Orientador: Gisele Zoccal Mingoti / Resumo: O receptor do fator de crescimento epidermal (EGFR) está relacionado com a retomada da meiose induzida por estímulo gonadotrófico. Nós utilizamos um inibidor do EGFR (AG1478) para inibir a retomada da meiose durante a pré-maturação (PMIV). No experimento I, foi avaliada a maturação oocitária, a expansão das células do cumulus, a funcionalidade das junções gap, a distribuição dos microfilamentos de actina e o conteúdo lipídico em oócitos e, a expressão gênica nas células do cumulus. No experimento II, foi avaliado o desenvolvimento embrionário, a taxa de eclosão, o número total de células, a taxa de apoptose, o conteúdo lipídico e expressão gênica nos embriões. No experimento I, os COC foram PMIV por 8h em meio com 1 μM de AG1478, inibidor do EGFR, (EGFR-_PreIVM), em seguida foram MIV por 22h (EGFR-_IVM); foram feitos 4 grupos controle: oócitos imaturos imediatamente após sua remoção do folículo (Control_Immat), oócitos MIV por 8h (Control_PreIVM), por 22h (Control_IVM_22h) e por 30h (Control_IVM_30h). No experimento II, os COC foram PMIV por 8h em meio com 1 μM do inibidor do EGFR, em seguida foram MIV por 22h (EGFR-); os COC do grupo controle foram MIV por 22h (Control). Em seguida, os oócitos foram FIV e cultivados por até 9 dias. No experimento I, o grupo EGFR-_PreIVM apresentou 53,1% dos oócitos em GV, com a maioria em GV1 (42,9%; P>0,05) ou em GV3 [28,6%, semelhante ao grupo Control_Immat (P>0,05) e menor que o grupo Control_PreIVM (P<0,05)]; após a MIV não foram encontr... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Epidermal growth factor receptor (EGFR) is related with meiosis resumption by gonadotropic stimulus. We used an EGFR inhibitor (AG1478) to block meiosis resumption during prematuration (PIVM). In experiment I, was evaluated oocyte maturation, cumulus cells expansion, gap junctions functionality, microfilaments distribution and lipid content in oocytes and, gene expression in cumulus cells. In experiment II, was assessed embryo development, hatching rates, total cell number, apoptosis, lipid content and gene expression in embryos. For experiment I, COC were PIVM for 8h in medium supplemented with 1μM of AG1478, an EGFR inhibitor, (EGFR-_PreIVM), followed by 22h IVM (EGFR-_IVM); four control groups were evaluated: immature oocytes immediately after follicle removal (Control_Immat), oocytes IVM for 8h (Control_PreIVM), oocytes IVM for 22h (Control_IVM_22h) and oocytes IVM for 30h (Control_IVM_30h). For experiment II, COC were PIVM for 8h in medium supplemented with 1μM of EGFR inhibitor, followed by 22h IVM (EGFR-); COC from control group were matured for 22h (Control). After that, oocytes were IVF and zygotes were cultured up to 9 days. In experiment I, EGFR-_PreIVM group had 53.1% of the oocytes blocked in GV, the majority in GV1 (42.9%; P>0.05) or in GV3 [28.6%, similar to Control_Immat (P>0.05) and lower than Control_PreIVM (P<0.05)]. After IVM, no differences (P>0.05) were found between groups in MII rates, but Control_IMV_30h (9.1%) had higher (P<0.05) rates of degenerated... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Orientador: José Buratini Junior / Resumo: A comunicação entre o oócito e células somáticas adjacentes é essencial para a diferenciação do complexo cumulus-oócito (COC). Essa comunicação é proporcionada por processos citoplasmáticos trans-zonais (TZP) que penetram através da zona pelúcida e atingem a membrana do oócito, onde junções do tipo gap permitem transporte bidirecional de sinais elétricos e moléculas reguladoras. A maturação oócitária in vivo é controlada por gonadotrofinas e peptídeos intra-ovarianos e desencadeada pelo pico de LH. Este, induz a expressão dos fatores EGF-like que desencadeiam uma série de fatores que levam a fosforilação das conexinas, e com isso o fechamento de junções gap e consequentemente perda dos efeitos inibitórios do monofosfato cíclico de adenosina (AMPc) e monofosfato cíclico de guanosina (GMPc), proporcionando assim a retomada da meiose. O objetivo deste trabalho é avaliar os efeitos da inclusão de uma fase de pré maturação seguida da maturação in vitro sobre a progressão da meiose, funcionalidade das junções gap e produção embrionária. A pré maturação foi empregada utilizando componentes de ordem fisiológica encontradas no ambiente folicular, e esta, foi capaz de retardar a quebra da vesícula germinativa (VGBD), enquanto favoreceu a comunicação entre oócito e células do cumulus, o que acreditamos ser beneficial para o desenvolvimento oocitário in vitro. No entanto, quando seguida da maturação in vitro também utilizando componentes fisiológicos, foi capaz de prod... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The maturation of the cumulus oocyte complex (COC) is triggered by the ovulatory LH surge in vivo, and precociously induced when the COC is removed from the follicle. Natriuretic peptide type C (NPPC) plays a central role in maintaining meiotic arrest in vivo and delays GVBD while increasing oocytecumulus communication during IVM in cattle. In this study we first tested the hypothesis that follicular steroids (estradiol, progesterone and androstenedione) combined with FSH at approximately physiological levels cooperate with NPPC to delay GVBD and to maintain oocyte-cumulus communication. Then, we assessed the effects of follicular steroids, NPPC and the combination of both in a pre-IVM culture followed by IVM induced with AREG on embryo production. Follicular steroids combined with NPPC was most effective in increasing the proportion of GV oocytes in Bos indicus, although follicular steroids did not significantly enhance the effect of NPPC in Bos Taurus. . Moreover, follicular steroids enhanced the ability of NPPC to increase the proportion of COCs with opened GAP junctions. The addition of follicular steroids and/or NPPC to a pre- IVM culture did not alter blastocyst production after IVF. In conclusion, the combination of follicular steroids with NPPC can alter GVBD dynamics and cell communication favorably to oocyte developmental competence, but when used in a pre-IVM culture followed by induction of COC maturation with AREG and IVF, it did not increase e... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Submitted by Mario BC (mario@bc.ufrpe.br) on 2018-09-28T14:25:40Z No. of bitstreams: 1 Camila Marinho de Miranda Oliveira Meireles.pdf: 464901 bytes, checksum: 9bb8e3230a97cbb0fbffb30a583b2748 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-09-28T14:25:40Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Camila Marinho de Miranda Oliveira Meireles.pdf: 464901 bytes, checksum: 9bb8e3230a97cbb0fbffb30a583b2748 (MD5) Previous issue date: 2018-08-03 / In the in vitro embryo production systems (PIVE), culture maturation (IVM) is one of the limiting steps, specially due to the action of EROs produced in the system. Myricetin is one of the natural flavonoids, known for its antioxidant potential, which may improve the PIVE, being supplemented in the medium of IVM. In order to test the effects of myricetin on bovine IVM, oocytes were matured for 24 h in the presence (1, 5 and 10 μM) or in the absence (control group) of myricetin. The oocytes were stained with Hoechst and visualized under a fluorescence microscope for nuclear evaluation. The percentage of nuclear maturation did not differ between the control group (64.5%), and treatments 1 μM (66.9%) and 5 μM (70.8%), but treatment with 10 μM (42.7%) was damaging for oocytes. Regarding the evaluation of the embryonic development, the oocytes were fertilized and cultured in vitro, being the embryonic development rates determined after 7 days of culture. In the embryo production phase, only myricetin 1 μM was used. Relative to embryonic development rates, there was not difference (P > 0.05) between control group (47.2%) and treatment 1 μM (33.3%). The embryos were stained by the TUNEL technique, in order to evaluate cell apoptosis signs, revealing that the myricetin 1 μM treatment resulted in a lower rate of apoptotic blastomers (27%) when compared to the control group (41.2%) (P < 0.05). It was concluded that the IVM supplementation with 10 μM myricetin interferes in oocyte maturation rate, however, 1 μM myricetin does not interfere in the rate of blastocyst production and decreases the number of apoptotic blastomers. / Nos sistemas in vitro de produção de embriões (PIVE), a maturação oocitária (MIV) é um dos passos limitantes, inclusive devido à agressão de EROs produzidas no sistema. A miricetina é um dos flavonoides naturais, conhecida por seu potencial antioxidante, que pode proporcionar avanços na PIVE, sendo suplementada no meio de MIV. Com o objetivo de testar os efeitos da miricetina sobre a MIV de bovinos, oócitos foram maturados por 24 h na presença (1, 5 e 10 μM) ou na ausência (grupo controle) de miricetina. Os oócitos foram corados com Hoechst e visualizados em microscópio de fluorescência para avaliação nuclear. A percentagem de maturação nuclear não diferiu entre os grupos controle (64,5%), e tratamentos 1 μM (66,9%) e 5 μM (70.8%), porém o tratamento com 10 μM (42,7%) mostrou-se desfavorável para os oócitos. Quanto à avaliação do desenvolvimento embrionário, os oócitos foram fertilizados e cultivados in vitro, sendo as taxas de desenvolvimento embrionário determinadas no sétimo dia de cultivo. Na fase de produção de embriões foi-se testado apenas o tratamento controle e o 1 μM de miricetina, onde não houve variação significativa (P < 0,05) nas as taxas de desenvolvimento embrionário, entre o grupo controle (47,2%) e o tratamento 1 μM (33,3%). Os embriões produzidos foram corados pela técnica do TUNEL, a fim de avaliar sinais de apoptose celular, revelando que, o grupo tratamento 1 μM apresenta menor taxa de blastômeros apoptóticos (27%), quando comparados ao grupo controle (41,2%) (P < 0,05). Conclui-se que a suplementação da maturação in vitro com antioxidante miricetina em dose de 10 μM de miricetina interfere na taxa de maturação oocitária, já quanto a produção embrionária, o uso de 1 μM de miricetina não interfere a taxa de produção de blastocistos e diminui o número de blastômeros apoptóticos.

A maturação in vitro do oócito é um dos fatores limitantes na produção in vitro de embriões. In vivo, esta maturação é um processo altamente orquestrado no qual a meiose é retomada pela onda de gonadotrofina que antecede a ovulação e que induz à queda dos níveis de AMPc no oócito. No entanto, os oócitos aspirados ao serem retirados dos folículos ovarianos retomam espontaneamente a maturação comprometendo a competência de seu desenvolvimento. O AMPc é sintetizado pela adenilato ciclase (AC) e degradado pelas fosfodiesterases (PDE), existindo algumas relacionadas à degradação do AMPc e outras do GMPc. Sendo assim, a proposição deste trabalho foi averiguar a contribuição de diferentes isoformas de fosfodiesterases na retomada da meiose e nos níveis de GMPc, AMPc e ainda, determinar quando há manutenção de AMPc em níveis elevados observando sua influência na competência oocitária e ativação da MAPK. Para isso, os complexos cumulus-oócito (CCOs) foram maturados in vitro na ausência, presença ou associação de inibidores de PDEs-AMPc e GMPc específicas e FSHr. As amostras foram avaliadas em relação a: 1) taxa de maturação; 2) níveis intracelulares de AMPc e GMPc nos CCOs; 3) taxa de desenvolvimento de blastocistos ; 4) ativação da MAPK em oócitos e células do cumulus. Os resultados obtidos no primeiro experimento indiaram que o inibidor da PDE3 foi o mais eficaz (p&lt;0,05) em atrasar a retomada da meiose, às nove horas de maturação, porém, isolado ou em associação com o inibidor da PDE8, não foi capaz de alterar (p&gt;0,05) os níveis de AMPc. No experimento dois, o inibidor da PDE5 isolado não influenciou a retomada da meiose (p&gt;0,05), porém, quando associado aos inibidores da PDE3 e 8 houve atraso na retomada (p&lt;0,05) e ainda alteraram os níveis de GMPc e AMPc (p&lt;0,05) nas primeiras horas de maturação. O experimento três mostrou a influencia do FSHr durante a MIV, o qual estimulou a retomada da meiose, mas em associação com inibidores da PDE5 e 8 atrasa a retomada (p&lt;0,05). Além disso, o FSHr provoca aumento do nível de AMPc e sua associação com inibidores de PDE5 e PDE8 ocasionou elevação adicional (p&lt;0,05). As condições de cultivo estudadas no experimento quatro mostraram que a maturação induzida (pré-MIV de duas horas com agentes para elevar AMPc seguindo de 22 horas de MIV com FSH associado a inibidores de PDEs) atrasaram a retomada da meiose às nove horas de maturação, mas não afetaram progressão da meiose às 24, 28 e 30 horas. Os tratamentos, porém, não melhoraram a competência oocitária após a fertilização in vitro e ocasionaram pequenas variações na ativação da MAPK em oócitos e células do cumulus. / In vitro maturation of oocytes is a limiting factor in the in vitro production of bovine embryos. In vivo, this maturation is a highly orchestrated process in which meiosis resumption by the gonadotropin surge that precedes ovulation induces the decrease in cAMP levels in the oocyte. However, when oocytes are removed from follicles, they spontaneously resume maturation compromising the competence for its development. cAMP is synthesized by adenylyl cyclase (AC) and degraded by phosphodiesterases (PDE), and there are some PDEs related to degradation of cAMP and/or cGMP. Thus, the purpose of this work was to investigate the contribution of different isoforms of phosphodiesterases in the resumption of meiosis and levels of cAMP and, also, to determine differences in signaling pathways when maintaining high levels of cAMP and its influence on oocyte competence. For this purpose, cumulus-oocyte complexes (COC) were matured in vitro in the presence, absence or combination of inhibitors of cAMP- and cGMP-specific PDEs and FSH. Samples be were evaluated in relation to: 1) maturation rate, 2) intracellular levels of cAMP and cGMP in COCs, 3) rate of blastocyst development and 4) activation of MAPK in oocytes and cumulus cells. The results of the first experiment showed that the PDE3 inhibitor is more effective (p &lt;0.05) in delaying meiosis resumption, at nine hours of maturation, but was not capable of altering cAMP levels (p&gt; 0.05) either alone or in combination with the PDE8 inhibitor. In experiment two, the PDE5 inhibitor alone did not affect the meiosis resumption (p&gt; 0.05), however, when associated with PDE3 and PDE8 inhibitors it delayed their resumption (p &lt;0.05) and also altered cGMP and cAMP levels of (p &lt;0.05) in the early hours of maturation. The third experiments showed the influence of FSHr during IVM, which stimulated the resumption of meiosis, but in combination with PDE5 and PDE8 inhibitors meiosis was delayed (p &lt;0.05). Furthermore, FSHr causes increased levels of cAMP and its association with PDE5 and PDE8 inhibitors caused an additional increase (p &lt;0.05). Culture conditions studied in experiment four showed that induced maturation (pre-IVM for two hours with agents to elevate cAMP followed by 22 hours IVM with FSH associated with PDE inhibitors) delayed the resumption of meiotic maturation at nine hours, but has no effect on meiosis progression at 24, 28 and 30 hours. The treatments, however, did not improve oocyte competence after in vitro fertilization and caused minor variations in the activation of MAPK in oocytes and cumulus cells.

A produção in vitro de embriões, no Brasil, ocupa lugar de destaque dentre as biotecnologias da reprodução animal e o atual desafio é torná-la cada vez mais acessível, para tanto, é fundamental aproximar os resultados de produção e sobrevivência dos embriões produzidos in vitro daqueles desenvolvidos naturalmente. Boa parte desta variação do potencial de desenvolvimento do embrião está relacionada à características do oócito. Há a possibilidade de essa capacidade estar relacionada ao perfil lipídico do líquido folicular e das células do folículo, neste sentido, este projeto teve como objetivo principal avaliar a correlação do potencial de desenvolvimento de oócitos com o conteúdo do perfil lipídico no líquido folicular e das células foliculares, baseado no sistema de ativação partenogenética, cultivo individual e analise retrospectiva. Não existe, até o momento, uma caracterização detalhada do microambiente folicular, um componente importante dos fluídos são os lipídios e recentemente tem sido demonstrado que eles estão envolvidos em vários aspectos do metabolismo além de também funcionarem como moléculas sinalizadoras ou até mesmo serem capazes de induzir modificações na cromatina. Os íons oriundos do estudo do perfil lipídico foram avaliados em comparação ao potencial de desenvolvimento do oócito. No conjunto de dados do MALDI observou-se maior concentração de triacilglicerídeos, principalmente contendo ácidos graxos como o oleico, linoleico e esteárico nos líquidos foliculares e células do folículo provenientes do ambiente folicular de oócitos que clivaram. No perfil lipídico do líquido folicular feito por LC-MS/MS os lipídios identificados foram de classes diversas, com participação expressiva no modo positivo de triacilgliceróis, fosfatidilcolinas, esfingomielinas, monoacildiacilglicerídeos entre outros e no modo negativo a classe lipídica que prevaleceu foi dos lipídios mitocondriais, as cardiolipinas. Também foram detectados lipídios citosólicos como o CE e alguns pouco descritos no líquido folicular como o PIP2 e PIP3, além disso, alguns lipídios foram característicos dos grupos clivados e blastocistos. O perfil lipídico do líquido folicular e das células do folículo é complexo e alguns lipídios deste ambiente tem potencial para serem biomarcadores de qualidade oocitária. / In vitro embryo production in Brazil occupies a prominent place among the animal reproduction biotechnology, the current challenge is to make it increasingly accessible so it is essential to approach the results of production and survival of in vitro produced embryos of those developed naturally. Much of this potential change of embryo development is related to the oocyte characteristics. There is the possibility of this ability is related to the lipid profile of follicular fluid and follicle cells , in this sense, this project aimed to evaluate the correlation of the oocytes development potential with the content of the lipid profile in follicular fluid and cells follicular, based on parthenogenetic activation , individual cultivation and retrospective analysis system. There isn\'t, to date, a detailed characterization of the follicular microenvironment, an important component of the follicular fluid and cels are the lipids and recently has been shown that they are involved in various aspects of metabolism in addition also function as signaling molecules or even be capable of inducing changes in chromatin. Derived ions from the study of lipid profile were evaluated compered with oocyte developmental potential. In MALDI dataset observed triacylglycerides higher concentration, mainly containing fatty acids such as oleic, linoleic and stearic acids in follicular fluid and follicle cells from follicular environment of cleaved oocytes. In follicular fluid lipid profile done by LC-MS/MS lipids were identified in diferent classes, with significant participation in positive mode of triacylglycerols, phosphatidylcholines, sphingomyelins, monoacildiacilglicerídeos among others and in negative mode prevailed lipid class was of mitochondrial lipids, the cardiolipin. Cytosolic lipids were also detected as CE and some little follicular fluid as described in the PIP2 and PIP3, and others lipids were characteristic of cleaved and blastocysts groups. The lipid profile of follicular fluid and follicle cells is complex and some of this lipid environment has the potential to be biomarkers of oocyte quality.

A resposta da produção in vitro de embriões (PIVE) é reduzida quando comparada à in vivo. O aprimoramento do conhecimento dos mecanismos de maturação de oócitos bovinos permite fornecer embasamento para incrementar os sistemas in vitro, aproximando-os do ideal fisiológico. O presente estudo visou investigar os efeitos da suplementação dos meios de maturação com FGF16 (10 ng/ml), BMP15 (100 ng/ml) e a interação de ambos sobre parâmetros relevantes ao desenvolvimento do complexo cumulus oócito (COC), tais como: expansão as células do cumulus (CC), fragmentação de DNA em CC e oócito, maturação nuclear oocitária, metabolismo energético e produção de progesterona. Os COC foram maturados em meios de tratamento (controle, FGF16, BMP15 e FGF16+BMP15) e avaliados em diferentes momentos da MIV (0 e 22 horas). A análise da expansão das CC demonstrou efeito positivo (p=0,0071) da BMP15 (11,34&plusmn;1,09 unidade arbitrária/UA) e da combinação FGF16&#43;BMP15 (11,34&plusmn;0,61 UA) em relação ao grupo controle (8,73&plusmn;0,44 UA) e ao suplementado com FGF16 (9,42&plusmn;0,65 UA). A presença de fragmentação de DNA em CC (p=0,0015) e oócitos (p=0,036) foi significativamente menor em COC tratados com BMP15 (11,73&plusmn;1,24 % e 3,81&plusmn;2,76 %, respectivamente) em comparação ao grupo FGF16 (22,54&plusmn;2,80 % e 31,13&plusmn;7,81 %, respectivamente). Ainda, o FGF16 causou aumento na incidência de fragmentação de DNA em CC, quando relacionado ao controle (16,04&plusmn;1,45 %). A taxa de maturação nuclear oocitária foi superior (p=0,014) no grupo suplementado com BMP15 (93,60&plusmn;4,03 %) em comparação aos grupos controle (80,80&plusmn;2,49 %) e FGF16 (76,75&plusmn;2,28 %), aproximando-se da totalidade. De forma inédita, descrevemos ação da BMP15 (10,79&plusmn;0,72 ng/ml) no incremento da produção de progesterona, sendo maior (p=0,0113) do que a produzida nos grupos controle (8,38&plusmn;0,39 ng/ml) e FGF16 (8,84&plusmn;0,45 ng/ml). Não foi evidenciado efeito dos tratamentos sobre o consumo de glicose e a produção de lactato. O presente estudo reforça o envolvimento da BMP15 na foliculogênese e na diferenciação do COC. Deste modo, a adição da BMP15 (100ng/ml) aos convencionais protocolos de PIVE pode ser de grande valia para elevar a efetividade desta biotecnologia. A suplementação de FGF16 (10ng/ml) se mostrou indiferente ao processo de maturação, permitindo inferir que o FGF16 não tenha envolvimento nas etapas da maturação compreendidas pelo presente estudo in vitro. Não foi observada ação sinérgica entre o FGF16 e a BMP15. / In vitro embryo production (IVEP) efficiency is reduced when compared to in vivo. Gaining knowledge of bovine oocyte maturation mechanisms will provide bases to improve in vitro systems. The present study assessed the in vitro effects of fibroblast growth factor 16 (FGF16), bone morphogenetic protein 15 (BMP15) and their interaction on relevant parameters to cumulus oocyte complex (COC) development, such as: cumulus cells (CC) expansion, oocyte and CC DNA fragmentation, nuclear maturation, energetic metabolism and progesterone production. COCs were matured in control or supplemented media containing, FGF16 (10ng/ml), BMP15 (100ng/ml), FGF16&plusmn;BMP15 and analyzed at different times of IVM (0 and 22 hours). CC expansion evaluation demonstrated a positive effect (p=0.0071) of BMP15 (11.34&plusmn;1.09 arbitrary unit/AU) and FGF16+BMP15 (11.34&plusmn;0,61 AU) when compared to control (8.73&plusmn;0.44 AU) and FGF16 groups (9.42&plusmn;0.65 UA). The presence of DNA fragmentation in CC (p=0.0015) and oocytes (p=0.036) were lower in COCs treated in media supplemented with BMP15 (11.73&plusmn;1.24 % and 3.81&plusmn2.76 %, respectively) in comparison to FGF16 group (22.54&plusmn;2.80 % and 31.13&plusmn;7.81 %, respectively). Moreover, FGF16 caused an increase in CC DNA fragmentation, when related to control (16.04&plusmn;1.45 %). Oocyte nuclear maturation rate was higher (p=0.014) in groups supplemented with BMP15 (93.60&plusmn;4.03 %) compared to control (80.80&plusmn;2.49 %) and FGF16 treatments (76.75&plusmn;2.28 %), almost reaching the totality of COCs. In an unprecedented way, we described the BMP15 increasing action on progesterone production (10.79&plusmn;0,72 ng/ml; p=0.0113) when compared to control (8.38&plusmn;0.39 ng/ml) and FGF16 groups (8.84&plusmn;0.45 ng/ml). There were no differences in glucose consumption and lactate production. The present study reinforces BMP15 involvement in folliculogenesis and COC differentiation. FGF16 (10 ng/ml) media supplementation did not improve any of the outcomes measured, suggesting that FGF16 is not involved in the maturation steps analyzed in the present in vitro study. Thus, the inclusion of BMP15 (100 ng/ml) to conventional IVEP protocols can be valuable to increase the effectiveness of this biotechnology. Synergistic action between FGF16 and BMP15 was not observed.

Orientador: Eliana Aguiar Petri Nahás / Resumo: Introdução: O câncer de mama é a neoplasia maligna mais frequente em mulheres. A redução da morbimortalidade aumentou a possibilidade de maternidade em mulheres em idade fértil após o tratamento, assim como a preocupação com a preservação da fertilidade diante da toxicidade ovariana relacionada aos tratamentos adjuvantes. A estimulação ovariana com letrozol e gonadotrofinas para a criopreservação de oócitos é procedimento bem estabelecido em pacientes com câncer de mama e desejo reprodutivo futuro. Entretanto, estudo recente comparando pacientes submetidas a preservação oncológica da fertilidade com protocolo utilizando gonadotrofinas e letrozol, com pacientes inférteis submetidas a fertilização in vitro mostrou maior taxa de oócitos imaturos e menor taxa de fertilização entre as pacientes que realizaram criopreservação de oócitos, sugerindo um possível efeito deletério do letrozol sobre a qualidade oocitária. Objetivo: Avaliar a influência do letrozol sobre a qualidade oocitária em pacientes com câncer de mama submetidas a estimulação ovariana para preservação da fertilidade. Métodos: Enstudo clínico de corte transversal realizado em hospital público terciário de São Paulo, por meio de análise de banco de dados e prontuários médicos. Foram avaliados parâmetros morfolóficos de 750 oócitos obtidos de pacientes com câncer de mama submetidas a estimulação ovariana com letrozol e gonadotrofinas para preservação da fertilidade no período de 2015 a 2016. Os dados foram comparados a... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Introduction: Breast cancer is the most common malignant neoplasm in women. Recent advances in early diagnosis and treatment have led to an increase in the survival rate. The reduction of morbidity and mortality increased the possibility of maternity after cancer in women of childbearing age and raised the concern about fertility preservation against gonadotoxic adjuvant treatments. Ovarian stimulation with letrozole and gonadotropins for cryopreservation of oocytes in patients with breast cancer and reproductive desire has been shown to be effective. Although a recent study comparing patients submitted to oncological fertility preservation with protocol using gonadotropins and letrozole to infertile patients submitted to in vitro fertilization performed only with gonadrotopins showed a higher rate of immature oocytes and lower fertilization rate among patients who received letrozole, suggesting a possible deleterious effect of letrozole on oocyte quality. Objective: To evaluate the influence of letrozole on oocyte quality in patients with breast cancer submitted to fertility preservation. Methods: An analytical cross-sectional study performed in a public tertiary hospital in São Paulo through chart analysis and medical records. We evaluated morphological parameters of 750 oocytes obtained from all breast cancer patients submitted to ovarian stimulation with letrozole and gonadotropins for fertility preservation between 2015 and 2016. They were compared to 699 oocytes from wo... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Submitted by Ludmila Machado Neves Bercaire (ludmila_machadoneves@yahoo.com.br) on 2018-08-06T17:40:21Z No. of bitstreams: 1 Dissertação Mestrado Ludmila Bercaire.pdf: 3380553 bytes, checksum: be2ff6e81191ee3fdfbeacb5ed05c530 (MD5) / Approved for entry into archive by Sulamita Selma C Colnago null (sulamita@btu.unesp.br) on 2018-08-08T16:27:00Z (GMT) No. of bitstreams: 1 bercaire_lmn_me_bot.pdf: 3380553 bytes, checksum: be2ff6e81191ee3fdfbeacb5ed05c530 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-08-08T16:27:02Z (GMT). No. of bitstreams: 1 bercaire_lmn_me_bot.pdf: 3380553 bytes, checksum: be2ff6e81191ee3fdfbeacb5ed05c530 (MD5) Previous issue date: 2018-02-27 / Introdução: O câncer de mama é a neoplasia maligna mais frequente em mulheres. A redução da morbimortalidade aumentou a possibilidade de maternidade em mulheres em idade fértil após o tratamento, assim como a preocupação com a preservação da fertilidade diante da toxicidade ovariana relacionada aos tratamentos adjuvantes. A estimulação ovariana com letrozol e gonadotrofinas para a criopreservação de oócitos é procedimento bem estabelecido em pacientes com câncer de mama e desejo reprodutivo futuro. Entretanto, estudo recente comparando pacientes submetidas a preservação oncológica da fertilidade com protocolo utilizando gonadotrofinas e letrozol, com pacientes inférteis submetidas a fertilização in vitro mostrou maior taxa de oócitos imaturos e menor taxa de fertilização entre as pacientes que realizaram criopreservação de oócitos, sugerindo um possível efeito deletério do letrozol sobre a qualidade oocitária. Objetivo: Avaliar a influência do letrozol sobre a qualidade oocitária em pacientes com câncer de mama submetidas a estimulação ovariana para preservação da fertilidade. Métodos: Enstudo clínico de corte transversal realizado em hospital público terciário de São Paulo, por meio de análise de banco de dados e prontuários médicos. Foram avaliados parâmetros morfolóficos de 750 oócitos obtidos de pacientes com câncer de mama submetidas a estimulação ovariana com letrozol e gonadotrofinas para preservação da fertilidade no período de 2015 a 2016. Os dados foram comparados a 699 oócitos de mulheres sem câncer de mama apresentando infertilidade por fator masculino, submetidas a estimulação ovariana para fertilização in vitro, através de pareamento por idade (grupo controle). A estimulação ovariana em pacientes com câncer de mama foi realizada com letrozol em combinação a gonadotrofinas em protocolo com antagonista do hormônio liberador de gonadotrofofina (GnRH). No grupo controle a estimulação ovariana foi realizada apenas com gonadotrofinas e a supressão hipofisária obtida com antagonista de GnRH. Os oócitos maduros obtidos foram analisados quanto à presença de corpos refráteis, cor e regularidade do ooplasma, grau de granulação central, cor e espessura da zona pelúcida, tamanho do espaço perivitelínico, presença de vacúolos e retração no oócito. Os resultados obtidos foram comparados ao grupo controle por análise estatística pelos testes de Qui-quadrado e Mann-Whitney. Estimou-se o odds ratio (OR) e o intervalo de confiança de 95% (CI) através de regressão logística para observar as possíveis associações entre uso de letrozol e os parâmetros morfológicos oocitários. Resultados: Foram analiados 750 oócitos obtidos de 69 pacientes com câncer de mama e comparados a 699 oócitos obtidos de 92 pacientes do grupo controle. A média de idade no grupo câncer de mama foi de 31,5 ± 4,1 anos e no grupo controle de 33,1 ± 7,1 anos (p=0,210). Foi observada maior incidência de dismorfismos oocitários no grupo câncer de mama que utilizou letrozol comparado ao grupo controle: espaço perivitelínico aumentado (p=0,007), zona pelúcida irregular (p<0,001), corpos refráteis (p<0,001), ooplasma escuro (p<0,001), ooplasma granuloso (p<0,001), ooplasma irregular (p<0,001) e presença de granulação central (p<0,001). Outras alterações morfológicas foram mais frequentes nos oócitos do grupo controle comparado ao grupo câncer de mama com letrozol: grânulos corticais (p<0,001), zona pelúcida de coloração alterada (p<0,001) e alterações de retículo endoplasmático liso (p<0,001). Não houve diferença estatística entre os grupos em relação aos parâmetros: retração (p=0,254) e vacúolos (p=0,974). Conclusão: A avaliação dos parâmetros morfológicos dos oócitos de mulheres com câncer de mama, submetidas a estimulação ovariana com letrozol e gonadotrofinas revelou maior ocorrência de dismorfismos quando comparado a mulheres sem câncer de mama submetidas a estimulação ovariana com gonadotrofinas. A utilização do letrozol mostrou-se como fator de risco para a presença de dismorfismos oocitários que podem ser traduzidos em pior qualidade oocitária. / Introduction: Breast cancer is the most common malignant neoplasm in women. Recent advances in early diagnosis and treatment have led to an increase in the survival rate. The reduction of morbidity and mortality increased the possibility of maternity after cancer in women of childbearing age and raised the concern about fertility preservation against gonadotoxic adjuvant treatments. Ovarian stimulation with letrozole and gonadotropins for cryopreservation of oocytes in patients with breast cancer and reproductive desire has been shown to be effective. Although a recent study comparing patients submitted to oncological fertility preservation with protocol using gonadotropins and letrozole to infertile patients submitted to in vitro fertilization performed only with gonadrotopins showed a higher rate of immature oocytes and lower fertilization rate among patients who received letrozole, suggesting a possible deleterious effect of letrozole on oocyte quality. Objective: To evaluate the influence of letrozole on oocyte quality in patients with breast cancer submitted to fertility preservation. Methods: An analytical cross-sectional study performed in a public tertiary hospital in São Paulo through chart analysis and medical records. We evaluated morphological parameters of 750 oocytes obtained from all breast cancer patients submitted to ovarian stimulation with letrozole and gonadotropins for fertility preservation between 2015 and 2016. They were compared to 699 oocytes from women without cancer submitted to ovarian stimulation for in vitro fertilization due to male factor infertility, matched by age (control group). Ovarian stimulation in patients with breast cancer was performed before chemotherapy with letrozole in combination with 14 gonadotropins in GnRH antagonist protocol. In control group, ovarian stimulation was performed with gonadotropins and pituitary suppression was obtained with GnRH antagonist. Mature oocytes obtained were analyzed for the presence of refractile bodies, color and regularity of the ooplasm, central granulation degree, zona pellucida thickness, the size of the perivitelinic space, presence of vacuoles and oocyte retraction. The obtained results were compared with the corresponding age control group through statistical analysis with Chi-square and Mann-Whitney tests. Analysis consisted to estimate the odds ratio (OR) and 95% confidence interval (CI), considering the group of letrozole to constitute a response compared with control group as reference (OR 1.0) to observe the possible associations between letrozole use (dependent variable) and the morphological oocytes parameters (independent variables). Results: We evaluated 750 oocytes obtained from 69 breast cancer patients and compared with 699 oocytes from 92 control patients. Mean age was 31.5 ± 4.1 years in the study group and 33.1 ± 7.1 years in control group (p=0.210). We observed higher incidence of in oocyte dysmorphisms in the letrozole group compared to the control group: increased perivitelinic space (p = 0.007), irregular zona pellucida (p<0.001), refractile bodies (p<0.001), dark ooplasm (p<0.001), granular ooplasm (p<0.001), irregular ooplasm (p<0.001) and dense central granulation (p<0.001). Other dysmorphisms were higher in the control group: cortical granules (p <0.001), zona pellucida with altered staining (p<0.001) and smooth-surfaced endoplasmic reticulum aggregates (p <0.001). There was no statistical difference between the groups in relation to the parameters: retraction (p=0.254) and vacuoles (p=0.974). 15 Conclusion: The evaluation of morphological parameters of oocytes from breast cancer patients submitted to ovarian stimulation protocol with letrozole and gonadotropins revealed greater occurrence of dysmorphisms when compared to infertile patients submitted to ovarian stimulation protocol with gonadotropins. The use of letrozole seems to be a risk factor for the presence of oocyte dysmorphisms that could be translated into poor oocyte quality.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:35:39Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009-02-17Bitstream added on 2014-06-13T19:05:47Z : No. of bitstreams: 1 costa_cgpr_dr_botfm.pdf: 1744933 bytes, checksum: d90abe2ebd4b5e05246936b2f56031cd (MD5) / Nas últimas décadas, alguns parâmetros laboratoriais têm sido propostos para identificar o potencial de saúde oocitária em Reprodução Assistida: 1. Maturidade nuclear e citoplasmática (pesquisa); 2. Dismorfismo (anomalias intracitoplasmáticas); 3. Fertilizaçao. Habitualmente, esses parâmetros (exceto a maturação citoplasmática) são avaliados pelo simples emprego de sistemas de microscopia de luz convencional. Nos últimos oito anos, foram relatados diversos estudos em oócitos humanos sobre a birrefringência da zona pelúcida (BF-ZP), a espessura da ZP, e a visualização do fuso meiótico (FM). Entretanto, ainda é discutível o poder desses novos parâmetros na seleção de óvulos com o pontecial de originar embriões com taxas de implantação elevadas, além disso, seu sistema de visualização e quantificação é complexo e dispendioso. O objetivo deste estudo foi investigar uma possível correlação entre esses parâmetros tradicionais com a BF-ZP, espessura da ZP e o FM. Dessa forma, um total de 73 pacientes que participaram do programa de injeção intracitoplasmática de espermatozóide (ICSI) no Centro de Reprodução Humana “Prof Franco Júnior” tiveram seus óvulos avaliados quanto a maturação nuclear (n=83), maturação citoplasmática (n=29), dismorfismo (n=280) e fertilização (n=216) sendo os resultados correlacionados com a imagem do FM (presença ou ausência), a intensidade da BF-ZP (positiva ou negativa) e a espessura da ZP. Os dados finais revelaram uma fraca correlação entre a maturação, o dismorfismo e a fertilização oocitária com a imagem do FM, a intensidade da BF-ZP, e a espessura da ZP. Entretanto, esses parâmetros poderiam ser responsáveis por identificar pontos biológicos diferentes do potencial de qualidade oocitária. Assim sendo, seria uma medida coerente, a utilização desses parâmetros, em forma conjunta, através de um escore de qualidade oocitária. / During the last decades, three laboratorial parameters have been proposed to identify the potential of the oocyte quality in ART: 1- Nuclear and cytoplasmic maturation; 2-Dysmorphims (intracytoplasmic abnormalities); 3 - Fertilization. These parameters (except the cytoplasmic maturation) are assessed by a simple system of conventional light microscopy. In the last eight years, numerous studies about zona pellucida birefringence (BF-ZP), zona pellucida thickness and meiotic spindle visualization have been reported. However, it is still controversial the power of these parameters in selecting oocyte with potential to develop into implantation-competent embryos. Furthermore, the microscopy system is complex and expensive. The present study aims to evaluate whether there is any correlation between the classical parameters with BF-ZP, ZP thickness and spindle image. A total of 73 patients who participated in an ICSI program had their oocytes evaluated such nuclear maturation (n=83), cytoplasmic maturation (n=29), dysmorphism (n=280) and fertilization (n=216) being its results correlated to the spindle image (presence or absence), BF-ZP intensity (positive or negative) and ZP thickness. The final results showed a low correlation between maturation, dysmorphism and fertilization compared to spindle image and ZP characteristics (BF-ZP, ZP thickness). However, these factors can be responsible to identify specific biological differ from the oocyte potential. Concluding, the use of these factors in association, as a score (oocyte quality score), could be the correct evaluation.

A maturação in vitro do oócito é um dos fatores limitantes na produção in vitro de embriões. In vivo, esta maturação é um processo altamente orquestrado no qual a meiose é retomada pela onda de gonadotrofina que antecede a ovulação e que induz à queda dos níveis de AMPc no oócito. No entanto, os oócitos aspirados ao serem retirados dos folículos ovarianos retomam espontaneamente a maturação comprometendo a competência de seu desenvolvimento. O AMPc é sintetizado pela adenilato ciclase (AC) e degradado pelas fosfodiesterases (PDE), existindo algumas relacionadas à degradação do AMPc e outras do GMPc. Sendo assim, a proposição deste trabalho foi averiguar a contribuição de diferentes isoformas de fosfodiesterases na retomada da meiose e nos níveis de GMPc, AMPc e ainda, determinar quando há manutenção de AMPc em níveis elevados observando sua influência na competência oocitária e ativação da MAPK. Para isso, os complexos cumulus-oócito (CCOs) foram maturados in vitro na ausência, presença ou associação de inibidores de PDEs-AMPc e GMPc específicas e FSHr. As amostras foram avaliadas em relação a: 1) taxa de maturação; 2) níveis intracelulares de AMPc e GMPc nos CCOs; 3) taxa de desenvolvimento de blastocistos ; 4) ativação da MAPK em oócitos e células do cumulus. Os resultados obtidos no primeiro experimento indiaram que o inibidor da PDE3 foi o mais eficaz (p&lt;0,05) em atrasar a retomada da meiose, às nove horas de maturação, porém, isolado ou em associação com o inibidor da PDE8, não foi capaz de alterar (p&gt;0,05) os níveis de AMPc. No experimento dois, o inibidor da PDE5 isolado não influenciou a retomada da meiose (p&gt;0,05), porém, quando associado aos inibidores da PDE3 e 8 houve atraso na retomada (p&lt;0,05) e ainda alteraram os níveis de GMPc e AMPc (p&lt;0,05) nas primeiras horas de maturação. O experimento três mostrou a influencia do FSHr durante a MIV, o qual estimulou a retomada da meiose, mas em associação com inibidores da PDE5 e 8 atrasa a retomada (p&lt;0,05). Além disso, o FSHr provoca aumento do nível de AMPc e sua associação com inibidores de PDE5 e PDE8 ocasionou elevação adicional (p&lt;0,05). As condições de cultivo estudadas no experimento quatro mostraram que a maturação induzida (pré-MIV de duas horas com agentes para elevar AMPc seguindo de 22 horas de MIV com FSH associado a inibidores de PDEs) atrasaram a retomada da meiose às nove horas de maturação, mas não afetaram progressão da meiose às 24, 28 e 30 horas. Os tratamentos, porém, não melhoraram a competência oocitária após a fertilização in vitro e ocasionaram pequenas variações na ativação da MAPK em oócitos e células do cumulus. / In vitro maturation of oocytes is a limiting factor in the in vitro production of bovine embryos. In vivo, this maturation is a highly orchestrated process in which meiosis resumption by the gonadotropin surge that precedes ovulation induces the decrease in cAMP levels in the oocyte. However, when oocytes are removed from follicles, they spontaneously resume maturation compromising the competence for its development. cAMP is synthesized by adenylyl cyclase (AC) and degraded by phosphodiesterases (PDE), and there are some PDEs related to degradation of cAMP and/or cGMP. Thus, the purpose of this work was to investigate the contribution of different isoforms of phosphodiesterases in the resumption of meiosis and levels of cAMP and, also, to determine differences in signaling pathways when maintaining high levels of cAMP and its influence on oocyte competence. For this purpose, cumulus-oocyte complexes (COC) were matured in vitro in the presence, absence or combination of inhibitors of cAMP- and cGMP-specific PDEs and FSH. Samples be were evaluated in relation to: 1) maturation rate, 2) intracellular levels of cAMP and cGMP in COCs, 3) rate of blastocyst development and 4) activation of MAPK in oocytes and cumulus cells. The results of the first experiment showed that the PDE3 inhibitor is more effective (p &lt;0.05) in delaying meiosis resumption, at nine hours of maturation, but was not capable of altering cAMP levels (p&gt; 0.05) either alone or in combination with the PDE8 inhibitor. In experiment two, the PDE5 inhibitor alone did not affect the meiosis resumption (p&gt; 0.05), however, when associated with PDE3 and PDE8 inhibitors it delayed their resumption (p &lt;0.05) and also altered cGMP and cAMP levels of (p &lt;0.05) in the early hours of maturation. The third experiments showed the influence of FSHr during IVM, which stimulated the resumption of meiosis, but in combination with PDE5 and PDE8 inhibitors meiosis was delayed (p &lt;0.05). Furthermore, FSHr causes increased levels of cAMP and its association with PDE5 and PDE8 inhibitors caused an additional increase (p &lt;0.05). Culture conditions studied in experiment four showed that induced maturation (pre-IVM for two hours with agents to elevate cAMP followed by 22 hours IVM with FSH associated with PDE inhibitors) delayed the resumption of meiotic maturation at nine hours, but has no effect on meiosis progression at 24, 28 and 30 hours. The treatments, however, did not improve oocyte competence after in vitro fertilization and caused minor variations in the activation of MAPK in oocytes and cumulus cells.