京都大学 / 0048 / 新制・論文博士 / 博士(医学) / 乙第13068号 / 論医博第2123号 / 新制||医||1019(附属図書館) / 33219 / 京都大学大学院医学研究科医学専攻 / (主査)教授 妻木 範行, 教授 開 祐司, 教授 戸口田 淳也 / 学位規則第4条第2項該当 / Doctor of Medical Science / Kyoto University / DFAM

Os estudos na área de engenharia de tecidos aplicada à reparação da cartilagem articular estão voltados ao desenvolvimento de uma matriz biocompatível que permita a diferenciação, proliferação e manutenção de células para produção de cartilagem hialina. A quitosana é um biomaterial e vem sendo estudada como suporte para condrócitos e para liberação controlada de substâncias. O objetivo deste trabalho foi estudar a biocompatibilidade do gel de quitosana associada ao fosfato de glicerol para reparação de defeitos osteocondrais induzidos experimentalmente na tróclea do talus de eqüinos. Foram utilizados cinco cavalos da raça Mangalarga, de três anos de idade, e por artroscopia foi criado um defeito osteocondral na tróclea lateral do talus de cada articulação. De forma aleatória um defeito foi escolhido para implante do gel de quitosana - fosfato de glicerol, e o defeito da articulação contralateral foi mantido vazio, servindo como controle. Para acompanhamento da evolução do processo de reparação da cartilagem articular foram realizados os exames físico, radiográfico e ultrassonográfico; análise do líquido sinovial (física, celularidade, quantificação de proteína, condroitim sulfato e ácido hialurônico); e análise da cartilagem articular (histológica e produção de proteoglicanos). Os resultados obtidos de todas as avaliações realizadas foram semelhantes entre os defeitos tratados e controle. O gel de quitosana fosfato de glicerol é biocompatível com o ambiente articular e pode ser indicado para futuras aplicações como suporte de células e para liberação controlada de medicamentos. / The tissue engineering studies applied to articular cartilage repair are focused on the development of scaffold biocompatibility allowing the differentiation, proliferation and cells maintenance providing production of the hyaline cartilage. Chitosan is a biomaterial that has been evaluated as a scaffold for chondrocyts implant and also as a drug-delivery control material. The aim of this work was to evaluate the chitosan glycerol phosphate gel biocompatibility in experimentally induced equine talus osteochondral defect. Five three years old Mangalarga breed horses were submitted to arthroscopy for osteochondral defect production on the lateral troclea of the talus in both tibiotarsal joints by arthroscopy. In a random form one defect was chosen for chitosan-glycerol phosphate gel implant, and the defect of the opposed joint was kept empty and used as a control. For the assessment of the articular cartilage repair process was performed the physic, radiographic and ultrassonographic exams; the synovial fluid analyze (physic, cellularity, protein quantification, chondroitin sulphate and hialuronan); and the articular cartilage analyze (hystologic and proteoglicans production). The results obtained in all evaluations performed were similar between the treated and control defects. The chitosan glycerol phosphate gel is biocompatible with the articular environment and can be indicate for future applications as an scaffold for cells support and drug-delivery control system.

Os estudos na área de engenharia de tecidos aplicada à reparação da cartilagem articular estão voltados ao desenvolvimento de uma matriz biocompatível que permita a diferenciação, proliferação e manutenção de células para produção de cartilagem hialina. A quitosana é um biomaterial e vem sendo estudada como suporte para condrócitos e para liberação controlada de substâncias. O objetivo deste trabalho foi estudar a biocompatibilidade do gel de quitosana associada ao fosfato de glicerol para reparação de defeitos osteocondrais induzidos experimentalmente na tróclea do talus de eqüinos. Foram utilizados cinco cavalos da raça Mangalarga, de três anos de idade, e por artroscopia foi criado um defeito osteocondral na tróclea lateral do talus de cada articulação. De forma aleatória um defeito foi escolhido para implante do gel de quitosana - fosfato de glicerol, e o defeito da articulação contralateral foi mantido vazio, servindo como controle. Para acompanhamento da evolução do processo de reparação da cartilagem articular foram realizados os exames físico, radiográfico e ultrassonográfico; análise do líquido sinovial (física, celularidade, quantificação de proteína, condroitim sulfato e ácido hialurônico); e análise da cartilagem articular (histológica e produção de proteoglicanos). Os resultados obtidos de todas as avaliações realizadas foram semelhantes entre os defeitos tratados e controle. O gel de quitosana fosfato de glicerol é biocompatível com o ambiente articular e pode ser indicado para futuras aplicações como suporte de células e para liberação controlada de medicamentos. / The tissue engineering studies applied to articular cartilage repair are focused on the development of scaffold biocompatibility allowing the differentiation, proliferation and cells maintenance providing production of the hyaline cartilage. Chitosan is a biomaterial that has been evaluated as a scaffold for chondrocyts implant and also as a drug-delivery control material. The aim of this work was to evaluate the chitosan glycerol phosphate gel biocompatibility in experimentally induced equine talus osteochondral defect. Five three years old Mangalarga breed horses were submitted to arthroscopy for osteochondral defect production on the lateral troclea of the talus in both tibiotarsal joints by arthroscopy. In a random form one defect was chosen for chitosan-glycerol phosphate gel implant, and the defect of the opposed joint was kept empty and used as a control. For the assessment of the articular cartilage repair process was performed the physic, radiographic and ultrassonographic exams; the synovial fluid analyze (physic, cellularity, protein quantification, chondroitin sulphate and hialuronan); and the articular cartilage analyze (hystologic and proteoglicans production). The results obtained in all evaluations performed were similar between the treated and control defects. The chitosan glycerol phosphate gel is biocompatible with the articular environment and can be indicate for future applications as an scaffold for cells support and drug-delivery control system.

Le cartilage est un tissu clé des articulations synoviales. Suite à un problème mécanique, traumatique ou inflammatoire, le cartilage est dégradé entrainant des douleurs articulaires et une perte de mobilité. Le cartilage étant un tissu non innervé et non vascularisé, son auto-réparation est très faible. De plus en plus de techniques sont développées pour la réparation des défauts cartilagineux mais aucune n’a encore permis d’obtenir un nouveau cartilage pleinement fonctionnel. En particulier, l’ingénierie tissulaire (IT) est une technique très prometteuse qui consiste à obtenir un greffon de cartilage dont les propriétés mécaniques et structurales soient satisfaisantes une fois implantée dans l’articulation. L’IT est basée sur l’association de cellules, d’un biomatériau et de facteurs de croissance. Le but de cette thèse est d’étudier l’effet de l’âge du donneur des cellules sur la synthèse du greffon par l’IT in vitro et sur la qualité du cartilage obtenu lors de l’implantation dans un modèle de rat NUDE. Puis dans une dernière partie, l’impact de l’environnement chimique et mécanique est étudié sur la qualité du greffon. Nos études montrent ainsi que l’âge du donneur aussi bien dans un contexte in vitro ou in vivo impacte la qualité du greffon et la réparation une fois implanté dans l’animal. En effet, les greffons issus des donneurs âgés ont des propriétés mécaniques légèrement plus élevées et une synthèse des protéines de la matrice extracellulaire (MEC) du cartilage significativement plus élevée que les greffons issus de donneurs jeunes. De plus, la réponse inflammatoire des greffons implantés dans un défaut cartilagineux chez le rat NUDE est plus faible pour les donneurs âgés. Enfin, nous montrons que le microenvironnement mécanique (compression ou pression hydrostatique) et chimique (liquide synovial (LS) ou TGF-β pur) joue un rôle important sur la réponse cellulaire. Par ailleurs, en fonction de l’âge, l’association de ces différents facteurs donnent des résultats différents. Par exemple, pour une sollicitation de type compression, c’est le LS qui est à favoriser pour obtenir les greffons de meilleure qualité dans le cas des donneurs âgés. Au contraire, pour la même sollicitation de type compression, c’est la présence de TGF-β1 qui conduit au greffon de meilleure qualité pour les donneurs jeunes. Ces études mettent en évidence l’importance de l’âge du donneur et montrent de plus qu’un protocole IT patient spécifique est la meilleure solution. / Cartilage is an important tissue of synovial joints. Following a mechanical problem, traumatic or inflammatory, the cartilage is degraded causing joint pain and loss of mobility. Because cartilage is a non-innervated and non-vascularized tissue, its self-repair is very weak. More and more techniques are being developed for the cartilage but none has resulted in a new fully functional cartilage. In particular, tissue engineering (TE) is a very promising technique that consists in obtaining a cartilage graft whose mechanical and structural properties are satisfactory once implanted in the joint. TE is based on the association of cells, biomaterial and growth factors. The aim of this thesis is to study the effect of cell donor’s age on graft synthesis by TE in vitro and on the quality of the cartilage obtained during implantation in a NUDE rat model. Then in a last part, the impact of the chemical and mechanical environment is studied on the quality of the graft. Our studies show that the age of the donor both in vitro and in vivo has an impact on graft quality and repair once implanted in the animal. In fact, grafts from older donors have slightly higher mechanical properties and significantly higher synthesis of extracellular matrix proteins (ECM) than grafts from younger donors. In addition, the inflammatory response of grafts implanted in a cartilage defect in the NUDE rat is lower for older donors. Finally, we show that the mechanical microenvironment (compression or hydrostatic pressure) and chemical microenvironment (synovial fluid (SF) or TGF-β) play an important role in the cellular response. Moreover, depending on age, the combination of these different factors gives different results. For example, for a compression solicitation, it is the SF that is to be favored to obtain better quality grafts in the case of elderly donors. On the contrary, for the same compression stress, it is the presence of TGF-β1 that leads to the best quality graft for young donors. These studies highlight the importance of donor age and further show that a specific patient protocol of TE is the best solution.

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A cartilagem articular é um tema amplamente discutido na literatura por meio de vários estudos e pesquisas. Com o presente estudo, busca-se uma proposta inovadora e original no uso de um biomaterial composto e o desenvolvimento de uma cartilagem artificial que aja como coxim elástico, apresentando características de gel fibro-reforçado com finalidade biomimética mecânica que imite o comportamento da cartilagem articular. Foi conceituado um implante que tivesse uma superfície tribológica para contato com a cartilagem do platô tibial e gradualmente se convertesse em região osteo-integrável para fixação mecânica no osso subcondral. Foi desenvolvido um biomaterial composto por poliuretano e microfibra de biovidro 45S5 em gradiente funcional que foi obtido e validado através de ensaios in vitro, microscopia eletrônica de varredura e análise histológica. Nos testes in vitro seja na condição de citotoxicidade direta ou indireta, notou-se que a quantidade de células foi estatisticamente semelhante ao controle negativo, e estatisticamente diferente do controle positivo indicando que o biomaterial composto de poliuretano e microfibra de biovidro 45S5 apresentou não toxicidade direta ou indireta da amostra e ainda promoveram o crescimento e o espalhamento celular, resultados que o habilitaram para a continuidade nos estudos com experimentos in vivo com coelhos. O material foi manufaturado para aplicação em defeitos osteocondrais de coelhos medindo 3mm de diâmetro e 4mm de profundidade que foi realizado na região central da tróclea femoral. Após períodos experimentais de 15, 30 e 90 dias as análises de microscopia eletrônica de varredura mostrou na região distal da superfície tribológica uma neo-formação de uma estrutura semelhante as trabéculas ósseas que foi considerada biomimética confirmadas por análises histológicas, e na região proximal à superfície tribológica a presença de tecido fibrocartilaginoso com condrócitos e ricamente vascularizado, validando com sucesso o conceito proposto para o implante. / Articular cartilage has been widely discussed in the literature by means of several studies and researches. The present thesis reports on an innovative and original proposal to use a biomaterial compound and the development of an artificial cartilage that acts as a cushion rubber with characteristics of fiber-reinforced gel with biomimetic mechanical purpose mimicking the behavior of articular cartilage. An implant with a tribological surface for contact with the cartilage of the tibial plateau was designed. It should gradually turn into an osteo-integrable region for mechanical fixation in the subchondral bone. A biomaterial composed of polyurethane and bioglass microfiber in functional gradient was then developed and validated by scanning electron microscopy and histological analysis through in vitro tests. Under either direct or indirect cytotoxicity conditions, the tests showed that the amount of cells is statistically similar to negative control and statistically different from the positive control, indicating that the biomaterial composed of polyurethane and bioglass microfiber showed no direct or indirect toxicity and promoted cell growth and spreading. Such results allowed continuing the studies with in vivo experiments with rabbits. The material was manufactured for use in 3mm diameter and 4mm depth osteochondral defects in the central region of the femoral trochlea of rabbits. After experimental periods of 15, 30 and 90 days, the scanning electron microscopy analysis showed a neo-formation of a structure similar to trabecular bones on the tribological surface in the distal region. This neo-formation was considered biomimetic, confirmed by both histological analysis and the presence of richly vascularized fibrocartilaginous tissues with chondrocytes in the region proximal to the tribological surface.

A cartilagem articular é um tema amplamente discutido na literatura por meio de vários estudos e pesquisas. Com o presente estudo, busca-se uma proposta inovadora e original no uso de um biomaterial composto e o desenvolvimento de uma cartilagem artificial que aja como coxim elástico, apresentando características de gel fibro-reforçado com finalidade biomimética mecânica que imite o comportamento da cartilagem articular. Foi conceituado um implante que tivesse uma superfície tribológica para contato com a cartilagem do platô tibial e gradualmente se convertesse em região osteo-integrável para fixação mecânica no osso subcondral. Foi desenvolvido um biomaterial composto por poliuretano e microfibra de biovidro 45S5 em gradiente funcional que foi obtido e validado através de ensaios in vitro, microscopia eletrônica de varredura e análise histológica. Nos testes in vitro seja na condição de citotoxicidade direta ou indireta, notou-se que a quantidade de células foi estatisticamente semelhante ao controle negativo, e estatisticamente diferente do controle positivo indicando que o biomaterial composto de poliuretano e microfibra de biovidro 45S5 apresentou não toxicidade direta ou indireta da amostra e ainda promoveram o crescimento e o espalhamento celular, resultados que o habilitaram para a continuidade nos estudos com experimentos in vivo com coelhos. O material foi manufaturado para aplicação em defeitos osteocondrais de coelhos medindo 3mm de diâmetro e 4mm de profundidade que foi realizado na região central da tróclea femoral. Após períodos experimentais de 15, 30 e 90 dias as análises de microscopia eletrônica de varredura mostrou na região distal da superfície tribológica uma neo-formação de uma estrutura semelhante as trabéculas ósseas que foi considerada biomimética confirmadas por análises histológicas, e na região proximal à superfície tribológica a presença de tecido fibrocartilaginoso com condrócitos e ricamente vascularizado, validando com sucesso o conceito proposto para o implante. / Articular cartilage has been widely discussed in the literature by means of several studies and researches. The present thesis reports on an innovative and original proposal to use a biomaterial compound and the development of an artificial cartilage that acts as a cushion rubber with characteristics of fiber-reinforced gel with biomimetic mechanical purpose mimicking the behavior of articular cartilage. An implant with a tribological surface for contact with the cartilage of the tibial plateau was designed. It should gradually turn into an osteo-integrable region for mechanical fixation in the subchondral bone. A biomaterial composed of polyurethane and bioglass microfiber in functional gradient was then developed and validated by scanning electron microscopy and histological analysis through in vitro tests. Under either direct or indirect cytotoxicity conditions, the tests showed that the amount of cells is statistically similar to negative control and statistically different from the positive control, indicating that the biomaterial composed of polyurethane and bioglass microfiber showed no direct or indirect toxicity and promoted cell growth and spreading. Such results allowed continuing the studies with in vivo experiments with rabbits. The material was manufactured for use in 3mm diameter and 4mm depth osteochondral defects in the central region of the femoral trochlea of rabbits. After experimental periods of 15, 30 and 90 days, the scanning electron microscopy analysis showed a neo-formation of a structure similar to trabecular bones on the tribological surface in the distal region. This neo-formation was considered biomimetic, confirmed by both histological analysis and the presence of richly vascularized fibrocartilaginous tissues with chondrocytes in the region proximal to the tribological surface.