Made available in DSpace on 2016-12-08T16:24:20Z (GMT). No. of bitstreams: 1 PGCA15MA161.pdf: 119035 bytes, checksum: a5dfaf04161545272882e1423c258dc0 (MD5) Previous issue date: 2015-02-27 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The in vitro embryo production has a strong commercial and preservationist impact in Brazil. However, there are still barriers to be overcome, since the in vitro maturation does not mimic the in vivo maturation. The maturation optimization increases the embryo competence and quality, making them more cryotolerants. The meiotic blockage, after oocytes removal from their follicular environment, may be a good alternative. Three experiments (n = 2848) evaluated the Cordicepim as a meiotic blocker in bovine oocytes in different culture media, and its influence on embryonic development. Follicles 3-8 mm diameter, were punctured from abattoir ovaries and allocated into 4 groups: Control (TCM-199 + pyruvate, FSH, LH and SFB); MIVCord (TCM-199 + Pyruvate, FH, LH, FCS, Cordicepim); TCMCor (TCM-199 + Cordicepim) and TCMCont (TCM-199), followed by standard maturation (IVM) for 20 or 24 h. The effect of meiosis blockage in embryo production was assessed by cleavage and blastocyst rate, and total number of cells assessed. To evaluate the stage of maturation, oocytes were stained with Hoechst and evaluated by microscopy. Quantitative data were analyzed by ANOVA and Tukey test and the qualitative data by chi-square, with 5% significance. Cordicepim did not affect cleavage (60.7 vs. 56.4%) and blastocysts (30.7 vs. 24.8%) rates when added to supplemented medium (MIVCord). However, there was a reduction in cleavage (42%) and blastocysts (12.1%) rates when added to a medium without supplements (TCMCord). On the kinetics of maturation after 6 hours of pre culture, only TCMCord group maintained most oocytes blocked. Cell density of the produced embryos (26 h maturation) in MIVcont groups (189.2 ± 11.4), MIVCord (187.1 ± 12.1) and TCMCont (171.2 ± 10.4) did not differ and were higher than TCMCord group (119.7 ± 11.4). Already, with 30 h maturation cell density was similar between embryos from control group (224.2 ± 17.5) and TCMCord group (240.1 ± 10.4). However, even with 30 h maturation, only 64.8% of the oocytes completed maturation in TCMCord group, while 100% maturated in Control group. We conclude that 6 h of culture in cordicepim in the absence of gonadotropins, partially inhibits the meiosis in oocytes, and this inhibition is not successfully reversed even after 24 hours of maturation pattern in the absence of cordicepim. The cordicepim reduces embryo production when in vitro maturation is performed for 26 h. However, within 30 h maturation time, the Cordicepim does not affect embryo production rate. Yet, the cordicepim prevents the cumulus cells expansion in an irreversible manner / A produção in vitro de embriões tem um forte impacto comercial e preservacionista no Brasil. Entretanto ainda existem barreiras a serem superadas, já que a maturação in vivo não é totalmente mimetizada pela maturação in vitro. A otimização da maturação pode aumentar a competência e a qualidade embrionária, tornando-os mais criotolerantes. Uma boa alternativa pode ser o bloqueio meiótico reversível. Três experimentos (n = 2848) avaliaram o Cordicepim como bloqueador meiótico para oócitos bovinos, em diferentes meios de cultivo e sua influência no desenvolvimento embrionário. Folículos de 3-8 mm, obtidos por aspiração de ovários de frigorífico foram distribuídos em 4 grupos: Controle (TCM-199 + piruvato, FSH, LH e SFB) MIVCord (TCM-199 +Piruvato, FH, LH, SFB, Cordicepim) TCMCor (TCM-199 + Cordicepim) e TCMCont (TCM-199), seguido de maturação padrão (MIV) por 20 ou 24 horas. O efeito do bloqueio meiótico na produção de embriões foi avaliado pela taxa de clivagem, blastocisto e número total de células. Para avaliação do estágio de maturação, os oócitos foram corados com Hoechst e avaliados por microscopia. Os dados quantitativos foram submetidos à ANOVA e teste de Tukey e os qualitativos ao qui-quadrado, com 5% de significância. O Cordicepim não influenciou as taxas de clivagem (60,7 vs 56,4%) e blastocistos (30,7 vs 24,8%), quando empregado em meio suplementado (MIVCord). Porém, houve uma redução na taxa de clivagem (42%) e blastocistos (12,1%), quando empregado em meio sem suplementos (TCMCord). Na cinética de maturação nuclear após 6 horas de pré-maturação, apenas o grupo TCMCord manteve a maioria dos oócitos bloqueados (67%). A densidade celular dos embriões produzidos (26 h maturação) nos grupos controle (189,2 ± 11,4), MIVCord (187,1 ± 12,1) e TCMCont (171,2 ± 10,4) não diferiram entre si e foram superiores ao grupo TCMCord (119,7 ± 11,4). Já com 30 h de maturação a densidade celular dos embriões foi semelhante entre os grupos controle 30 (224,2 ± 17,5) e TCMCord 30 (240,1 ± 10,4). Porém, mesmo com 24 h de maturação padrão, apenas 64,8% dos oócitos do grupo TCMCord 30 completaram a maturação, enquanto no grupo controle 100% maturaram. Conclui-se que 6 h de pré-maturação em cordicepim, na ausência de suplementos, inibe parcialmente a meiose em oócitos bovinos, porém esta inibição não é revertida com êxito mesmo após 24 horas de maturação padrão na ausência de cordicepim. O cordicepim reduz a produção de embriões in vitro com 26 h de maturação. Já com 30 h de maturação, o Cordicepim não influencia a taxa de produção embrionária. Ainda, o cordicepim impede de forma irreversível a expansão das células do cumulus

Os mecanismos etiopatogênicos da infertilidade relacionada à endometriose não estão bem elucidados, especialmente em mulheres com estágios iniciais da doença (mínima e leve), em que não são observadas alterações anatômicas expressivas na cavidade pélvica. Questionamos a possibilidade de haver alterações no microambiente peritoneal de mulheres inférteis com endometriose que poderiam afetar a aquisição da competência oocitária e dessa forma, comprometer a fertilidade natural dessas mulheres. Para ser competente, o oócito precisa estar maduro e ter um fuso meiótico morfologicamente normal e funcional, garantindo a fidelidade da segregação cromossômica durante as divisões da meiose. Nesse sentido, o objetivo do presente estudo foi comparar o potencial impacto de diferentes concentrações (1% e 10%) de fluido peritoneal (FP) de mulheres férteis sem endometriose e mulheres inférteis com endometriose mínima e leve (EI/II) sobre a integridade do fuso celular e alinhamento cromossômico de oócitos bovinos maturados in vitro. Realizou-se um estudo experimental, onde amostras de FP foram obtidas de 12 mulheres (6 mulheres férteis sem endometriose e 6 mulheres inférteis com endometriose mínima e leve) submetidas a videolaparoscopia, respectivamente, para realização de laqueadura tubária e investigação de infertilidade. Oócitos bovinos imaturos foram submetidos a maturação in vitro (MIV) na ausência de FP, na presença de 1% e 10% de FP de mulheres férteis sem endometriose e na presença de 1% e 10% de FP de mulheres inférteis com EI/II. Foram realizados 6 experimentos de MIV e cada amostra de FP foi utilizada em apenas um experimento. Os oócitos foram fixados, marcados por imunofluorescência e então analisados por microscopia confocal. A porcentagem de oócitos meioticamente normais foi significantemente maior nos oócitos submetidos a MIV na ausência de FP (88.46%) e na presença de 1% (78.57%) e 10% (84.62%) de FP de mulheres férteis sem endometriose do que aqueles oócitos submetidos a MIV na presença de 1% (62.50%) e 10% (56.25%) de FP de mulheres inférteis com EI/II. Além disso, no grupo endometriose, a porcentagem de oócitos meioticamente normais foi significantemente maior nos oócitos submetidos a MIV na presença de 1% (62.50%) do que na presença de 10% (56.25%) de FP, sugerindo um efeito dose-dependente do FP de mulheres com endometriose na ocorrência de danos meióticos oocitários. Demonstrou-se que o FP de mulheres inférteis com EI/II comprometeu a maturação nuclear oocitária durante a MIV, de modo dosedependente, promovendo anormalidades meióticas em oócitos em metáfase II. Nossos resultados contribuem para a compreensão dos mecanismos etiopatogênicos da infertilidade relacionada à EI/II e abrem perspectivas para o estudo de novas abordagens terapêuticas visando melhorar a fertilidade natural destas pacientes. / The etiopathogenic mechanisms of endometriosis-related infertility are not well elucidated, especially in women with early stages of the disease (minimal and mild endometriosis), where significant anatomical abnormalities in the pelvic cavity are not observed. We question if alterations in the peritoneal microenvironment of infertile women with endometriosis might affect oocyte competence acquisition and in this way, compromise the natural fertility in these women. To be competent, the oocyte must be mature and have a morphologically normal and functional meiotic spindle, which ensure the fidelity of chromosome segregation during the divisions of meiosis. Thus, the aim of the present study was to compare the potencial impact of different concentrations (1% and 10%) of peritoneal fluid (PF) from fertile women without endometriosis and infertile women with minimal and mild endometriosis (EI/II) on spindle integrity and chromosomes alignment of bovine oocytes in vitro matured (IVM). We performed an experimental study, where PF samples were obtained from 12 women (six fertile women without endometriosis and six infertile women with minimal and mild endometriosis) submitted to laparoscopy, respectively for tubal ligation and investigation of infertility. Immature bovine oocytes were submitted to IVM in the absence of PF, in the presence of 1% and 10% PF from fertile women without endometriosis and in the presence of 1% and 10% PF from infertile women with EI/II. We performed 6 experiments of IVM and each PF sample was used in only one experiment. The oocytes were fixed, immunofluorescence staining and then, analyzed by confocal microscopy. The percentage of meiotically normal oocytes was significantly higher for oocytes that underwent IVM in the absence of PF (88.46%) and in the presence of 1% (78.57%) and 10% (84.62%) PF from fertile women without endometriosis than for oocytes that underwent IVM in the presence of 1% (62.50%) and 10% (56.25%) PF from infertile women with EI/II. Furthermore, in the endometriosis group, the percentage of meiotically normal oocytes was significantly higher for oocytes that underwent IVM in the presence of 1% (62.50%) than in the presence of 10% (56.25%) PF, suggesting a dose-dependent effect of PF from women with endometriosis on the occurrence of meiotic oocyte damage. The study have demonstrated that PF from infertile women with EI/II compromised the oocyte nuclear maturation during the IVM, in a dosedependent manner, promoting meiotic abnormalities in metaphase II oocytes. Our results contribute to a better understanding of the etiopathogenic mechanisms of infertility related to EI/II and open perspectives in the design of new therapeutic approaches to improve the natural fertility of these infertile women

Os mecanismos envolvidos na etiopatogênese da infertilidade em pacientes com endometriose não foram totalmente elucidados. A infertilidade apresentada por pacientes com as formas moderada e grave (estadios III e IV, respectivamente) seria, parcialmente, decorrente de alterações anatômicas pélvicas associadas à endometriose. Entretanto, há evidências de que lesões sutis ou implantes endometrióticos em estágios iniciais (estágio mínimo e leve) também poderiam contribuir com a etiopatogênese da infertilidade. Uma pior qualidade oocitária pode estar envolvida nas menores taxas de implantação após fertilização in vitro encontradas nessas pacientes. Questionamos a possibilidade de haver alterações no microambiente folicular de pacientes inférteis com endometriose, as quais poderiam afetar a aquisição de competência oocitária e, consequentemente, comprometer a fertilidade natural e os resultados dos tratamentos de reprodução assistida em mulheres com esta doença. Sabe-se que, para ser competente e poder ser fertilizado, o oócito precisa estar maduro e ter um fuso morfologicamente funcional, que garanta a fidelidade da segregação cromossômica durante a meiose. Dessa forma, o objetivo deste estudo foi avaliar o potencial impacto de diferentes concentrações de fluido folicular (FF) de mulheres inférteis com e sem endometriose leve sobre a integridade do fuso, alinhamento cromossômico e organização dos microfilamentos de actina de oócitos bovinos maturados in vitro. Realizou-se um estudo experimental, onde amostras de fluido follicular foram consecutivamente obtidas de 22 pacientes inférteis (11 com endometriose leve e 11 com infertilidade por fator tubário e/ou masculino) submetidas à estimulação ovariana para injeção intracitoplasmática de espermatozóide. Oócitos bovinos imaturos foram submetidos à maturação in vitro (MIV) sem adição de fluido follicular (sem fluido) e com 4 concentrações (1%, 5%, 10%, e 15%) de duas amostras de fluido folicular (uma de paciente com endometriose e outra de paciente sem endometriose). Foram realizadas 11 MIVs e cada amostra de fluido follicular foi usada apenas uma vez. Os oócitos foram fixados, marcados por imunofluorescência para visualização morfológica de microtúbulos, cromatina e microfilamentos de actina e, então, analisados por microscopia confocal. A porcentagem de anormalidade de oócitos em MII (fuso normal e cromossomos desalinhados, fuso anormal e cromossomos desalinhados, fuso anormal e cromossomos alinhados) foi significativamente maior naqueles maturados com FF de pacientes com endometriose (1%: 55,56%, 5%: 63,26%, 10%: 54,54%, 15%: 48,84%) quando comparados com oócitos maturados com FF de pacientes controles (1%: 19,15%, 5%: 23,44%, 10%: 25%, 15%: 23,81%) e oócitos maturados sem fluido (23,53%), sem haver diferença entre as concentrações testadas em cada grupo. Pode-se concluir que oócitos bovinos maturados in vitro na presença de FF de mulheres inférteis com endometriose leve têm maior freqüência de anormalidade meiótica. Estes dados sugerem que o FF de mulheres com endometriose pode comprometer a qualidade oocitária por promover danos ao fuso e/ou cromossomos / The mechanisms involved in the etiopathogenesis of infertility in patients with endometriosis have not been fully elucidated. The infertility presented by patients with moderate and severe disease (stages III and IV, respectively) would be partly due to anatomical pelvic changes associated with endometriosis. However, there are evidences that subtle lesions or endometriosis implants in the early stages (stages I and II) might also contribute to the etiophatogenesis of infertility. Impaired oocyte quality may be involved in lower implantation rates after in vitro fertilization in these patients. We question if alterations in the follicular microenvironment of infertile patients with endometriosis might affect oocyte competence acquisition and compromise the natural fertility and assisted reproduction treatment outcomes in women with this disease. It is known that to be competent and capable of fertilizing, the oocyte must be mature and have a morphologically functional spindle, which ensure the fidelity of chromosome segregation during meiosis. Thus, the aim of this study was to evaluate the potential impact of different concentrations of follicular fluid (FF) of infertile women with and without mild endometriosis on spindle integrity, chromosomes alignment and actin microfilaments organization of bovine oocytes in vitro matured. We performed an experimental study, where FF samples were consecutively obtained from 22 infertile patients (11 with mild endometriosis and 11 with tubal or male factors of infertility) submitted to ovarian stimulation for intracytoplasmic sperm injection. Immature bovine oocytes were submitted to in vitro maturation (IVM) without FF and with 4 concentrations (1%, 5%, 10%, and 15%) of 2 samples of FF (1 from a woman with endometriosis and one from a woman without endometriosis). We performed 11 IVM and each FF sample was used only once. The oocytes were then fixed, stained by immunofluorescence for morphological visualization of microtubules, chromatin and actin microfilaments, and then, analyzed by confocal microscopy. The percentage of abnormal MII oocytes was significantly higher for those matured with FF from patients with endometriosis (1%: 55.56%, 5%: 63.26%, 10%: 54.54%, 15%: 48.84%) when compared with oocytes matured with FF from patients without endometriosis (1%: 19.15%, 5%: 23.44%, 10%: 25%, 15%: 23.81%) and those matured without FF (23.53%), with no differences among the tested concentrations in each group. We can conclude that bovine oocytes matured in vitro in the presence of FF from infertile women with mild endometriosis have higher frequency of meiotic abnormalities. These data suggest that FF from women with endometriosis may compromise oocyte quality by promoting spindle and/or chromosomal damage

As técnicas de cultivo de folículos e oócitos in vitro, com o objetivo de se obter oócitos maduros para procedimentos de Reprodução Assistida (RA), têm sido aplicadas em diferentes contextos. O sucesso destes procedimentos está diretamente relacionado ao sistema de cultivo utilizado. A utilização de células da granulosa (CG) humanas cultivadas in vitro como um suporte para o co-cultivo destes oócitos imaturos e folículos tem sido descrita por alguns autores. A criopreservação destas células, considerando-se o contexto de sua obtenção em procedimentos de RA, permitiria a viabilização da aplicação destas células na prática clínica diária. Sendo assim, o objetivo deste estudo foi padronizar o congelamento de células da granulosa (CG) humanas para aplicação em sistemas de co-cultivos de folículos e oócitos imaturos. Foram obtidas CG de 20 voluntárias em tratamento de reprodução assistida, células de 10 voluntárias foram cultivadas em meio ?-MEM suplementado para interrupção da luteinização e congeladas após 48 horas em container \"Cryostep\" (grupo 2C- 2 cultivos) (etapa 2) e células de 10 voluntárias foram congeladas em container \"Cryostep\" sem cultivo prévio (grupo CD- congelamento direto) (etapa 3). Após o descongelamento estas células foram (re)cultivadas por 144 horas, com troca de meio em 48, 96 e 144 horas para avaliações da produção de estradiol (E2) e progesterona (P4) (ng/mL). Verificamos redução na contagem celular e na viabilidade celular tanto no método de congelamento direto (CD) quanto no método com dois cultivos (2C) após o descongelamento (p<0,05), e isso se refletiu na produção de estradiol e progesterona que foi maior nas culturas de células frescas em relação às células criopreservadas (p<0,05). Porém, a relação de E2/célula foi mantida após o descongelamento, sugerindo que esta redução na produção se deve à redução no número de células, as que sobrevivem se mantém normofuncionantes (p=0,23).O CD foi mais eficiente pois permitiu uma maior recuperação celular e uma melhor viabilidade quando comparado ao grupo 2C. A relação estradiol/progesterona foi mantida em todos os tempos de cultivo, fresco, CD e 2C (p>0,05), indicando que a característica funcional destas células foi preservada após o descongelamento. Concluímos que a criopreservação de CG humanas obtidas durante a captação de oócitos compromete a contagem celular e a viabilidade geral da cultura, entretanto, a capacidade funcional e a característica destas células se mantêm preservadas (manutenção das relações E2/célula e E2/P4) / Follicle and oocyte in vitro culture techniques, aiming to obtain mature oocytes for Assisted Reproductive Treatments (ART), have been applied to different contexts. The success of these procedures depends on the culture system used. The use of human granulosa cells (GC) in co-culture systems for follicle and oocyte maturation have been described by some authors. The cryopreservation of these cells, considering the context in which they are obtained during ART, would enable the usage of these cells in such procedures in daily clinical practice. Thus, the objective of this study was to standardize the freezing protocol for human granulosa cells (GC) for future applications in co-culture systems for follicle and oocyte maturation. Twenty volunteers submitted to ART donated their granulosa cells after oocyte retrieval, 10 were cultivated previously in order to interrupt the luteinization process and then frozen \"Cryostep\" container (group 2C- two cultures) (step 2) and 10 were directly frozen with no previous culture in the \"Cryostep\" container (group DF- direct freeze) (step 3). After thawing these cells were (re)cultured for 144 hours, with medium exchange at 48, 96 and 144 hours to evaluate the estradiol (E2) and progesterone (P4) production (ng/mL). After thawing, there was a reduction in the cell number (p<0,05) and cell viability in both methods, the direct freezing (DF) and the two cultures (2C) (p<0,05); this had an impact in the production of estradiol and progesterone, which were higher in fresh cultures than in the frozen ones (p<0,05). However, the E2/cell ratio was maintained after thawing (p=0.23), suggesting that this impairment in steroid production was probably due to the reduction in the cell count. The cells that survive remain functionally normal. The DF was more efficient since it allowed greater cell recovery and better viability when compared to 2C. The estradiol/progesterone ratio was maintained in all culture times, in the fresh, DF or 2C groups (p>0.05), indicating that the functional characteristic of these cells was preserved post-thawing. We conclude that cryopreservation of human GC obtained during oocyte retrieval compromises the cell count and the overall viability of the culture; however, the functional capacity and the characteristic of these cells are preserved (maintenance of E2/cell and E2/P4 relations)

Introdução: Apesar de controverso, questiona-se um papel deletério da endometriose nos resultados de procedimentos de reprodução assistida, o que pode estar relacionado ao comprometimento da qualidade oocitária. Para que o oócito maduro esteja preparado para a fertilização, é necessário que o fuso meiótico mantenha a sua integridade e funcionabilidade. Objetivos: Comparar a presença e localização do fuso meiótico e o estágio de maturação nuclear de oócitos com o primeiro corpúsculo polar (CP) visível de pacientes inférteis sem e com endometriose. Comparar os resultados de Injeção Intracitoplasmática de espermatozóides (ICSI) entre os oócitos em telófase I e metáfase II, e entre aqueles com e sem fuso celular visível, nos grupos analisados. Metodologia: Estudo prospectivo e controlado com pacientes inférteis, submetidas à estimulação ovariana para realização de ICSI, selecionadas consecutivamente e divididas em dois grupos: Controle (fator tubário e/ou masculino) e Endometriose (subdividido em endometriose mínima e leve I/II versus moderada e severa III/IV). Os oócitos com extrusão do primeiro CP foram avaliados pela microscopia de polarização imediatamente antes da realização da ICSI e caracterizados quanto à presença/localização do fuso celular em relação ao primeiro CP e ao estágio de maturação nuclear (telófase I ou metáfase II). Foram analisados as taxas de fertilização, clivagem, número de embriões de boa qualidade no segundo (D2) e terceiro (D3) dia de desenvolvimento oriundos dos oócitos em telófase I versus metáfase II, e metáfase II com fuso visível versus sem fuso visível, nos grupos controle, endometriose, endometriose I/II e endometriose III/IV. Resultados: Foram analisados 441 oócitos, sendo 254 do grupo controle e 187 do grupo endometriose (115 do grupo endometriose I/II e 72 do grupo endometriose III/IV). Não observamos diferença significativa entre a percentagem de oócitos em metáfase II com fuso celular visível e não visível (88,6%, 91,3%, 88,2%, respectivamente, nos grupos controle, endometriose I/II e endometriose III/IV) e entre a percentagem de oócitos com fuso celular nas diferentes localizações nos grupos avaliados. Entre os oócitos aparentemente maduros, observamos um aumento significativo de oócitos em telófase I no grupo endometriose III/IV (5,6%) quando comparado ao grupo endometriose I/II (0%). Observamos uma tendência a menores taxas de fertilização dos oócitos injetados em telófase I quando comparados aos em metáfase II, nos grupos controle (p=0,08), endometriose (p=0,05) e endometriose III/IV (p=0,09). Comparando-se os oócitos com e sem fuso celular visível, não observamos diferença significativa nos resultados de ICSI entre os grupos analisados. Conclusão: Não observamos diferença significativa entre os grupos analisados quanto à visualização e localização do fuso celular em oócitos maturados in vivo com o primeiro CP visível. Todavia, observamos um aumento significativo de oócitos em telófase I nas portadoras de endometriose moderada e severa, sugerindo um retardo ou comprometimento na conclusão da meiose I. Considerando que os oócitos injetados em telófase I apresentam piores taxas de fertilização do que os injetados em metáfase II, este achado poderia justificar o comprometimento dos resultados de reprodução assistida em mulheres inférteis com endometriose moderada e severa, além de ser utilizado com ferramenta prognóstica pós-ICSI. / Introduction: Although it has been a controversial issue for decades, a deleterious role of endometriosis on assisted reproductive techniques (ART) outcomes is questioned, which may be related to oocyte quality. For a mature oocyte be prepared for fertilization is necessary that the meiotic spindle keeps its integrity and its function. Objectives: To compare the presence and localization of the meiotic spindle and the oocyte nuclear maturation with the visible first polar body of infertile patients with and without endometriosis. To compare ICSI outcomes between oocytes on telophase I and metaphase II, and the ones with and without visible meiotic spindle, on those two groups. Methodology: A prospective and controlled study with infertile patients who underwent ovarian stimulation for purposes of ICSI, selected consecutively and divided into two groups: control (tubal and/or male factor) and endometriosis (subdivided in minimum and mild stage I/II versus moderate and severe stage III/IV). The oocytes with the first polar body extruded (in vivo matured oocytes) were imaged using a polarization microscopy immediately before ICSI and characterized according to the presence and localization of meiotic spindle and its relation to the first polar body and the nuclear maturation stage (telophase I and metaphase II). We have analyzed the fertilization rates, clivage, number of good quality embryos on the second (D2) and third (D3) day of development from oocytes on telophase I versus the ones on metaphase II, and metaphase II visible spindle versus the non-visible ones, on the control groups, endometriosis, endometriosis stage I/II and endometriosis stage III/IV. Results: A total of 441 oocytes were analyzed, 254 oocytes form the control group and 187 from the endometriosis one (115 from endometriosis stage I/II and 72 from endometriosis stage III/IV). No significant differences between the percentage of metaphase II with visible and non-visible meiotic spindle were found (88,6%, 91,3%, and 88,2%, in the control, endometriosis I/II and endometriosis III/IV groups, respectively). Among the apparently matured oocytes, we have observed a significant increase of oocytes on telophase I on the endometriosis III/IV group (5,6%) when compared with the endometriosis I/II group (0%). We have observed a tendency to fewer fertilization rates from the injected oocytes on telophase I when compared with the ones on metaphase II, on the control group (p=0,08), endometriosis (p=0,05) and endometriosis III/IV group (p=0,09). When we compared oocytes with and without visible meiotic spindle, we found no significant difference on ICSI outcomes among the studied groups. Conclusions: We have found no significant difference among the studied groups regarding the visualization and localization of the meiotic spindle from in vivo matured oocytes with a visible first polar body. However, we have observed a significant increase on the number of oocytes on telophase I from patients with moderate and severe endometriosis, suggesting a delay or an impairment in the completion of meiosis I. Since the injected oocytes on telophase I present a worse fertilization rates than the ones injected on metaphase II, this finding could explain the impairment on the outcomes of ART in infertile women with moderate and severe endometriosis, besides it could be used as a prognosis tool after ICSI procedures.

A produção in vitro de embriões é uma biotecnologia bastante difundida mundialmente. O Brasil, em 2015, foi responsável por aproximadamente 67% dos embriões bovinos produzidos in vitro no mundo (PERRY, 2014). Embora essa tecnologia seja bastante utilizada, é de grande interesse para o mercado desenvolver estratégias que levem ao maior aproveitamento dos oócitos obtidos e compreender os mecanismos, dentro do ambiente folicular, que determinam a competência oocitária. O microambiente folicular é fundamental para o crescimento e a aquisição da competência oocitária, tornando o oócito apto a desenvolver-se e manter o embrião até a transição materno embrionária. Para tanto, os componentes foliculares - células da granulosa, células do cumulus, oócito e líquido folicular - precisam trabalhar em unidade, visto que possuem uma relação de interdependência. Dentro dos mecanismos de comunicação existentes no ambiente folicular estão as vesículas secretadas por células, chamadas vesículas extracelulares, que foram descritas no líquido folicular, contendo material bioativo como proteínas, lipídios e RNAs, incluindo os microRNAs. Contudo, os componentes do ambiente folicular podem refletir na qualidade do oócito que será produzido e a hipótese geral deste trabalho é de que os miRNAs presentes no ambiente folicular regulam vias de sinalização importantes para o desenvolvimento oocitário e que os miRNAs e ou RNAs mensageiros presentes nas células foliculares podem ser explorados como importantes ferramentas para o diagnóstico da qualidade oocitária. O primeiro estudo determinou perfis transcricionais de miRNAs em células da granulosa, em complexos cumulus-oócito e em vesículas extracelulares derivadas destas células e também do fluido folicular. Além de conhecer a origem e o papel dos miRNAs no ambiente folicular, estes perfis de expressão indicaram a regulação no ambiente folicular da via de sinalização da PI3K-Akt. No segundo estudo, componentes desta via de sinalização foram então determinados em células foliculares associadas a oócitos de alta ou baixa competência ao desenvolvimento. Os resultados demonstram que a ativação da via PI3K-Akt em células foliculares correlaciona-se à maior competência oocitária; de modo oposto, a menor atividade desta via nas células foliculares está relacionada à reduzida competência oocitária. Nos estudos três e quatro, um conjunto de experimentos foram realizados para determinar o perfil de microRNAs e RNAs mensageiros em células do cumulus associadas a oócitos de alta ou baixa competência ao desenvolvimento. Buscou-se esclarecer alguns dos mecanismos responsáveis pela melhor qualidade oocitária e levar a identificação de biomarcadores de qualidade oocitária permitindo o avanço e o desenvolvimento de novas ferramentas para intensificar a produção in vitro de embriões bovinos. Por fim, estes resultados demonstram respostas integradas entre oócitos e células foliculares durante o desenvolvimento folicular e o processo de aquisição de competência oocitária e identificaram marcadores de qualidade oocitária. / In vitro embryo production of is a widespread biotechnology worldwide. In 2015 Brazil was responsible for approximately 67% of bovine embryos produced in vitro in the world (PERRY, 2014). Although widely used, to develop strategies that lead to better use of oocytes and understand the mechanisms (in follicular microenvironment) that determine oocyte competence is of great interest to national market. The follicular microenvironment is fundamental for oocyte growth and acquisition of competence, making the oocyte able to develop and maintain the embryo until the embryonic maternal transition. For this end, the follicular components - granulosa cells, cumulus cells, oocytes and follicular fluid - need to work in unity, since they have arelation of interdependence. Within the mechanisms of communication existing within the follicular environment are vesicles secreted by cells, called extracellular vesicles, which were described in follicular fluid, containing bioactive material such as proteins, lipids and RNAs, including microRNAs. The components of follicular environment may reflect the quality of the oocyte that will be produced and the general hypothesis of this work is that the miRNAs present in the follicular environment regulate signaling pathways important for oocyte development and that the miRNAs and/or messenger RNAs present in the follicular cells can be explored as important tools for the diagnosis of oocyte quality. The first study determined profiles of miRNAs in granulosa cells, cumulus-oocyte complexes and extracellular vesicles derived from these cells and also in follicular fluid. In addition, by knowing the origin and role of miRNAs in the follicular environment, the expression profiles indicated the PI3K-Akt signaling pathway regulation in the follicular environment. In the second study, components of this signaling pathway were then determined in follicular cells associated with oocytes of high or low developmental competence. The results demonstrated that the activation of the PI3K-Akt pathway in follicular cells correlates with increased oocyte competence; conversely, the lower activity of this pathway in follicular cells is related to reduced oocyte competence. In studies three and four, experiments were performed to determine the profile of microRNAs and messenger RNAs in cumulus cells associated with oocytes of high or low developmental competence. Aiming to clarify some of the mechanisms responsible for the best oocyte quality that lead to the identification of oocyte quality biomarkers, allows the advancement and development of new tools to intensify the in vitro production of bovine embryos. Finally, results obtained demonstrate integrated responses between oocytes and follicular cells during follicular development and give new insights to the study of oocyte competence acquisition process and identified oocyte quality markers.

No presente estudo avaliamos o impacto da adição de fluido folicular (FF) de mulheres inférteis sem e com endometriose em estágios iniciais (I/II) e avançados [(III/IV) sem e com endometrioma] ao meio de maturação in vitro (MIV) sobre as taxas de normalidade meiótica de oócitos bovinos. Avaliamos se a L-carnitina (LC) e os ácidos graxos ômega-3 [n3, ácidos docosahexaenóico (DHA) e eicosapentaenoico (EPA)] são capazes de prevenir os danos meióticos em oócitos bovinos induzidos por FF de mulheres inférteis com endometriose I/II e III/IV durante a MIV. Para isso, realizamos um estudo experimental utilizando modelo bovino. Trinta e duas amostras de FF foram colhidas de 24 mulheres inférteis com endometriose (8 com I/II, 8 com III/IV sem endometrioma e 8 III/IV com endometrioma no ciclo) e 8 sem endometriose (controle) que foram submetidas à estimulação ovariana controlada para realização de injeção intracitoplasmática de espermatozoide. Complexos cumulus-oócitos (CCOs) imaturos de bovinos foram submetidos à MIV divididos em 9 grupos: sem FF (sem-FF), com 1% de FF de mulheres inférteis sem endometriose (FFControle) e com endometriose (FFEI/II, FFEIII/IV e FFEendometrioma) suplementados ou não com LC (0,6mg/mL) e ácidos graxos ômega-3 (0,4 nM de DHA e 0,6 nM de EPA) (FFControle+LC+n3, FFEI/II+LC+n3, FFEIII/IV+LC+n3 e FFEendometrioma+LC+n3). Após 22-24h de MIV, os oócitos foram denudados, fixados e armazenados para realização de imunofluorescência para visualização do fuso meiótico e cromossomos por microscopia confocal. As taxas de metáfase II (MII) e de MII normais foram comparadas entre os 9 grupos utilizando o teste do qui-quadrado (p<0,05). Um total de 1686 CCOs imaturos foram submetidos à MIV, e 1401 oócitos foram visualizados por microscopia confocal. A adição de FF de mulheres com endometriose ao meio de MIV reduziu a taxa de MII normais (FFEI/II: 62,2%, FFEIII/IV: 70,2% e FFEendometrioma: 72,7%) comparado aos grupos sem-FF (87,2%) e FFControle (87,2%). O grupo FFEendometrioma (69,3%) apresentou a menor taxa de MII comparado a todos os demais grupos (sem-FF: 91,9%, FFControle: 89,2%, FFControle+LC+n3: 89,2%, FFEI/II: 85,4%, FFEI/II+LC+n3: 85,3%, FFEIII/IV: 80,7%, FFEIII/IV+LC+n3: 90,8%, FFEndometrioma+LC+n3: 86,4%). O grupo FFEIII/IV apresentou menor taxa de MII comparado ao grupo sem-FF. No grupo com FFControle, a adição de LC+n3 não alterou as taxas de MII (89,2% vs 89,2) e de MII normais (87,2% vs 82,5%). No grupo FFEI/II, a adição de LC+n3 aumentou a taxa de MII normais (84,5% vs. 62,2%). No grupo FFEIII/IV a adição de LC+n3 aumentou a taxa de MII normais (70,2% vs 84,1%) e de MII (90,8%), que passou a ser semelhante a dos grupos sem-FF e FFControle. No grupo FFEendometrioma a adição de LC+n3 aumentou a taxa de MII normais (86,4%), comparado ao grupo FFEendometrioma (69,3%), a qual foi similar a dos grupos sem-FF e FFControle. Portanto, o FF de mulheres com endometriose prejudica o fuso meiótico e o alinhamento cromossômico de oócitos bovinos, independentemente, do estágio da doença. Entretanto, o avanço da endometriose e a presença de endometrioma parecem ter um impacto ainda mais negativo na qualidade oocitária, prejudicando também a maturação nuclear. A adição de LC+n3 previne os danos meióticos oocitários provocados pelo FF de mulheres com endometriose em estágios iniciais e avançados. Dessa forma, sugerimos que inflamação, o estresse oxidativo e a desregulação da ?-oxidação são fatores envolvidos na alteração da qualidade oocitária e, consequente, piora da fertilidade natural de mulheres com endometriose. / In the present study, we evaluated the impact of the addition of follicular fluid (FF) from infertile women without and with endometriosis in the early (I/II) and advanced stages [(III/IV) with and without endometrioma] to the in vitro maturation (IVM) medium on the meiotic normality rates of bovine oocytes. We evaluated whether L-carnitine (LC) and omega-3 fatty acids [n3, docosahexaenoic (DHA) and eicosapentaenoic acid (EPA)] were able to prevent bovine meiotic oocyte damage induced by FF from infertile women with endometriosis in stages I/II and III/IV during IVM. For this, we performed an experimental study using bovine model. Thirty-two FF samples were collected from 24 infertile women with endometriosis (8 with I/II, 8 with III/IV without endometrioma and 8 III/IV with endometrioma in the cycle) and 8 without endometriosis (control) who underwent to controlled ovarian stimulation for intracytoplasmic sperm injection. Immature cumulus oocytes complexes(COCs) of bovines were submitted to IVM divided into 9 groups: without FF (No-FF), with 1% FF of infertile women without endometriosis (FFControl) and with endometriosis (FFEI/II, FFEIII/IV and FFEendometrioma) supplemented or not with LC (0.6 mg/mL) and omega-3 fatty acids (0.4 nM DHA and 0.6 nM EPA) (FFControl+LC+n3, FFEI/II+LC+n3, FFEIII/IV+LC+n3 and FFEendometrioma+LC+n3). After 22-24h of IVM, the oocytes were denuded, fixed and stored for subsequent immunofluorescence to visualize the meiotic spindle and chromosomes by confocal microscopy. The metaphase II (MII) and normal MII rates were compared between the 9 groups using the chi-square test (p <0.05). A total of 1686 immature COCs were submitted to IVM, and 1401 oocytes were visualized by confocal microscopy. Addition of FF from women with endometriosis to the IVM medium decreased the rate of normal MII (FFEI/II: 62.2%, FFEIII/IV: 70.2% and FFEendometrioma: 72.7%) compared to the No-FF (87.2%) and FFControl (87.2%) groups. The FFEendometrioma group (69.3%) presented the lowest rate of MII compared to all other groups (No-FF: 91.9%, FFControl: 89.2%, FFControl+LC+n3: 89.2%, FFEI/II: 85.4%, FFEI/II+LC+n3: 85.3%, FFEIII/IV: 80.7%, FFEIII/IV+LC+n3: 90.8%, FFEndometrioma+LC+n3: 86.4%). The FFEIII/IV group had a lower MII rate compared to the No-FF group. In the group with FFControl, the addition of LC+n3 did not change the rates of MII (89.2% vs 89.2%) and normal MII (87.2% vs 82.5%). In the FFEI/II group, the addition of LC+n3 increased the normal MII rate (84.5% vs 62.2%). In the FFEIII/IV group, the addition of LC+n3 increased the normal MII rate (70.2% vs 84.1%) and MII (90.8%), which was similar to that of the No-FF and FFControl. In the FFEendometrioma group, the addition of LC+n3 increased the normal MII rate (69.3% vs 86.4%) which was similar to No-FF and FFControl groups. Therefore, the FF of women with endometriosis impairs the meiotic spindle and the chromosomal alignment of bovine oocytes, regardless of the stage of the disease. However, the progression of endometriosis and the presence of endometrioma appear to have an even more negative impact on oocyte quality, and also impairs nuclear maturation. The addition of LC+n3 prevents meiotic oocyte damages induced by FF from women with endometriosis in the early and advanced stages. Thus, we suggest that inflammation, oxidative stress and deregulation of ?-oxidation are factors involved in the alteration of oocyte quality and, consequently, worsening of the natural fertility of women with endometriosis.