Orientador : Prof. Dr. Luis Amilton Foerster / Tese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Zoologia. Defesa: Curitiba, 31/07/2014 / Inclui referências / Area de concentração: Zoologia / Resumo: O arroz, em seu processo evolutivo adaptou-se aos mais variados ambientes, no entanto, diversos mecanismos causam a reducao da producao deste grao. Entre esses fatores, os insetos-pragas se destacam como responsaveis por grande parte das perdas que vao desde a germinacao ate a colheita. Todavia, as informacoes sobre os organismos que ocorrem em plantacoes de arroz, sao quase que exclusivamente para culturas de arroz irrigado, sendo os dados para o arroz de terras altas, ainda incipientes, principalmente nas regioes de maior utilizacao deste tipo de cultivo (Centro-Oeste, Norte e Nordeste do Brasil). Assim, essa tese teve como objetivos realizar o levantamento da entomofauna presente em cultura de arroz de terras altas, verificar os niveis de danos das principais pragas encontradas, e propor estrategias alternativas ao controle quimico, utilizando plantas fitoinseticidas. O levantamento e os experimentos de campo foram realizados na fazenda Florentino, municipio de Novo Progresso, sudoeste do estado do Para. O inventario da artropodofauna mostrou que o complexo dos principais artropodes encontrados condiz com o que ja se conhece para outras regioes produtoras de arroz no Brasil, principalmente pelos padroes e flutuacoes populacionais observados para os lepidopteros e pentatomideos pragas. Alem disso, registrou-se pela primeira vez o percevejo fitofago, Hypatropis inermis se alimentando de colmos de arroz, e um novo genero de percevejo predador novo para a ciencia (Pentatomidae, Asopinae). Os experimentos de simulacao do ataque de pragas desfolhadoras propiciaram a mensuracao do nivel de desfolha que a cultura pode suportar em determinado estadio fenologico e tambem permitiu quantificar a perda de produtividade. Estes dados podem ser utilizados para reduzir os custos do controle quimico, pois mostraram que para o arroz de terras altas, as desfolhas quando ocorrem principalmente no estadio vegetativo, requerem uma alternativa de controle. Nos experimentos em campo, para a avaliacao dos danos ocasionados pelos principais percevejos-pragas, mostrou que a alimentacao do percevejo-do-colmo, Tibraca limbativentris, afetou o tempo para liberacao da panicula, aumentou o numero de coracoes mortos e paniculas brancas, e afetou a quantidade de sementes produzidas, quando a alimentacao aconteceu na fase vegetativa. Considerando os danos observados, sugere-se que se mantenha o nivel de infestacao ja relatado na literatura para a tomada de decisao para o controle e acrescenta-se que o monitoramento da lavoura deve ocorrer durante todo o estagio vegetativo, uma vez que foi nesta fase fenologica que os maiores danos foram observados. Ja a alimentacao do percevejo-das-paniculas, Oebalus poecilus, mostrou que no arroz de terras altas, os graos de arroz sao suscetiveis aos danos quantitativos (quantidade e peso dos graos) e qualitativos (graos manchados, atrofiados, gessados e quebrados) ao longo de todo o desenvolvimento das paniculas. Todavia, quando os insetos se alimentam durante as fases de antese/cariopse e leitosa ocasionam porcentuais significativamente maiores de graos vazios (ate 83%) do que quando se alimentaram de graos em fases posteriores de desenvolvimento da panicula. Esta caracteristica tambem foi observada para a reducao do peso dos graos. Os experimentos visando encontrar uma alternativa biorracional para o controle dos principais percevejos-pragas, teve como objetivo verificar a acao ovicida e ninficida de oleos essenciais de diferentes partes vegetais de Piper aduncum, P. gaudichaudianum, P. malacophyllum, P. marginatum e P. tuberculatum (Piperaceae) sobre o percevejo-do-colmo do arroz. Os resultados mostraram que quase todas as especies de Piperaceae apresentaram atividade fitoinseticida. Esta caracteristica pode estar relacionada com a potencial toxicidade dos principais compostos quimicos encontrados em cada especie e parte vegetal, com destaque para os compostos dilapiol, miristicina, cubebene, ƒ¿-guaiene, longifolene, prezizane, spathulenol, sabinene e ƒÂ-2-carene. No geral, os resultados aprentados nessa tese podem beneficiar produtores e outros pesquisadores, permitindo-lhes concentrar os esforcos de monitoramento de diversas pragas de arroz de terras altas, para tomadas de decisoes mais bem informadas sobre quando e quais medidas de controle devem ser aplicadas. Palavras chave: Fitoinseticidas, Tibraca limbativentris, Oebalus poecilus, Hypatropis inermis, Piperaceae, pragas do arroz. / Abstract: Rice, in its evolutionary process adapted itself to various environments, however, several mechanisms cause reductions in grain production. Among these factors, insect-pests stand out as being responsible for much of the losses, that extend from germination to harvest. However, information about insects found in rice paddies, are almost exclusively for irrigated rice crops and the data for upland rice are still incipient, particularly in regions of higher cultivation of this crop type (Central West, North and Northeast of Brazil). Thus, the aims of this thesis was to perform a survey of the entomofauna of upland rice, evaluate the levels of damage of the main pests and propose alternative strategies to chemical control, using phytoinsecticides. The survey and the experiments on damage were conducted in Florentino farm, municipality of Novo Progresso, southwest region of Para state, Brazil. The survey showed that the complex of the main arthropods found is in agreement with what is already known for other rice producing regions in Brazil, mainly in relation to the distribution patterns and population fluctuations observed for lepidopteran and pentatomids. Furthermore, Hypatropis inermis (Pentatomidae, Pentatominae) was recorded for the first time feeding on rice stems and a new genus of predatory stinkbug (Pentatomidae, Asopinae) was collected. The experiments on simulation of defoliating pest attack enabled the measurement of the level of defoliation that the crop can support at different growth stages and also allowed to quantify the loss of productivity. These data can be used to reduce the cost of chemical control, since they showed that for upland rice, the defoliation during the vegetative stage, requires control measures. Field experiments to assess the damage caused by major stinkbug pests, showed that damage caused by the stem-feeding stinkbug Tibraca limbativentris, affected the time to panicle liberation, the number of dead hearts and white panicles, and decreased the amount of seed oduced when the damage was caused in the vegetative stage. Considering the damage observed, it is suggested to maintain the level of infestation already reported in the literature for the decision-making to control T. limbativentris and it is proposed that the monitoring of the crop should be done throughout the vegetative stage, since it was at this phenological stage that the greatest damage was observed. The feeding of the-panicle stimkbug, Oebalus poecilus, showed that in upland rice the grains of rice are susceptible to quantitative damage (number and grain weight) and qualitative (stained , shriveled, chalky and broken graims) in any phase of panicle development . However, when the insects feed during anthesis/caryopsis and milky phases cause am higher percentage of empty grains (up 83%) than when fed on grains at later stages of panicle development. This feature was also observed for the reduction of the weight of the grains. Experiments to find a biorracional alternative for the control of major stinkbug-pests, aimed to verify the ovicidal and nymphicidal action of essential oils from Piper aduncum, P. gaudichaudianum, P. malacophyllum, P. marginatum e P. tuberculatum (Piperaceae) against the stinkbugs-of-stem rice. The results showed that almost all Piperaceae species presented phyto-insecticide active. This characteristic may be related to the potential toxicity of the major chemical compounds found on each species of plant and especially for the compounds dilapiolle, myristicin, cubebene, ƒ¿-guaiene, longifolene, prezizane, spathulenol, sabinene and ƒÂ-2-carene. Overall, the information presented in this thesis can benefit producers and other researchers, enabling them to concentrate monitoring efforts of various pests of upland rice, for decision making better informed on when and what control measures should be applied. Keywords: Phyto-insecticides, Tibraca limbativentris, Oebalus poecilus, Hypatropis inermis, Piperaceae, rice pests.

ERO são produzidas continuamente por organismos aeróbicos. Em situações de estresse, a produção de ERO é aumentada, podendo causar a morte celular. Para manter uma concentração ideal de ERO dentro da célula, as plantas desenvolveram um complexo sistema antioxidante para proteção das membranas celulares e organelas contra os efeitos danosos causados pela ação dessas ERO sobre os tecidos vegetais. A ascorbato peroxidase (APx) é uma das principais enzimas do sistema de detoxificação de ERO nas plantas, catalisando a conversão do peróxido de hidrogênio em água, usando o ascorbato como doador de elétrons. No arroz, oito genes codificam APx. As diferentes isoformas são classificadas de acordo com a localização subcelular em citosólicas (APx1 e APx2), peroxissomais (APx3 e APx4), mitocondriais (APx5 e APx6) e cloroplastídicas (APx7 e APx8). O desenvolvimento do presente trabalho teve como objetivo geral caracterizar funcionalmente os genes de APx em arroz (Oryza sativa) com o intuito de identificar a função dos diferentes membros dessa família no controle dos níveis de ERO na planta. Foi analisado o padrão de expressão dos genes que codificam as diferentes isoformas de APx em arroz cultivado sob condições de estresses abióticos tais como o tratamento com concentrações tóxicas de alumínio, frio, seca e exposição ao peróxido de hidrogênio exógeno. Utilizando a estratégia de silenciamento por RNA de interferência (RNAi), foram produzidas construções para o silenciamento simultâneo dos genes OsAPx5 e OsAPx6 e, também, para os genes OsAPx7 e OsAPx8. Adicionalmente, foram ainda geradas construções gênicas para o silenciamento individual dos genes OsAPx7 e OsAPx8. Linhagens de arroz contendo construções RNAi para o silenciamento individual de OsAPx7 e OsAPx8 apresentaram redução de cerca de 90% na expressão relativa destes genes quando comparadas com plantas nãotransformadas. Os oito membros da família gênica APx em arroz mostraram padrão de expressão diferencial frente às condições de estresse testadas, indicando um complexo modo de regulação desses genes. / Aerobic organisms continuously produce Reactive Oxygen Species (ROS). Under stress conditions ROS production is increased and can lead to cellular death. To keep the ideal concentration of ROS inside the cells, plants developed a complex antioxidant system to protect cellular membranes and organelles against harmful effects produced by the action of these ROS. Ascorbate peroxidase (APx) is a major enzyme of the ROS detoxification system in plants, catalyzing the conversion of hydrogen peroxide into water using ascorbate as electron donor. In rice (Oryza sativa), eight genes encode APx. The different isoforms are classified according to their subcellular localization in cytosolic (APx1 and APx2), peroxisomal (APx3 and APx4), mitochondrial (APx5 and APx6) or chloroplastidic (APx7 and APx8). The general aim when developing the present work was to functionally characterize the APx genes in rice in order to identify the function of different members of this family in the control of ROS levels in the plant cell. The expression pattern of genes encoding different isoforms of APx in rice was analyzed when plants were grown under abiotic stress conditions such as under the treatment with toxic concentrations of aluminum, cold, drought and exposition to exogenous hydrogen peroxide. Using the strategy of gene silencing by interference RNA (RNAi), were produced RNAi constructs to simultaneously silence the OsAPx5 and OsAPx6 genes, and also the OsAPx7 and OsAPx8 genes. In addition, it was produced constructs to individually silence the OsAPx7 and OsAPx8 genes. Rice lines carrying RNAi to silence OsAPx7 and OsAPx8 individually presented reduction of gene expression of about 90% when compared to the expression assayed in non-transformed plants. The eight genes coding APx presented different expression patterns in response to the stress conditions tested, indicating that these genes are under a complex mode of regulation.

O arroz é o alimento base para metade da população mundial. Entretanto, é uma fonte pobre em micronutrientes essenciais como Fe e Zn, que são removidos durante o processamento do grão para produção de alimento. Por essa razão, populações cujas dietas baseiam-se principalmente em arroz estão sujeitas à deficiência de Fe e Zn, que são as deficiências nutricionais mais comuns no mundo, afetando mais de dois bilhões de pessoas. Uma vez que as folhas-bandeira são uma das fontes de remobilização de metais para os grãos em desenvolvimento, a identificação dos mecanismos moleculares que contribuem no processo de transporte de metais das folhas-bandeira para os grãos pode ser útil em programas de biofortificação. Dessa forma, utilizamos duas abordagens diferentes para estudar esta questão. Primeiro, realizamos uma análise por hibridização subtrativa supressora (SSH) em folhas-bandeira de duas cultivares de arroz e isolamos 78 sequências induzidas no estágio de enchimento do grão (R5) em relação ao estágio de emergência da panícula (R3). A expressão diferencial de alguns genes selecionados (entre eles do fator de transcrição OsNAC5) foi confirmada por PCR quantitativo. Mostramos que a expressão de OsNAC5 é ativada em processos de senescência natural (envelhecimento) e induzida (escuro, aplicação de ABA, alta salinidade, frio e deficiência de Fe) e sua expressão não é afetada na presença de 6- benzilaminopurina (um inibidor de senescência) em condição de senescência induzida por escuro. A indução da expressão de OsNAC5 sob alta salinidade é abolida por nicotinamida, um inibidor dos efeitos do ABA. Este resultado e a presença de elementos cis-atuantes na região promotora do gene OsNAC5 sugere uma regulação dependente de ABA. Utilizando quatro diferentes cultivares de arroz, mostramos que a indução de OsNAC5 é maior e antecipada em folhas-bandeira e panículas de plantas da cultivar IR75862, que possui as maiores concentrações de Fe, Zn e proteínas nas sementes. Dessa forma, sugerimos que OsNAC5 é um fator de transcrição do tipo NAC dependente de ABA e associado à senescência, e sua função pode estar relacionada à remobilização de Fe, Zn e aminoácidos dos tecidos verdes para os grãos. Posteriormente, analisamos a expressão de 25 genes de arroz relacionados à homeostase de metais em folhas-bandeira de oito cultivares de arroz (com níveis contrastantes de Fe e Zn nos grãos) durante os estágios de emergência da panícula (R3) e enchimento do grão (R5). Nove destes genes (OsYSL6, OsYSL8, OsYSL14, OsNRAMP1, OsNRAMP7, OsNRAMP8, OsNAS1, OsFRO1 e OsNAC5) apresentaram correlação significativa entre os níveis de expressão em folhas-bandeira e as concentrações de Fe e Zn nas sementes. Assim, nosso estudo forneceu uma pequena lista de possíveis genes-alvo para manipulação da concentração de Fe e Zn em grãos de arroz. / Rice is the staple food for half of the world population. However, it is a poor source of essential micronutrients such as Fe and Zn, most of which are lost during grain processing for food production. For this reason, populations with monotonous diets consisting mainly of rice are especially prone to Fe and Zn deficiency, which are the most common and widespread nutritional disorders in the world, affecting more than 2 billion people. Since flag leaves are one of the sources of remobilized metals for developing seeds, the identification of the molecular players that might contribute to the process of metal transport from flag leaves to the seeds may be useful for biofortification purposes. In this way, we used two different appraches to address this issue. First, we conducted suppression subtractive hybridization (SSH) analysis in flag leaves of two rice cultivars and isolated 78 sequences up-regulated in flag leaves at the grain filling stage (R5) relative to the panicle exertion stage (R3). Differential expression of selected genes (including the OsNAC5 transcription factor) was confirmed by quantitative RT-PCR. We showed that OsNAC5 expression is up-regulated by natural (aging) and induced senescence processes (dark, ABA application, high salinity, cold and Fedeficiency) and its expression is not affected in the presence of 6-benzylaminopurine (a senescence inhibitor) under dark-induced senescence. Salt induction of OsNAC5 expression is abolished by nicotinamide, an inhibitor of ABA effects. This result and the presence of cis-acting elements in the promoter region of the OsNAC5 gene suggest an ABA-dependent regulation. Using four different rice cultivars, we showed that OsNAC5 up-regulation is higher and earlier in flag leaves and panicles of IR75862 plants, which have higher seed concentrations of Fe, Zn and protein. We suggest that OsNAC5 is a novel senescenceassociated ABA-dependent NAC transcription factor and its function could be related to Fe, Zn and amino acids remobilization from green tissues to seeds. We also analyzed the expression of 25 metal-related genes from rice in flag leaves of eight rice cultivars (showing contrasting levels of seed Fe and Zn) during panicle emergence (R3) and grain filling stage (R5). The expression level of nine of these genes (OsYSL6, OsYSL8, OsYSL14, OsNRAMP1, OsNRAMP7, OsNRAMP8, OsNAS1, OsFRO1 and OsNAC5) in flag leaves exhibited significant correlations with Fe and/or Zn concentrations in the seeds. In this way, our study has provided a short list of putative target genes to manipulate Fe and Zn concentrations in rice grains.

Os agrupamentos ferro-enxofre [Fe-S] são grupos prostéticos requeridos em processos essenciais como respiração, fotossíntese, reações metabólicas, sinalização e regulação gênica. Em plantas, a biossíntese das proteínas Fe-S é compartimentalizada e adaptada às necessidades de uma célula eucariótica fotossintetizante. Diversos fatores ambientais afetam o desenvolvimento das plantas e limitam sua produtividade. Dentre esses organismos afetados encontram-se a soja e o arroz, culturas de grande importância comercial no Brasil e no mundo. Foram analisados, pelo método de RT-qPCR, os perfis de expressão dos genes que codificam a enzima cisteína desulfurase NFS1 e NFS2 de ambas as espécies, participantes da rota de formação dos cofatores [Fe-S] mitocondriais e plastídicos, respectivamente. Para Oryza sativa ssp. indica e ssp. japonica, as análises permitiram mostrar uma distribuição diferencial dos transcritos entre órgãos. OsNFS1 apresenta maiores níveis de transcritos tanto em raiz quanto em folha, enquanto OsNFS2 apresentou maiores níveis de transcritos em folha do que em raiz. A resposta destes genes ao frio (24 h a 4ºC) difere entre as subespécies. Na ssp. japonica, os dois genes são induzidos em ambos os tecidos. Para a ssp. indica há redução dos níveis de mRNA de NFS1 e aumento de NFS2 em folhas, e não há respostas em raízes. Nos tratamentos com alumínio na ssp. japonica, há redução dos níveis de mRNA de ambos os genes nas raízes, enquanto não há resposta na parte aérea. As análises em Glycine max, organismo que apresenta duplicação dos genes, permitiram demonstrar que a modulação destes é realizada de maneira diferencial. Em raiz, o tratamento com frio (5 h, 10 h e 24 h a 4ºC) promoveu a redução dos níveis de mRNA de uma das cópias de NFS1 e a indução da outra, enquanto os genes codificadores de NFS2 foram reprimidos. Em folha, o mesmo tratamento induziu uma das cópias de NFS1 e uma de NFS2, enquanto que as outras oscilaram em nível bem inferior de expressão. A exposição de G. max ao ácido salicílico induz a modulação dos genes mitocondriais, aumentando os níveis de mRNA em raízes e reprimindo-os em folhas. As análises dos cis-elementos permitiram mostrar a correlação destes com os dados encontrados em RT-qPCR. Desta maneira, tanto em arroz quanto em soja, a cisteína desulfurase parece ser modulada por diferentes estresses, possuindo padrões diferenciados conforme o órgão e o gene. / Iron-sulfur [Fe-S] clusters are prosthetic groups required to maintain life processes including respiration, photosynthesis, metabolic reactions, sensing, signaling and, gene regulation. In plants the biogenesis of Fe-S protein is compartmentalized and adapted to specific needs of the eukaryotic and photosynthetic cell. Many environmental factors affect plant development and limit the productivity and the geographical distribution. Among those affected organisms are soybean and rice, crops with huge economic importance worldwide. Here we analyze the expression profile of cysteine desulfurase genes NFS1 and NFS2, involved in the biogenesis of [Fe-S] clusters in mitochondria and plastid, respectively, from both species, by RT-qPCR. Analysis of Oryza sativa ssp. indica and ssp. japonica showed a differential expression between organs, OsNFS1 has a higher expression in roots and leaves than OsNFS2, and OsNFS2 is more expressed in leaves than in roots. Rice subspecies exhibited different responsiveness to cold. The japonica ssp. increased transcript level from both genes in both organs, while ssp. indica decreased OsNFS1 and increased OsNFS2 expressions in leaves, and did not change the expression pattern in roots. Rice ssp. japonica showed a decrease in OsNFS1 and OsNFS2 transcript levels in root, while leaves did not change, under aluminum stress. Soybean analysis, which presents duplication of both genes, demonstrated particular transcript levels considering organ and stress response. GmNFS1 had a high expression in roots, while GmNFS2 did not differ between organs. Cold-treated plants (0, 5, 10 and 24h at 4°C) showed a decrease in cysteine desulfurases transcript level in roots, and an increase in leaves. Plants treated with salicylic acid increased GmNFS1 transcript level in roots, and decreased in leaves. Besides that, an analysis of promoter regions showed the presence of different cis-elements among cysteine desulfurase genes, corroborating with differential expression of each loci. Our results suggest that cysteine desulfurases, in rice and soybean, may be involved in stress response, being modulated by different stimuli according to organ and gene.

Os campos de arroz irrigado são ambientes propícios para a geração de uma alta biodiversidade já que estão circundados por habitats aquáticos e terrestres. Os insetos praga ocorrem em áreas de produção do arroz em todo o mundo, principalmente nos sistemas de plantio irrigado e de planícies pluviais, que apresentam temperatura e umidade favorável à proliferação dos mesmos. Dentre os inimigos naturais que atuam sobre populações de insetos praga no arroz, destacam-se os parasitoides. Visando compreender a dinâmica espaço-temporal destes insetos, os objetivos desse trabalho foram descrever e comparar assembleias de parasitoides em áreas de cultivo de arroz irrigado, mantidas no sistema orgânico de produção, sob dois manejos da vegetação das taipas e relacioná-los com os estádios fenológicos da cultura (plântula, vegetativo e reprodutivo) e na pós-colheita. As amostragens foram realizadas em cultivo localizado no Assentamento “Filhos de Sepé”, no distrito de Águas Claras, município de Viamão, RS. A área total de 18 ha foi subdividida em duas. Numa subárea, denominada não roçada (NR) a vegetação espontânea das taipas foi mantida, na outra, roçada (R), foram feitas roçadas mensais das taipas, desde o início do preparo da área para o plantio, até a colheita. Em cada subárea foram escolhidos dois quadros onde foram instaladas as armadilhas do tipo Malaise, quatro armadilhas por subárea. As coletas quinzenais ocorreram a partir do plantio do arroz, no final do mês de outubro de 2012, até a colheita, março de 2013. As armadilhas permaneciam montadas no campo, a cada ocasião de amostragem, por 24 horas. Foram coletados 3.184 himenópteros parasitoides, 2.038 indivíduos na subárea NR e 1.146 na R. Foram identificadas 458 morfoespécies, distribuídas em 24 famílias. Mymaridae se mostrou a família mais abundante e Eulophidae, a mais rica para ambas as subáreas. A curva de rarefação, plotando o número de morfoespécies registradas em relação ao número de indivíduos coletados, indica que a NR possui uma maior riqueza que a R. Das morfoespécies identificadas, 198 foram compartilhadas entre as subáreas, 203 exclusivas da NR e, 57 da R. As famílias com o maior número de espécies compartilhadas foram Platygastridae, Eulophidae e Mymaridae. A riqueza e a abundância de parasitoides variaram conforme os estádios fenológicos da cultura sendo o pico de abundância registrado no período vegetativo. O Índice de Morisita identificou três grupamentos indicando uma similaridade relacionada às fases da cultura, plântula, vegetativo e, na pós-colheita. Isso se deve à grande quantidade de morfoespécies compartilhadas entre as subáreas em cada fase. As maiores diferenças ocorrem no período reprodutivo, possivelmente devido a grande diferença entre a riqueza da subárea NR em relação à R. / Irrigated rice fields are ideal environments for generating high biodiversity, since they are surrounded by aquatic and terrestrial habitats. Pest insects occur in areas of rice production throughout the world, principally in irrigated plantation systems and in floodplains, which present temperature and humidity levels that favor their proliferation. Among the natural enemies that act upon populations of pest insects in rice fields, parasitoids are especially notable. To better understand the space-time dynamics of these insects, the objectives of this study were to describe and compare groups of parasitoids in irrigated rice field, with organic management using two different systems of leeves vegetation management, and relate them to the phenological stages of rice cultivation (seedling, vegetative, and reproductive) and in postharvest. The samples were taken in a plantation located on the “Filhos de Sepé” settlement in Águas Claras district, Viamão, RS. The total area of 18 ha was divided into two parts, a no-cut (NC) subarea and a cut (C) subarea. In the NC subarea, the spontaneous vegetation of the leeves was maintained, while in the C subarea, monthly cuts were made in the leeves vegetation, from the beginning of soil preparation until the harvest. In each subarea, four Malaise traps were installed. Collections occurred from the beginning of cultivation, at the end of October 2012, until harvest, in March 2013, twice a month. The traps remained assembled in the field for 24 hours at each sampling. A total of 3,184 Hymenoptera parasitoids were collected: 2,038 individuals in NC and 1,146 in C. We identified 488 morphospecies, distributed in 24 families. Mymaridae was the most abundant family and Eulophidae was the richest in both subareas. The rarefaction curve, plotting the number of morphospecies registered in relation to the number of individuals collected, indicates that NC possesses a greater richness than C. Of the identified morphospecies, 198 were overlaped between the subareas, while 203 were exclusive to NC and 57 to C. The families with the largest number of shared species were Platygastridae, Eulophidae e Mymaridae. The richness and abundance of parasitoids varied according to the phenological states of development, with the peak abundance registering in the vegetative period. The Morisita index identified three groupings, indicating a similarity relative to the three phases of rice growth and development: seedling, vegetative, and post-harvest. This is due to the large quantity of morphospecies overlaped between the subareas in each phase. The greatest differences occurred during the reproductive period, possibly due to the large difference between the richness of NC in relation to C.

O arroz é o alimento base para metade da população mundial. Entretanto, é uma fonte pobre em micronutrientes essenciais como Fe e Zn, que são removidos durante o processamento do grão para produção de alimento. Por essa razão, populações cujas dietas baseiam-se principalmente em arroz estão sujeitas à deficiência de Fe e Zn, que são as deficiências nutricionais mais comuns no mundo, afetando mais de dois bilhões de pessoas. Uma vez que as folhas-bandeira são uma das fontes de remobilização de metais para os grãos em desenvolvimento, a identificação dos mecanismos moleculares que contribuem no processo de transporte de metais das folhas-bandeira para os grãos pode ser útil em programas de biofortificação. Dessa forma, utilizamos duas abordagens diferentes para estudar esta questão. Primeiro, realizamos uma análise por hibridização subtrativa supressora (SSH) em folhas-bandeira de duas cultivares de arroz e isolamos 78 sequências induzidas no estágio de enchimento do grão (R5) em relação ao estágio de emergência da panícula (R3). A expressão diferencial de alguns genes selecionados (entre eles do fator de transcrição OsNAC5) foi confirmada por PCR quantitativo. Mostramos que a expressão de OsNAC5 é ativada em processos de senescência natural (envelhecimento) e induzida (escuro, aplicação de ABA, alta salinidade, frio e deficiência de Fe) e sua expressão não é afetada na presença de 6- benzilaminopurina (um inibidor de senescência) em condição de senescência induzida por escuro. A indução da expressão de OsNAC5 sob alta salinidade é abolida por nicotinamida, um inibidor dos efeitos do ABA. Este resultado e a presença de elementos cis-atuantes na região promotora do gene OsNAC5 sugere uma regulação dependente de ABA. Utilizando quatro diferentes cultivares de arroz, mostramos que a indução de OsNAC5 é maior e antecipada em folhas-bandeira e panículas de plantas da cultivar IR75862, que possui as maiores concentrações de Fe, Zn e proteínas nas sementes. Dessa forma, sugerimos que OsNAC5 é um fator de transcrição do tipo NAC dependente de ABA e associado à senescência, e sua função pode estar relacionada à remobilização de Fe, Zn e aminoácidos dos tecidos verdes para os grãos. Posteriormente, analisamos a expressão de 25 genes de arroz relacionados à homeostase de metais em folhas-bandeira de oito cultivares de arroz (com níveis contrastantes de Fe e Zn nos grãos) durante os estágios de emergência da panícula (R3) e enchimento do grão (R5). Nove destes genes (OsYSL6, OsYSL8, OsYSL14, OsNRAMP1, OsNRAMP7, OsNRAMP8, OsNAS1, OsFRO1 e OsNAC5) apresentaram correlação significativa entre os níveis de expressão em folhas-bandeira e as concentrações de Fe e Zn nas sementes. Assim, nosso estudo forneceu uma pequena lista de possíveis genes-alvo para manipulação da concentração de Fe e Zn em grãos de arroz. / Rice is the staple food for half of the world population. However, it is a poor source of essential micronutrients such as Fe and Zn, most of which are lost during grain processing for food production. For this reason, populations with monotonous diets consisting mainly of rice are especially prone to Fe and Zn deficiency, which are the most common and widespread nutritional disorders in the world, affecting more than 2 billion people. Since flag leaves are one of the sources of remobilized metals for developing seeds, the identification of the molecular players that might contribute to the process of metal transport from flag leaves to the seeds may be useful for biofortification purposes. In this way, we used two different appraches to address this issue. First, we conducted suppression subtractive hybridization (SSH) analysis in flag leaves of two rice cultivars and isolated 78 sequences up-regulated in flag leaves at the grain filling stage (R5) relative to the panicle exertion stage (R3). Differential expression of selected genes (including the OsNAC5 transcription factor) was confirmed by quantitative RT-PCR. We showed that OsNAC5 expression is up-regulated by natural (aging) and induced senescence processes (dark, ABA application, high salinity, cold and Fedeficiency) and its expression is not affected in the presence of 6-benzylaminopurine (a senescence inhibitor) under dark-induced senescence. Salt induction of OsNAC5 expression is abolished by nicotinamide, an inhibitor of ABA effects. This result and the presence of cis-acting elements in the promoter region of the OsNAC5 gene suggest an ABA-dependent regulation. Using four different rice cultivars, we showed that OsNAC5 up-regulation is higher and earlier in flag leaves and panicles of IR75862 plants, which have higher seed concentrations of Fe, Zn and protein. We suggest that OsNAC5 is a novel senescenceassociated ABA-dependent NAC transcription factor and its function could be related to Fe, Zn and amino acids remobilization from green tissues to seeds. We also analyzed the expression of 25 metal-related genes from rice in flag leaves of eight rice cultivars (showing contrasting levels of seed Fe and Zn) during panicle emergence (R3) and grain filling stage (R5). The expression level of nine of these genes (OsYSL6, OsYSL8, OsYSL14, OsNRAMP1, OsNRAMP7, OsNRAMP8, OsNAS1, OsFRO1 and OsNAC5) in flag leaves exhibited significant correlations with Fe and/or Zn concentrations in the seeds. In this way, our study has provided a short list of putative target genes to manipulate Fe and Zn concentrations in rice grains.

Os agrupamentos ferro-enxofre [Fe-S] são grupos prostéticos requeridos em processos essenciais como respiração, fotossíntese, reações metabólicas, sinalização e regulação gênica. Em plantas, a biossíntese das proteínas Fe-S é compartimentalizada e adaptada às necessidades de uma célula eucariótica fotossintetizante. Diversos fatores ambientais afetam o desenvolvimento das plantas e limitam sua produtividade. Dentre esses organismos afetados encontram-se a soja e o arroz, culturas de grande importância comercial no Brasil e no mundo. Foram analisados, pelo método de RT-qPCR, os perfis de expressão dos genes que codificam a enzima cisteína desulfurase NFS1 e NFS2 de ambas as espécies, participantes da rota de formação dos cofatores [Fe-S] mitocondriais e plastídicos, respectivamente. Para Oryza sativa ssp. indica e ssp. japonica, as análises permitiram mostrar uma distribuição diferencial dos transcritos entre órgãos. OsNFS1 apresenta maiores níveis de transcritos tanto em raiz quanto em folha, enquanto OsNFS2 apresentou maiores níveis de transcritos em folha do que em raiz. A resposta destes genes ao frio (24 h a 4ºC) difere entre as subespécies. Na ssp. japonica, os dois genes são induzidos em ambos os tecidos. Para a ssp. indica há redução dos níveis de mRNA de NFS1 e aumento de NFS2 em folhas, e não há respostas em raízes. Nos tratamentos com alumínio na ssp. japonica, há redução dos níveis de mRNA de ambos os genes nas raízes, enquanto não há resposta na parte aérea. As análises em Glycine max, organismo que apresenta duplicação dos genes, permitiram demonstrar que a modulação destes é realizada de maneira diferencial. Em raiz, o tratamento com frio (5 h, 10 h e 24 h a 4ºC) promoveu a redução dos níveis de mRNA de uma das cópias de NFS1 e a indução da outra, enquanto os genes codificadores de NFS2 foram reprimidos. Em folha, o mesmo tratamento induziu uma das cópias de NFS1 e uma de NFS2, enquanto que as outras oscilaram em nível bem inferior de expressão. A exposição de G. max ao ácido salicílico induz a modulação dos genes mitocondriais, aumentando os níveis de mRNA em raízes e reprimindo-os em folhas. As análises dos cis-elementos permitiram mostrar a correlação destes com os dados encontrados em RT-qPCR. Desta maneira, tanto em arroz quanto em soja, a cisteína desulfurase parece ser modulada por diferentes estresses, possuindo padrões diferenciados conforme o órgão e o gene. / Iron-sulfur [Fe-S] clusters are prosthetic groups required to maintain life processes including respiration, photosynthesis, metabolic reactions, sensing, signaling and, gene regulation. In plants the biogenesis of Fe-S protein is compartmentalized and adapted to specific needs of the eukaryotic and photosynthetic cell. Many environmental factors affect plant development and limit the productivity and the geographical distribution. Among those affected organisms are soybean and rice, crops with huge economic importance worldwide. Here we analyze the expression profile of cysteine desulfurase genes NFS1 and NFS2, involved in the biogenesis of [Fe-S] clusters in mitochondria and plastid, respectively, from both species, by RT-qPCR. Analysis of Oryza sativa ssp. indica and ssp. japonica showed a differential expression between organs, OsNFS1 has a higher expression in roots and leaves than OsNFS2, and OsNFS2 is more expressed in leaves than in roots. Rice subspecies exhibited different responsiveness to cold. The japonica ssp. increased transcript level from both genes in both organs, while ssp. indica decreased OsNFS1 and increased OsNFS2 expressions in leaves, and did not change the expression pattern in roots. Rice ssp. japonica showed a decrease in OsNFS1 and OsNFS2 transcript levels in root, while leaves did not change, under aluminum stress. Soybean analysis, which presents duplication of both genes, demonstrated particular transcript levels considering organ and stress response. GmNFS1 had a high expression in roots, while GmNFS2 did not differ between organs. Cold-treated plants (0, 5, 10 and 24h at 4°C) showed a decrease in cysteine desulfurases transcript level in roots, and an increase in leaves. Plants treated with salicylic acid increased GmNFS1 transcript level in roots, and decreased in leaves. Besides that, an analysis of promoter regions showed the presence of different cis-elements among cysteine desulfurase genes, corroborating with differential expression of each loci. Our results suggest that cysteine desulfurases, in rice and soybean, may be involved in stress response, being modulated by different stimuli according to organ and gene.

Resumo não disponível

Os campos de arroz irrigado são ambientes propícios para a geração de uma alta biodiversidade já que estão circundados por habitats aquáticos e terrestres. Os insetos praga ocorrem em áreas de produção do arroz em todo o mundo, principalmente nos sistemas de plantio irrigado e de planícies pluviais, que apresentam temperatura e umidade favorável à proliferação dos mesmos. Dentre os inimigos naturais que atuam sobre populações de insetos praga no arroz, destacam-se os parasitoides. Visando compreender a dinâmica espaço-temporal destes insetos, os objetivos desse trabalho foram descrever e comparar assembleias de parasitoides em áreas de cultivo de arroz irrigado, mantidas no sistema orgânico de produção, sob dois manejos da vegetação das taipas e relacioná-los com os estádios fenológicos da cultura (plântula, vegetativo e reprodutivo) e na pós-colheita. As amostragens foram realizadas em cultivo localizado no Assentamento “Filhos de Sepé”, no distrito de Águas Claras, município de Viamão, RS. A área total de 18 ha foi subdividida em duas. Numa subárea, denominada não roçada (NR) a vegetação espontânea das taipas foi mantida, na outra, roçada (R), foram feitas roçadas mensais das taipas, desde o início do preparo da área para o plantio, até a colheita. Em cada subárea foram escolhidos dois quadros onde foram instaladas as armadilhas do tipo Malaise, quatro armadilhas por subárea. As coletas quinzenais ocorreram a partir do plantio do arroz, no final do mês de outubro de 2012, até a colheita, março de 2013. As armadilhas permaneciam montadas no campo, a cada ocasião de amostragem, por 24 horas. Foram coletados 3.184 himenópteros parasitoides, 2.038 indivíduos na subárea NR e 1.146 na R. Foram identificadas 458 morfoespécies, distribuídas em 24 famílias. Mymaridae se mostrou a família mais abundante e Eulophidae, a mais rica para ambas as subáreas. A curva de rarefação, plotando o número de morfoespécies registradas em relação ao número de indivíduos coletados, indica que a NR possui uma maior riqueza que a R. Das morfoespécies identificadas, 198 foram compartilhadas entre as subáreas, 203 exclusivas da NR e, 57 da R. As famílias com o maior número de espécies compartilhadas foram Platygastridae, Eulophidae e Mymaridae. A riqueza e a abundância de parasitoides variaram conforme os estádios fenológicos da cultura sendo o pico de abundância registrado no período vegetativo. O Índice de Morisita identificou três grupamentos indicando uma similaridade relacionada às fases da cultura, plântula, vegetativo e, na pós-colheita. Isso se deve à grande quantidade de morfoespécies compartilhadas entre as subáreas em cada fase. As maiores diferenças ocorrem no período reprodutivo, possivelmente devido a grande diferença entre a riqueza da subárea NR em relação à R. / Irrigated rice fields are ideal environments for generating high biodiversity, since they are surrounded by aquatic and terrestrial habitats. Pest insects occur in areas of rice production throughout the world, principally in irrigated plantation systems and in floodplains, which present temperature and humidity levels that favor their proliferation. Among the natural enemies that act upon populations of pest insects in rice fields, parasitoids are especially notable. To better understand the space-time dynamics of these insects, the objectives of this study were to describe and compare groups of parasitoids in irrigated rice field, with organic management using two different systems of leeves vegetation management, and relate them to the phenological stages of rice cultivation (seedling, vegetative, and reproductive) and in postharvest. The samples were taken in a plantation located on the “Filhos de Sepé” settlement in Águas Claras district, Viamão, RS. The total area of 18 ha was divided into two parts, a no-cut (NC) subarea and a cut (C) subarea. In the NC subarea, the spontaneous vegetation of the leeves was maintained, while in the C subarea, monthly cuts were made in the leeves vegetation, from the beginning of soil preparation until the harvest. In each subarea, four Malaise traps were installed. Collections occurred from the beginning of cultivation, at the end of October 2012, until harvest, in March 2013, twice a month. The traps remained assembled in the field for 24 hours at each sampling. A total of 3,184 Hymenoptera parasitoids were collected: 2,038 individuals in NC and 1,146 in C. We identified 488 morphospecies, distributed in 24 families. Mymaridae was the most abundant family and Eulophidae was the richest in both subareas. The rarefaction curve, plotting the number of morphospecies registered in relation to the number of individuals collected, indicates that NC possesses a greater richness than C. Of the identified morphospecies, 198 were overlaped between the subareas, while 203 were exclusive to NC and 57 to C. The families with the largest number of shared species were Platygastridae, Eulophidae e Mymaridae. The richness and abundance of parasitoids varied according to the phenological states of development, with the peak abundance registering in the vegetative period. The Morisita index identified three groupings, indicating a similarity relative to the three phases of rice growth and development: seedling, vegetative, and post-harvest. This is due to the large quantity of morphospecies overlaped between the subareas in each phase. The greatest differences occurred during the reproductive period, possibly due to the large difference between the richness of NC in relation to C.

ERO são produzidas continuamente por organismos aeróbicos. Em situações de estresse, a produção de ERO é aumentada, podendo causar a morte celular. Para manter uma concentração ideal de ERO dentro da célula, as plantas desenvolveram um complexo sistema antioxidante para proteção das membranas celulares e organelas contra os efeitos danosos causados pela ação dessas ERO sobre os tecidos vegetais. A ascorbato peroxidase (APx) é uma das principais enzimas do sistema de detoxificação de ERO nas plantas, catalisando a conversão do peróxido de hidrogênio em água, usando o ascorbato como doador de elétrons. No arroz, oito genes codificam APx. As diferentes isoformas são classificadas de acordo com a localização subcelular em citosólicas (APx1 e APx2), peroxissomais (APx3 e APx4), mitocondriais (APx5 e APx6) e cloroplastídicas (APx7 e APx8). O desenvolvimento do presente trabalho teve como objetivo geral caracterizar funcionalmente os genes de APx em arroz (Oryza sativa) com o intuito de identificar a função dos diferentes membros dessa família no controle dos níveis de ERO na planta. Foi analisado o padrão de expressão dos genes que codificam as diferentes isoformas de APx em arroz cultivado sob condições de estresses abióticos tais como o tratamento com concentrações tóxicas de alumínio, frio, seca e exposição ao peróxido de hidrogênio exógeno. Utilizando a estratégia de silenciamento por RNA de interferência (RNAi), foram produzidas construções para o silenciamento simultâneo dos genes OsAPx5 e OsAPx6 e, também, para os genes OsAPx7 e OsAPx8. Adicionalmente, foram ainda geradas construções gênicas para o silenciamento individual dos genes OsAPx7 e OsAPx8. Linhagens de arroz contendo construções RNAi para o silenciamento individual de OsAPx7 e OsAPx8 apresentaram redução de cerca de 90% na expressão relativa destes genes quando comparadas com plantas nãotransformadas. Os oito membros da família gênica APx em arroz mostraram padrão de expressão diferencial frente às condições de estresse testadas, indicando um complexo modo de regulação desses genes. / Aerobic organisms continuously produce Reactive Oxygen Species (ROS). Under stress conditions ROS production is increased and can lead to cellular death. To keep the ideal concentration of ROS inside the cells, plants developed a complex antioxidant system to protect cellular membranes and organelles against harmful effects produced by the action of these ROS. Ascorbate peroxidase (APx) is a major enzyme of the ROS detoxification system in plants, catalyzing the conversion of hydrogen peroxide into water using ascorbate as electron donor. In rice (Oryza sativa), eight genes encode APx. The different isoforms are classified according to their subcellular localization in cytosolic (APx1 and APx2), peroxisomal (APx3 and APx4), mitochondrial (APx5 and APx6) or chloroplastidic (APx7 and APx8). The general aim when developing the present work was to functionally characterize the APx genes in rice in order to identify the function of different members of this family in the control of ROS levels in the plant cell. The expression pattern of genes encoding different isoforms of APx in rice was analyzed when plants were grown under abiotic stress conditions such as under the treatment with toxic concentrations of aluminum, cold, drought and exposition to exogenous hydrogen peroxide. Using the strategy of gene silencing by interference RNA (RNAi), were produced RNAi constructs to simultaneously silence the OsAPx5 and OsAPx6 genes, and also the OsAPx7 and OsAPx8 genes. In addition, it was produced constructs to individually silence the OsAPx7 and OsAPx8 genes. Rice lines carrying RNAi to silence OsAPx7 and OsAPx8 individually presented reduction of gene expression of about 90% when compared to the expression assayed in non-transformed plants. The eight genes coding APx presented different expression patterns in response to the stress conditions tested, indicating that these genes are under a complex mode of regulation.