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Die mitochondriale Entkopplung ist ein effektiver Weg, um die Thermogenese und basale metabolische Rate einer Zelle anzuheben. Im Versuchsaufbau mit malignen Zellen führte dies zu einer Apoptose. 2,4-DNP als spezifischer Entkoppler der Atmungskette zeigte in diesem Zusammenhang mittels LDH-Analysen an HACAT-, PA1-, BT20 und MDA-MB 231- Zellen eine dosisabhängige Wirkung auf die Zellproliferation in allen verwendeten Zelllinien, unter den verwendeten Tumorzellen am eindrucksvollsten bei den Ovarialkarzinom Zellen. Allen Zellarten gemeinsam war dabei eine Wachstumshemmung abhängig von der Länge der Inkubationszeit. Die mikrokalorimetrischen Analysen wurden an HACAT-, BT20- und MDA-MB 231- Zellen durchgeführt. Eine höhere 2,4-DNP-Konzentration führte dabei ebenfalls zu einer gesteigerten Wärmefreisetzung, wobei eine positive Korrelation zwischen Einwirkdauer und Wärmefreisetzung bestand. Eine signifikante Zytotoxizität ließ sich bei hohen DNP-Konzentrationen und bei langer Inkubationszeit in den PA1- und MDA-MB 231- Zelllinien nachweisen. MDA-MB 231- Zellen reagierten dabei besonders sensibel. In der aktuellen Tumortherapie bietet die Kombination von Alterationen der mitochondrialen und glykolytischen Abläufen neben den gängigen Behandlungsoptionen einen vielversprechenden Therapieansatz (8, 28). Durch den Einsatz von mitochondrialen Entkopplern als Ergänzung zu den herkömmlichen Therapieschemata könnte effektiv in den metabolischen Stoffwechsel der Zellen eingegriffen und neben der Tumorzellproliferation auch die Regression positiv beeinflusst werden. Das Ziel wäre, eine kontrollierte Apoptose bei möglichst wenigen systemischen Nebenwirkungen auszulösen. Hierzu werden im Rahmen der optimalen Dosisfindung für den Einsatz von 2,4-DNP jedoch weitere Versuchsansätze mit Inkubationszeiten von mindestens 48h benötigt. / Mitochondrial uncoupling is an effective way to raise the thermogenesis and basal metabolic rate of a cell. In the experimental setup with malignant cells, this led to apoptosis. In this context 2,4-DNP as a specific uncoupler of the respiratory chain showed a dose-dependent effect on cell proliferation in all cell lines used by means of LDH analyses on HACAT, PA1, BT20 and MDA-MB 231 cells. Among the used tumor cells this effect was most impressively documented in ovarian carcinoma cells. Common to all cell types was a growth inhibition dependent on the length of the incubation period. Microcalorimetric analyses were performed on HACAT, BT20, and MDA-MB 231 cells. A higher 2,4-DNP concentration also resulted in increased heat release, with a positive correlation between exposure time and heat release. Significant cytotoxicity was detected at high DNP concentrations and with long incubation times in the PA1 and MDA-MB 231 cell lines. MDA-MB 231 cells reacted particularly sensitively. In current tumor therapy, the combination of alterations of mitochondrial and glycolytic pathways offers a promising therapeutic approach in addition to current treatment options (8, 28). The use of mitochondrial uncouplers as an adjunct to conventional therapeutic regimens could effectively interfere with cell metabolism and positively influence regression in addition to tumor cell proliferation. The goal would be to induce controlled apoptosis with as few systemic side effects as possible. For this, however, further experimental approaches with incubation times of at least 48h are needed in the context of optimal dose finding for the use of 2,4-DNP.

Die Sepsis stellt auch heute noch eine der führenden Ursachen für die Mortalität und Morbidität bei Früh- und Neugeborenen dar. Die Entwicklung neuer diagnostischer oder therapeutischer Maßnahmen erfordert ein kontinuierliches Bestreben die Pathophysiologie der Neonatalen Sepsis zu verstehen. Diese Arbeit widmete sich der Untersuchung des Immunzellmetabolismus mittels Sehorse Mito-/ Glycolysis Stress Test und Western Blot. Es zeigte sich, dass die beiden zentralen Stoffwechselprozesse oxidative Phosphorylierung und Glukosemetabolismus in peripheren mononukleären Zellen aus dem Nabelschnurblut (CBMCs) – verglichen zu adulten Zellen (PBMCs) – im Ruhezustand signifikant herabgesetzt ist. Die Stimulation der Toll-like-Rezeptoren TLR 4 und 7/8 führte zur Steigerung des Glukosemetabolismus und bewies eine grundsätzliche Steigbarkeit des Metabolismus im Rahmen der Aktivierung der Immunantwort. Des Weiteren induzierte eine erhöhte Arginin-Konzentration in CBMCs im Rahmen eines in-vitro-Sepsis-Modells unter LPS-Stimulation ebenfalls eine signifikante Steigerung des Glukosemetabolismus. Dieses Ergebnis unterstreicht die immunmodulatorische Funktion der semi-essenziellen Aminosäure. Dahingegen zeigte sich kein Einfluss der Arginase-exprimierenden Myeloiden Suppressorzellen auf den Immunmetabolismus der CBMCs, wobei ihre funktionelle Heterogenität eine attraktive Basis für weitere Investigationen in Zusammenhang mit der neonatalen Sepsis bietet. Für die unverändert signifikant erniedrigte mitochondriale Oxidation in CBMCs wurde das deutlich herabgesetzte Expressionsniveau der ATP-Synthase als eine mögliche Ursache diskutiert. Zusammenfassend zeigte sich ein verminderter Metabolismus der CBMCs im Ruhezustand der Zellen, jedoch unter der TLR-Stimulation und somit bestimmten immunologischen Vorgängen wie Sepsis, sowie Erhöhung von Substraten wie Arginin eine Erhöhung der zellulären Stoffwechselvorgänge. Zukünftig könnten diese Ergebnisse beispielsweise ein Baustein bei der Investigation immunmodulatorischer Therapieansätze darstellen und unterstreichen die Relevanz für die Pathophysiologie der neonatalen Sepsis. / Sepsis is still one of the leading causes of mortality and morbidity in premature and newborn babies. The development of new diagnostic or therapeutic measures requires a continuous effort to understand the pathophysiology of neonatal sepsis. This work was devoted to the investigation of immune cell metabolism using Sehorse Mito- /Glycolysis Stress Test and Western Blot. It was shown that the two central metabolic processes - oxidative phosphorylation and glucose metabolism in peripheral cord blood mononuclear cells (CBMCs) are significantly reduced in the resting state, compared to adult cells (PBMCs). Stimulation of the Toll-like receptors TLR 4 and 7/8 led to an increase in glucose metabolism and demonstrated a fundamental increase in metabolism within the framework of activation of the immune response. Furthermore, increased arginine concentration in CBMCs also induced a significant increase in glucose metabolism in an in vitro sepsis model under LPS stimulation. This result underscores the immunomodulatory function of the semi-essential amino acid. On the other hand, there was no influence of arginase-expressing myeloid suppressor cells on the immune metabolism of CBMCs, still, their functional heterogeneity provides an attractive basis for further investigations in connection with neonatal sepsis and other cellular metabolic processes. None of the tested conditions demonstrated an increase in mitochondrial oxidation in CBMCs and the significantly reduced expression level of ATP synthase in these cells was discussed as a possible cause. In conclusion, CBMCs displayed a decreased metabolism in the resting state of the cells, but the stimulation of the TLR 4 and 7/8 and thus, certain immunological processes such as sepsis, as well as a higher concentration of substrates such as arginine, engage an increase in cellular metabolic processes. In the future, these results could be a building block in the investigation of immunomodulatory therapy approaches and underline the relevance of immunometabolism for the pathophysiology of neonatal sepsis.

Die oxidative Phosphorylierung (OXPHOS) spielt eine zentrale Rolle im Energiestoffwechsel der Zelle. Sie besteht aus der Atmungskette, deren vier Enzymkomplexe einen Protonengradienten über die innere mitochondriale Membran aufbauen, und der ATP-Synthase, die diesen Gradienten zur Phosphorylierung von ADP zu ATP, der zelluläre Energieeinheit, nutzt. In der vorliegenden Arbeit wurde ein thermodynamisch konformes OXPHOS Modell erstellt, welches auf Differentialgleichungen basiert. Dazu wurden Gleichungen entwickelt, welche die Kinetiken jedes OXPHOS-Komplexes über weite Bereiche von Substrat- und Produktkonzentrationen sowie unterschiedlichster Werte des elektrochemischen Gradientens wiedergeben. Zunächst wurden für jeden Komplex der Atmungskette kinetische Messungen in Abwesenheit des Protonengradientens durchgeführt. Für deren Beschreibung erwiesen sich Gleichungen vom Typ Michaelis-Menten als adäquat; hierbei wurden verschiedene Gleichungstypen verglichen. Anschließend wurde der Einfluss des Protonengradientens auf die kinetischen Parameter so modelliert, dass physiologisch sinnvolle Raten in dessen Abhängigkeit erzielt werden konnten. Diese neuen Ratengleichungen wurden schließlich in ein OXPHOS Modell integriert, mit dem sich experimentelle Daten von Sauerstoffverbrauch, elektrischem Potential und pH-Werten sehr gut beschreiben ließen. Weiter konnten Inhibitor-Titrationskurven reproduziert werden, welche den Sauerstoffverbrauch in Abhängigkeit der relativen Hemmung eines OXPHOS-Komplexes darstellen. Dies zeigt, dass lokale Effekte auf globaler Ebene korrekt wiedergeben werden können. Das hier erarbeitete Modell ist eine solide Basis, um die Rolle der OXPHOS und generell von Mitochondrien eingehend zu untersuchen. Diese werden mit zahlreichen zellulären Vorgängen in Verbindung gebracht: unter anderem mit Diabetes, Krebs und Mitochodriopathien, sowie der Bildung von Sauerstoffradikalen, die im Zusammenhang mit Alterungsprozessen stehen. / Oxidative phosphorylation (OXPHOS) plays a central role in the cellular energy metabolism. It comprises the respiratory chain, consisting of four enzyme complexes that establish a proton gradient over the inner mitochondrial membrane, and the ATP-synthase that uses this electrochemical gradient to phosphorylate ADP to ATP, the cellular energy unit. In this work a thermodynamically consistent OXPHOS model was built based on a set of differential equations. Therefore rate equations were developed that describe the kinetics of each OXPHOS complex over a wide concentration range of substrates and products as well for various values of the electrochemical gradient. In a first step, kinetic measurements on bovine heart submitochondrial particles have been performed in the absence of the proton gradient. An appropriate data description was achieved with Michaelis-Menten like equations; here several types of equations have been compared. The next step consisted in incorporating the proton gradient into the rate equations. This was realized by distributing its influence among the kinetic parameters such that reasonable catalytic rates were obtained under physiological conditions. Finally, these new individual kinetic rate expressions for the OXPHOS complexes were integrated in a global model of oxidative phosphorylation. This new model could fit interrelated data of oxygen consumption, the transmembrane potential and the redox state of electron carriers. Furthermore, it could well reproduce flux inhibitor titration curves, which validates its global responses to local perturbations. This model is a solid basis for analyzing the role of OXPHOS and mitochondria in detail. They have been linked to various cellular processes like diabetes, cancer, mitochondrial disorders, but also to the production of reactive oxygen species, which are supposed to be involved in aging.