. The Asian-American variant of HPV-18, B18-3, exhibited the highest transcriptional activity among all isolates tested. Among HPV-18 molecular variants, the B 18-2 European isolate was the less transcriptionally active. Among HPV-16 samples, the B-12 European variant exhibited the highest transcriptional activity. We also observed that the HPV-18 P105 promoter was more active than the HPV-16 P97 promoter. Furthermore, we analyzed the capacity of immortalization of primary human keratinocytes by E6/E7 molecular variants of HPV-16. These variants did not differ much in the efficiency of colony formation by low density keratinocyte plating. However, the Asian-American variant yielded a higher number of colonies potentially immortalized. These results have important implications in the determination of risk for development of HPV -associated cervical lesions.
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"Prevalência da infecção pelo Papilomavírus Humano (HPV) em homens soropositivos para HIV e homens parceiros de mulheres com infecção pelo HPV" / Human papillomavirus (HPV) prevalence in seropositive men for HIV and men partners of women infected by HPVSilva, Roberto José Carvalho da 07 March 2006 (has links)
O Papilomavírus humano (HPV) é provavelmente o agente mais prevalente das doenças sexualmente transmissíveis do trato genital.Este estudo foi realizado para comparar as prevalências de HPV nos 144 raspados penianos de homens HIV positivos e negativos.Utilizou PCR PGMY09/11 e hidridização em pontos. A prevalência de HPV nos indivíduos HIV positivo foi de 59% e no HIV negativo de 67%.A lesão aceto-branca pela peniscopia não demonstrou significativa positividade para HPV.Pacientes HIV positivo mostraram múltiplos tipos de HPV e os tipos oncogênicos (16/18) foram os de maior freqüência. Os HPV tipo 6/11 foram os mais freqüentes nos dois grupos. Observou-se maior prevalência de HPV nos HIV positivos com linfócitos T CD4 menor que 200 células/mm3. A carga viral plasmática do HIV não foi um fator de positividade para HPV / Genital tract human papillomaviruses (HPV) are probably the most prevalent sexually transmitted pathogens. This study is to compare HPV DNA prevalence in 144 penile smears, obtained from HIV positive and negative men. It was used PCR employing the PGMY09/11 generic HPV primers and dot blot hybridization. HPV prevalence was 59% in HIV positive men and 67% in HIV negative. Acetic white lesions by peniscopy did not show significant positive of HPV in neither HIV positive and negative groups. HIV positive men had more often multiple and oncogenic HPV types (16/18). HPV types 6/11 were more frequent in both groups. The HIV positive group with lower 200 T CD4 cell counts load reported more HPV prevalence. HIV load was not a positive factor for HPV
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