Das RANKL/RANK/OPG-System spielt eine entscheidende Rolle in der Steuerung der Osteoklastendifferenzierung und -aktivierung durch Osteoblasten/ Knochenmarkbindegewebszellen im Rahmen des Knochenremodelings. Osteoblasten/Knochenmarkbindegewebszellen exprimieren RANKL. Dieses hat im Körper zwei Rezeptoren: RANK und OPG. RANKL kann durch Bindung an RANK auf Osteoklasten/Osteoklastenvorläuferzellen in Gegenwart von M-CSF seine osteoklastenstimulierende Wirkung entfalten. Der ebenfalls von Osteoblasten gebildete „decoy“-Rezeptor OPG blockiert als freies Protein durch Bindung an RANKL dessen Interaktion mit RANK und verhindert somit die Osteoklastogenese und Osteoklastenaktivierung. Das RANKL/RANK/OPG-System erfüllt im Körper noch weitere Funktionen im Immunsystem, in der Organentwicklung lymphatischer Gewebe und in der Entwicklung der laktierenden Brustdrüse. Viele Zytokine greifen hemmend oder aktivierend in die Osteoklastogenese ein. Sie können dies zum einen durch die Beeinflussung des RANKL/OPG-Verhältnisses, zum anderen durch direkte Interaktion mit Osteoklasten/Osteoklastenvorläuferzellen tun. Zytokine, die die Osteoklastogenese begünstigen, werden vor allem bei inflammatorischen Prozessen ausgeschüttet. Zusammen mit dem, bei diesen Zuständen von aktivierten T-Zellen produzierten RANKL kann dies längerfristig zu einem Knochenverlust führen, welcher sich im klinischen Bild der Osteoporose äußert. Aus den in der vorliegenden Dissertation durchgeführten Untersuchungen ergeben sich folgende Schlussfolgerungen: 1. Monozyten der Zelllinie RAW 264.7 lassen sich, wie bereits in der Literatur beschrieben, durch Zugabe von M-CSF und RANKL zu osteoklastenähnlichen Zellen differenzieren. 2. Die Osteoklastogenese lässt sich anhand der Veränderung verschiedener osteoklastenspezifischer Parameter charakterisieren. Es zeigt sich bei den mit M-CSF und RANKL stimulierten Monozyten eine erhöhte Transkription von CTR (Calcitoninrezeptor)- und TRAP (tartratresistente saure Phosphatase)-mRNA, eine erhöhte Expression des CTR-Proteins, eine erhöhte TRAP-Aktivität und eine Formierung TRAP-positiver mehrkerniger Riesenzellen, die in diesen Eigenschaften Osteoklasten entsprechen. Die zusätzliche Zugabe von TGF-b1 in Kombination mit M-CSF und RANKL resultiert in einer verstärkten Expression von CTR-mRNA und CTR-Protein. TRAP-mRNA-Expression und TRAP-Aktivität bleiben davon unbeeinflusst. 3. Als funktionelles Merkmal der in vitro differenzierten Osteoklasten können ihre Fähigkeit zur Ausbildung von Aktinringen und die Resorption von mineralisiertem Kollagen nachgewiesen werden. 4. Im Verlauf ihrer Differenzierung sekretieren Osteoblasten unterschiedliche Mengen an OPG. Das Maximum der Synthese liegt bei Tag 11. Freies RANKL lässt sich in Überständen von MC3T3-E1-Osteoblasten nicht nachweisen. 5. Das von Osteoblasten in das Medium abgegebene OPG ist in der Lage, die durch RANKL induzierte Osteoklastogenese von RAW-Monozyten zu hemmen. 6. In Kokulturen von MC3T3-E1-Osteoblasten und RAW-Monozyten kann keine Osteoklastogenese beobachtet werden, wahrscheinlich durch Fehlen der RANKLExprimierung oder zu starke OPG-Sekretion durch Osteoblasten. Besonders in der westlichen Welt mit ihrer hohen Lebenserwartung haben Krankheiten mit Knochenverlust sowie bösartige Neubildungen mit Knochenbefall eine große medizinische Bedeutung. Die Beeinflussung des RANKL/RANK/OPG-Systems bietet eine vielversprechende Möglichkeit zur Entwicklung hochwirksamer und nebenwirkungsarmer Medikamente zur Behandlung dieser Zustände.

In T cells, processes such as migration and immunological synapse formation are accompanied by the dynamic reorganization of the actin cytoskeleton, which has been suggested to be mediated by regulators of RhoGTPases and by F-actin bundlers. SWAP-70 controls F-actin dynamics in various immune cells, but its role in T cell development and function has remained incompletely understood. CD4+ regulatory T (Treg) cells expressing the transcription factor Foxp3 employ diverse mechanisms to suppress innate and adaptive immunity, which is critical for maintaining immune homeostasis and self-tolerance. Here, we propose Swap-70 as a novel member of the Foxp3-dependent canonical Treg cell signature. We show that Swap-70-/- mice have increased numbers of Foxp3+ Treg cells with an effector/memory-like phenotype that exhibit impaired suppressor function in vitro, but maintain overall immune homeostasis in vivo. Upon formation of an immunological synapse with antigen presenting cells in vitro, cytosolic SWAP-70 protein is selectively recruited to the interface in Treg cells. In this context, Swap-70-/- Treg cells fail to downregulate CD80/CD86 on osteoclast precursor cells by trans-endocytosis and to efficiently suppress osteoclastogenesis and osteoclast function. These data provide first evidence for a crucial role of SWAP-70 in Treg cell biology and further highlight the important non-immune function of Foxp3+ Treg cells in bone homeostasis mediated through direct SWAP-70-dependent mechanisms.

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Early events during axolotl limb regeneration include an immune response and the formation of a wound epithelium. These events are linked to a clearance of damaged tissue prior to blastema formation and regeneration of the missing structures. Here, we report the resorption of calcified skeletal tissue as an active, cell-driven, and highly regulated event. This process, carried out by osteoclasts, is essential for a successful integration of the newly formed skeleton. Indeed, the extent of resorption is directly correlated with the integration efficiency, and treatment with zoledronic acid resulted in osteoclast function inhibition and failed tissue integration. Moreover, we identified the wound epithelium as a regulator of skeletal resorption, likely releasing signals involved in recruitment/differentiation of osteoclasts. Finally, we reported a correlation between resorption and blastema formation, particularly, a coordination of resorption with cartilage condensation. In sum, our results identify resorption as a major event upon amputation, playing a critical role in the overall process of skeletal regeneration.

Im Verlauf der Knochenbildung und Frakturheilung kommt es zu einem Zusammenwirken verschiedener Zell- und Gewebearten. Die beteiligten Zellen unterliegen dabei der Regulation von Wachstumsfaktoren (WF), Zytokinen und Hormonen, die den regelhaften Ablauf kontrollieren und steuernd in Proliferation und Differenzierung von Zellen und deren Matrixsynthese eingreifen. Neben einer optimalen Osteosynthese zur Frakturstabilisation stellt die biologische Beeinflussung der Knochenheilung ein großes Forschungsfeld dar. In Vorarbeiten wurde ein Applikationssystem entwickelt, das mittels einer biodegradierbaren Polymerbeschichtung auf Osteosynthesematerialien die lokale Applikation von WF in biologisch aktiver Form ermöglicht. In vivo wurde an Ratten- und Schweinemodellen erfolgreich die Stimulation der Knochenheilung durch lokal applizierte Wachstumsfaktoren IGF-I, TGF-ß1 und BMP-2 gezeigt. Ziel dieser Arbeit war die Untersuchung zellulärer Prozesse während der beeinflussten und unbeeinflussten Knochenheilung sowie des Effektes der lokalen Applikation von Wachstumsfaktoren von beschichteten Osteosyntheseplatten. Anhand histologischer und immunhistochemischer Untersuchungen, der in situ Hybridisierung an Knochenschnitten und der ELISA-Methode konnte ein früherer Reifungsbeginn des Kallus durch die Wachstumsfaktorenapplikation gezeigt werden, ohne dass es zu Veränderungen der physiologischen Gewebszusammensetzung und der endogenen Wachstumsfaktoren-Expression kam. Durch Zellkulturstudien an primären Osteoblasten und Osteoklasten wurde an isolierten Zelltypen die Wirkung der applizierten WF untersucht und ihr Effekt auf die Zelltypen dargestellt. Die Bildung ektoper Ossifikation im Weichgewebe durch die Wachstumsfaktoren wurde im Schafsmodell ausgeschlossen. Dies stellt einen wichtigen Sicherheitsaspekt beim Einsatz von Wachstumsfaktoren zur Stimulation der Knochenheilung dar. Die lokale Applikation der Wachstumsfaktoren von einer Plattenosteosynthese zur Osteotomiestabilsierung im Rattenmodell zeigte eine signifikante Verbesserung der biomechanischen Stabilität und der Kallusheilung 42 Tage nach Osteotomie Die aus diesen Studien gewonnenen Erkenntnisse liefern Aufschluss zur Weiterentwicklung biologischer Einflussmöglichkeiten auf den Knochenstoffwechsel und die Rolle von WF während der Frakturheilung. / In the process of bone formation and healing, different cell- and tissue types are formed. The cells involved are regulated by growth factors (GF), cytokines and hormones, which control the healing and affect the proliferation and differentiation of cells and their matrix synthesis. Besides the use of the optimal osteosynthesis for fracture stabilization, the biological influence of the bone healing represents a large research field. In previous work an application system for local application of GF in biologically active form was developed. In vivo studies revealed a stimulating effect of locally applied IGF-I and TGF-ß1 in a rat and a pig model. Goal of this work was the investigation of cellular processes during the influenced and uninfluenced bone healing. A further aim was the transfer of the local application method to further stabilization systems (plate osteosynthesis). On the basis of the histology, the immunohistology, in situ hybridizing and ELISA methods an earlier beginning of maturing of the callus by the growth factors could be shown, without changes of the physiological callus composition and the endogenous growth factors expression. In further cell culture studies on primary osteoblasts and osteoclasts the effect of the applied growth factors was examined and their effect on the cell types analyzed. The avoidance of ectopic ossification, an important safety aspect with the use of growth factors to stimulate bone healing, was investigated in a sheep model. It was also possible to proof the efficacy of locally applied growth factors delivered extramedullary from plates. The results of these studies provide further explanations for the action of the used growth factors and are necessary for the ongoing development of the application of growth factors for a clinical use.