Dans le sud du bassin méditerranéen, le citronnier fleurit et fructifie plusieurs fois par an mais la production ne couvre pas la demande estivale ce qui engendre une inflation des prix. La floraison du citronnier a été peu étudiée et reste mal connue. Pourtant, mieux contrôler la production nécessite de connaitre les différentes étapes de transformation du méristème (de l'état végétatif à l'état floral), les potentialités des organes de production et les caractéristiques des fruits chez les variétés les plus cultivées. Pour trois variétés majeures (Eureka, Femminello et Interdonato), nous avons étudié au cours de 2 cycles annuels de production, le cycle biologique, la morphogénèse et l'histogénèse des structures reproductives, le lien entre les activités d'enzymes de neutralisation de H2O2 et le développement floral et l'impact de régulateurs de croissance sur la floraison-fructification. Les 3 variétés diffèrent sensiblement en terme de cycle de développement. La variété Eureka présente les critères de sélections agronomique les plus intéressants : calibre du fruit de taille moyenne, rendement en jus élevé et peu voire pas de pépins. L'activité G-POD (feuilles et bourgeons) varie selon le stade d'évolution des bourgeons fructifères ce qui en fait un bon marqueur du développement floral chez les 3 variétés. A court-terme, l'application sur la frondaison de régulateurs de croissance (gibbérellines, GA et hydrazine maléique, HM) affecte le métabolisme oxydatif et l'activité photosynthétique des feuilles. A plus long terme, la floraison et la fructification sont impactées. L'application de GA améliore la production estivale et de ce fait le bénéfice annuel pour l'arboriculteur. / In the southern Mediterranean, lemon trees flourish and fructify several times a year but production does not cover summer demand which causes price rises. Flowering in this species has been poorly studied and is little known. Still, better production control requires better knowledge of the different stages of meristem transformation (vegetative to floral stage), the potential of the producing organs and the fruit characteristics in the most frequently cultivated varieties. During two annual production cycles we studied three of the main varieties (Eureka, Femminello and Interdonato), investigating the life cycle, morphogenesis and histogenesis of the reproductive structures, the link between the activities of the H2O2 neutralizing enzymes, floral development and the impact of growth regulators on flowering and fruiting. The three varieties were found to differ significantly in the development cycle. Eureka presents the most interesting agronomic criteria: medium fruit size, higher juice yield and the fruit are virtually seedless. The activity of the enzyme guaiacol peroxidase (in the leaves and buds) varies with the development stage of fruit buds making it a good marker of floral development in all three varieties. In the short term, foliar application of growth regulators (gibberellins and maleic hydrazine) was found to affect oxidative metabolism and photosynthetic activity of the leaves. In the longer term, flowering and fruiting are impacted. Application of gibberellins improves summer production and therefore the fruit producers' economic return.

La pathogénie de lostéo-arthropathie dégénérative chez le cheval est lobjet de nombreuses recherches, notamment sur le rôle des espèces activées de lazote et de loxygène (RNOS) dont les actions délétères sur larticulation sont décrites, mais dont lorigine, les raisons et la cinétique de production restent peu connues : on implique souvent les chondrocytes et des phénomènes cycliques danoxie/ré-oxygénation (A/R). Lobjectif du travail était détudier la production des RNOS par les cellules de larticulation, chondrocytes ou synoviocytes équins, cultivés séparément ou en co-culture pour imiter les interactions existantes dans larticulation où les chondrocytes matures sont nourris par diffusion à partir du liquide synovial à basse tension en O2, fourni par les synoviocytes. Pour induire leur activité oxydante, nous avions choisi de soumettre les cellules en culture à des cycles successifs dA/R. Les cellules articulaires équines sont libérées de leur matrice par digestion enzymatique. Les chondrocytes sont mis en culture en billes dalginate (culture en trois dimensions qui maintient le phénotype cellulaire) et les synoviocytes sont cultivés en monocouche. Les chondrocytes équins sont cultivés en milieu à 4,5 g/l de glucose, sous différentes conditions en O2 : 21 % (condition de culture habituelle), 5 % (condition proche de la situation in vivo) et 1 % (condition danoxie). Le nombre des chondrocytes est resté pratiquement constant partout jusquau 10e jour de culture. Mais une identification (par coloration spécifique) montre une augmentation régulière au cours du temps du nombre des cellules apoptotiques à 21% dO2 et une diminution à partir du 11e jour à 5 % et à 1% dO2. À 1 % dO2, il y a une chute du nombre de cellules vivantes jusquau 8e jour de culture, chute qui est compensée au 11e jour. 5 % dO2 sont les conditions de culture les plus favorables au maintien du nombre de cellules et les chondrocytes résistent à lanoxie pendant plus de dix jours de culture. Pour tester le rôle du glucose dans la résistance à lanoxie, les chondrocytes sont cultivés avec des concentrations variables en glucose (0, 1 et 4,5 g/l de milieu), combinées aux tensions dO2 de 1 %, 5 % et 21 %. Lexcès de glucose (4,5 g/l) a un effet défavorable après 8 jours de culture. Les chondrocytes équins sont capables de résister plusieurs jours aux conditions les plus drastiques : 1 % dO2 et absence de glucose. Les études en microscopie (optique et électronique) confirment une souffrance cellulaire à 21 % dO2, accentuée à 4,5 g/l de glucose: accumulation de gouttelettes à contenu lipidique et mitochondries dématiées. Elles montrent également la présence de lipides intracellulaires dans les chondrocytes sains, une source dénergie possible permettant leur survie en anoxie. Les synoviocytes équins en culture ont été caractérisés en microscopie (aspect, détection immmunologique de la protéine-produit du gène PGP 9,5) et par leur capacité de phagocytose. Ils se multiplient de façon exponentielle à 10 % dO2 (condition proche des conditions physiologiques) et peuvent être maintenus en culture de longue durée. À 21 % dO2, ils se multiplient plus lentement. Létude du métabolisme oxydant des chondrocytes et des synoviocytes équins, en conditions de culture normales et après A/R, est effectuée en mesurant leur consommation dO2 par oxymétrie (réponse mitochondriale), leur production globale de RNOS (estimée par la mesure de léthylène, produit par lattaque dun substrat par les RNOS) et leur production despèces radicalaires [mesurée en résonance paramagnétique électronique (RPE) avec spin trapping]. Les chondrocytes équins consomment peu dO2 (± 20 picomoles dO2/min/10 6 cellules) indépendamment des conditions de culture avant oxymétrie et malgré un complexe terminal de la chaîne mitochondriale fonctionnel. Ils sont peu influencés par les cycles dA/R et ne produisent ni de RNOS ni despèces radicalaires. Les synoviocytes équins consomment plus dO2 (± 1 nanomole dO2/min/106 cellules) et trois cycles dA/R induisent une chute de cette consommation et des signes de souffrance mitochondriale. Les synoviocytes sont capables de produire des RNOS et augmentent cette production sous leffet dune stimulation par agent pharmacologique (PMA) ou endogène (TNF-α). Cette production de RNOS est liée à lactivité denzymes à flavine comme la NOX. La RPE montre une production despèces radicalaires après A/R, identifiées aux dérivés de lanion superoxyde et dune peroxydation lipidique dont lorigine est la mitochondrie, sans pouvoir exclure une participation des enzymes oxydantes cytosoliques (NOX ou xanthine oxydase). Les synoviocytes peuvent donc répondre par une activité oxydante à lA/R. Pour la co-culture, les meilleures conditions sont un rapport synoviocytes/chondrocytes 1/3, un milieu de culture mixte, 10 % dO2, la condition dadhérence pour les synoviocytes et la culture en billes dalginate (placées en « inserts ») pour les chondrocytes. Après 48 h de co-culture dans ces conditions, 80 % des synoviocytes et 60 % des chondrocytes survivent. Les interactions entre les deux types cellulaires se traduisent par des variations importantes dans la production de certains médiateurs inflammatoires comme la PGE2. Il ressort de ce travail que les synoviocytes répondent à lA/R par une production de RNOS et en libérant des médiateurs inflammatoires et quils pourraient jouer un rôle majeur dans lOAD. Des études complémentaires sont nécessaires, surtout avec le modèle de co-culture.

Plusieurs études rapportent que les personnes ayant un taux élevé de LDL et souffrants d'athérosclérose ont un risque accru de développer l'ostéoporose. Le remodelage osseux est effectué par deux types de cellules. Les ostéoblastes sont responsables de la synthèse de la matrice osseuse et de la régulation de sa dégradation par les ostéoclastes. L'altération de ce processus de renouvellement mène à diverses pathologies osseuses. L'ostéoporose est caractérisée par une faible densité minérale du tissu osseux et une microarchitecture de piètre qualité augmentant les risques de fractures. Les LDL en forte concentration dans le plasma des patients athérosclérotiques subissent une oxydation progressive, ce qui accroit leur réactivité et les rend athérogéniques. Ainsi, le principal objectif de l'étude a été d'évaluer les effets des LDL oxydés (oxLDL), des oxystérols 7β-hydroxycholestérol et 7ketocholestérol et de la Iysophosphatidylcholine (IysoPC) sur les pré-ostéoblastes humains MG-63. Considérant la variété des effets induits par les oxLDL qui étaient rapportés dans la littérature, nous avons émis l'hypothèse que la réponse des ostéoblastes à des concentrations croissantes de oxLDL ne serait pas monophasique. L'exposition des MG-63 à des hox-LDL (LDL fortement oxydées) et au 7β-hydroxycholestérol pendant 48 heures produit une réponse de type hormèse lors des essais de viabilité cellulaire (activité réductrice MTT). Ainsi, il y a augmentation de l'activité réductrice cellulaire à faibles concentrations, effet perdu à fortes concentrations de hox-LDL et de 7β-hydroxycholestérol. Les nLDL (LDL natives) et les mox-LDL (LDL moyennement oxydées) induisent aussi une stimulation de l'activité MTT. Toutefois, celle-ci n'est pas de type hormèse, car il n'y a pas de chute de l'activité MTT à fortes concentrations. Par contre, le 7ketocholestérol réduit l'activité MTT de manière dose-dépendante et la lysoPC n'influence pas l'activité MTT. Contrairement aux nLDL, la stimulation de l'activité MTT par les hox-LDL et les mox-LDL est plus élevée que l'augmentation du nombre de cellules et le taux de division cellulaire (déterminé par la réduction de fluorescence du CFSE mesurée au cytofluoromètre) dans les mêmes conditions. De plus, aucune différence significative de taille cellulaire, de masse mitochondriale ni de l'état lysosomal n'a été observée. Cependant, l'exposition aux hox-LDL provoque une augmentation du potentiel membranaire mitochondrial et la production de ROS. Nous avions comme hypothèse que la stimulation d'activité MTT reflétait les niveaux de ROS cellulaire. Toutefois, une incubation avec l'antioxydant NAC n'a pas d'effet sur l'activité MTT et l'agent pro-oxydant BSO, qui favorise une augmentation de ROS cellulaire, diminue plutôt l'activité MTT. Par contre, nous avons démontré l'expression de l' ARNm d'une f1avoenzyme, la NADPH oxydase NOX-4. Cette enzyme est connue pour produire le radical superoxyde et être stimulée par les hox-LDL. L'inhibition des flavoenzymes avec le DPI a réduit l'activité MTT. De plus, l'analyse de l'autofluorescence des cellules au microscope confocale a permis de constater une augmentation de la fluorescence associée au NAD(P)H. Ces résultats démontrent que les enzymes réductrices dépendantes du NAD(P)H du type flavoenzymes, possiblement NOX-4, jouent un rôle dans l'augmentation du potentiel réducteur cellulaire. Nous voulions aussi vérifier l'hypothèse selon laquelle l'augmentation de la production de ROS induit un stress oxydatif pouvant être dommageable pour les ostéoblastes. Cette hypothèse est appuyée par nos résultats montrant une diminution des groupements thiols réduits (SH-) intracellulaires, de l'activité phosphatase alcaline et l'augmentation de l'expression de l'ARNm de l'enzyme de détoxification métallothionéine en présence de faibles concentrations de oxLDL. Nous proposons le mécanisme suivant: les oxLDL stimulent la production de ROS et des mécanismes intracellulaires associés aux thiols sont enclenchés afin de contrecarrer les effets de ces ROS. Il en découle un stress oxydatif qui oriente l'énergie cellulaire vers la production de NAD(P)H. Le NAD(P)H participe aux activités de flavoenzymes servant à régénérer les groupements thiols, mais il peut aussi être utilisé par la flavoenzyme NOX-4, qui contribue aussi à la production de ROS. Ainsi, les fonctions ostéoblastiques sont perturbées par le stress oxydatif et la réorientation de l'utilisation de l'énergie cellulaire, ce qui contribue à affaiblir la structure osseuse et mène à l'ostéoporose. En effet, les altérations de la prolifération, de la différenciation et de la migration cellulaire témoignent en ce sens. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : Athérosclérose, Ostéoporose, oxLDL, Essais MTT, ROS, NADPH, Flavoenzyme, NADPH oxydase, NOX-4, Stress oxydatif, Thiols, Métallothionéine.

La production défectueuse d'IL-12, associée à l'anémie et dysérythropoïèse durant la malaria, semble être causée par le pigment paludique hémozoïne (HZ). Ce dernier inhibe l'expression génique de l'IL-12p40 dans les monocytes humains par un mécanisme dépendant de l'IL-10. Étant donné que plusieurs études ont associé les effets anti-inflammatoires de l'HZ au stress oxydatif et que les oxydants inhibent l'IL-12 par un mécanisme dépendant des espèces réactives de l'oxygène (EROs) et de l'induction de la hème oxygénase-1 (HO-1), nous avons étudié les effets de l'HZ synthétique et de l'hémine (HE) sur la production des EROs et l'induction de la HO-1 dans les macrophages dérivés de la moelle osseuse (BMMps). De manière intéressante, le stress oxydatif dépendant du fer mène à l'induction de la HO-1 via une voie dépendante de la p38 MAP kinase. Puisque cette enzyme semble essentielle pour les effets anti-inflammatoires de l'IL10, les effets de l'HZ synthétique et de l'HE sur la production de cette cytokine dans les BMMps ont été étudiés. De plus, la production d'IL-12p40 et d'IL-12p70 en réponse à une stimulation par LPS ou IFNγ/LPS a été comparée, de même que l'effet du n-Acétylcystéine (NAC) exogène sur ces réponses. Également, l'effet d'inhibiteurs des voies de signalisation en réponse au LPS ou IFNγ/LPS chez des BMMps a été évalué au niveau des réponses d'IL-12p70 et d'IL-10. En contraste à l'HZ, l'HE a été démontré comme étant un fort inducteur de la HO-1 et des EROs. Aucun de ces deux composés riches en fer (CRFs) n'induisait davantage la production d' IL-10 en réponse au LPS, mais ces deux composés diminuaient significativement la production d' IL-12p70 et d'IL-12p40 par les BMMps stimulés avec du LPS ou IFNγ/LPS. De manière intéressante, l'inhibition de la p38 MAP kinase a mené à une chute significative de la production d'IL-10 et à une sécrétion augmentée d'IL-12p70 dans les BMMps témoins et prétraités avec de l'HZ, mais a échoué à restaurer la réponse déficiente d'IL-12p70 en réponse à l'IFNγ et au LPS dans les BMMps traités par HZ et HE. Les effets inhibiteurs de l'HZ et de l'HE sur la production d'IL-12p70 étaient réfractaires au traitement par le NAC. La principale voie impliquant une différence de comportement des BMMps en réponse à l'HZ semble être celle de la MAPK JNK puisqu'un inhibiteur de celle-ci semble contrer au moins partiellement l'effet inhibiteur de l'HZ sur la production d'IL-12p70. Nos résultats suggèrent donc que l'HZ inhibe la production d'IL-12p70 dans les BMMps murins via un mécanisme indépendant de la voie de la p38 MAP kinase et de l'IL-10 mais qui pourrait dépendre d'une augmentation des niveaux de GSH intracellulaires. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : Malaria, Stress oxydatif, Hémozoïne, Interleukine-12, Interleukine-10.

La céruloplasmine (CP) est une protéine à cuivre plasmatique qui constitue, entre autres, un important marqueur de l'inflammation et possède plusieurs propriétés antioxydantes, incluant la capacité à piéger des espèces oxygénées réactives (EOR) et à contrer la génération de •OH par une activité ferroxydase. Des études antérieures ont aussi attribué à la CP une action protectrice sur un cœur de rat isolé soumis à l'ischémie-reperfusion, mais les mécanismes de cette cardioprotection n'ont pas tous été élucidés. Dans le passé, une étude a montré une action dépolarisante de la CP sur les membranes de cellules de neuroblastome, impliquant possiblement des canaux à K+. Par conséquent, un effet de la CP sur le potentiel d'action et les contractions des cardiomyocytes constitue une hypothèse du mécanisme de cardioprotection par la CP. De plus, la littérature relate deux nouvelles activités enzymatiques de la CP, qui pourraient logiquement contrer les effets délétères du H2O2 lors de l'ischémie-reperfusion. Premièrement, la CP exercerait une activité NO-oxydase permettant de former des thiols S-nitrosés (RSNO). Ainsi, la possibilité que la CP protège les thiols de protéines cellulaires par S-nitrosation est envisageable. Deuxièmement, l'activité glutathion(GSH)-peroxydase consommatrice de H2O2 de la CP pourrait aussi contribuer à protéger les cellules cardiaques. Les objectifs de cette étude visaient donc à évaluer, au niveau cellulaire, l'implication des activités dépolarisante, NO-oxydase/RSNO-synthase et GSH-peroxydase de la CP dans la cardioprotection. Des études de microscopie de fluorescence dynamique ont été faites pour déterminer l'effet de la CP sur les contractions des cardiomyocytes de rats nouveau-nés en culture en suivant les influx calciques. Aussi, les activités NO-oxydase/RSNO-synthase et GSH-peroxydase de la CP ont été vérifiées en milieu acellulaire, respectivement par dosage fluorimétrique du NO+, par dosage colorimétrique de Griess des RSNO et par dosage colorimétrique du H2O2 résiduel. A partir des conditions optimales déterminées en milieu acellulaire, l'effet protecteur des différentes combinaisons de CP avec les molécules potentiellement impliquées (GSH, Cys, NO•) a été analysé par mesure de la viabilité des cardiomyocytes de rats nouveau-nés en culture soumis à un stress oxydatif par le H2O2. La microscopie de fluorescence dynamique n'a pas permis d'obtenir d'effets reproductibles de la CP sur la contractilité des cardiomyocytes. L'activité NO-oxydase/RSNO-synthase de la CP, ainsi que la capacité de la protéine à diminuer le H2O2 en présence de GSH, ont été validées en conditions acellulaires. Cependant, seule la combinaison de la CP avec le GSH a protégé significativement les cardiomyocytes de l'effet létal du H2O2. Ce résultat confère pour la première fois une importance physiologique à la collaboration antioxydante des deux molécules. Le mécanisme cardioprotecteur par la CP et le GSH demeure énigmatique, puisque les dosages acellulaires n'ont pas permis de confirmer l'activité GSH-peroxydase précédemment attribuée à la CP. En effet, une action sacrificielle de la CP pourrait avoir masqué son activité catalytique. Néanmoins, ce mécanisme serait sensible à la présence de NO•, qui diminue la protection offerte par la CP et le GSH. Le NO• pourrait S-nitroser et inactiver un résidu Cys important dans l'action d'ébouage de la CP envers le H2O2. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : Céruloplasmine, oxyde nitrique, stress oxydatif, cardiomyocyte, glutathion

La prééclampsie (PE), principale cause de décès maternel, est une pathologie gravidique touchant ≈8% des grossesses. Bien que l'étiologie de cette maladie soit inconnue, certaines études cliniques ont suggéré une altération du métabolisme de calcium (Ca2+) en présence de PE. Suivant l'hypothèse que les échanges de Ca2+ par les syncytiotrophoblastes sont perturbés lors de grossesses PE, notre objectif est d'approfondir les mécanismes de transport du Ca2+ dans les placentas PE en comparant, avec des placentas normaux, l'expression de différentes protéines impliquées dans l'homéostasie calcique. À partir de tissus placentaires totaux, nous avons étudié l'expression de ces protéines ainsi que l'influence des variations d'expression observés sur le transport de Ca2+ dans des cultures primaires de syncytiotrophoblastes. Les niveaux d'ARNm et de protéine ont été examinés par PCR en temps réel et par Western Blot, respectivement, chez un groupe normal (n=16) et un groupe PE (n=8). Notre étude a démontré une diminution significative du transport de Ca2+ par les syncytiotrophoblastes primaires PE ainsi qu'une diminution de l'expression protéique et d'ARNm de plusieurs gènes impliqués dans le transfert de Ca2+ dans les placentas PE, accompagné d'une augmentation de l'expression d'un marqueur de stress oxydatif (hOGG1) ainsi qu'une diminution d'une enzyme synthétisant l'ATP (ATP synthétase). Aussi, la mitochondrie et le réticulum endoplasmique semblent augmenter leurs réserves de Ca2+ lors de PE. De plus, comme plusieurs hormones sont impliquées dans la régulation de l'homéostasie du Ca2+, nous avons voulu approfondir nos recherches à ce sujet. Nous avons observé que l'expression de plusieurs récepteurs impliqués dans cette régulation était diminuée dans les placentas PE, notamment le récepteur de la progestérone, de l'œstradiol, de la vitamine D et de la PHTrP. Nous concluons donc que l'homéostasie du Ca2+ et son transport à travers le placenta sont compromis lors de grossesses prééclamptiques et cela semble être affecté par un manque d'ATP et un excès de stress oxydatif. Des recherches futures seront nécessaires afin de mieux comprendre l'implication de la régulation hormonale sur le transfert de Ca2+ lors de PE. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : Prééclampsie, calcium, placenta, trophoblaste, syncytiotrophoblaste, stress oxydatif.

Le stress oxydatif est impliqué dans la genèse de nombreuses pathologies, dont plusieurs maladies cardiaques et circulatoires. De par l'action du monoxyde d'azote, ainsi que des dérivés réactifs de l'oxygène et des antioxydants influençant sa biodisponibilité, sur le système nerveux autonome, le stress oxydatif peut induire certaines pathologies de par son influence sur les fonctions autonomes cardiaques. D'autre part, la variabilité du rythme cardiaque (VRC), une mesure fiable et non invasive, peut facilement être utilisée pour mesurer l'activité du système nerveux autonome au niveau cardiaque. L'objectif de cette étude était d'explorer les liens entre les valeurs de stress oxydatif et de variabilité du rythme cardiaque, par une analyse a posteriori, dans le but de mieux comprendre leurs interactions. Des valeurs de variabilité du rythme cardiaque ont été mesurées sur 270 participants recrutés dans six communautés ripariennes de l'Amazone au Brésil. Des valeurs de monoxyde d'azote, de malondialdehyde, de catalase et de glutathion peroxydase ont aussi été recueillies, en plus de la pression artérielle, du rythme cardiaque et de l'indice de masse corporelle. Nous avons pu observer de faibles corrélations inverses significatives entre le monoxyde d'azote et le SDNN (r = -0,219 p = 0,006), les basses fréquences (ms2) (r = -0,181 p = 0,024) et les très basses fréquences (r = -0,201 p = 0,012) de l'analyse de VRC. Nous avons aussi pu observer une faible corrélation significative entre le malondialdehyde est les très basses fréquences (r = 0,140 p = 0,032). Nous n'avons pu observer aucune corrélation significative entre la catalase, le glutathion peroxydase et les valeurs de VRC. Les résultats ne permettent pas d'atteindre les objectifs fixés, malgré la démonstration de certaines corrélations. L'étude des interactions entre le stress oxydatif demeure toutefois pertinente et des études expérimentales sur une population homogène seraient intéressantes. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : stress oxydatif, variabilité du rythme cardiaque, antioxydants, monoxyde d'azote, système nerveux autonome

Une faible exposition à des stress tels qu'un choc thermique, du stress oxydatif ou des radiations peut induire une réponse adaptative qui permet aux cellules et aux organismes qu'elles constituent de continuer à fonctionner normalement lorsqu'ils sont confrontés à un stimulus négatif. Ces réponses adaptatives impliquent de nombreux changements dans l'expression de gènes et de protéines, dont l'induction de défenses cellulaires (antioxydants, protéines de choc thermique (heat shock proteins (Hsps)), etc.) qui permettront à la cellule de survivre. Si une réponse adaptative ne parvient pas à contrer les effets de l'exposition au stress, les cellules sont éliminés via des processus de mort cellulaire comme l'apoptose ou la nécrose. Une exposition préalable à des températures modérées, de l'ordre de 40°C, induit une réponse adaptative (la thermotolérance) qui permet aux cellules de résister à une agression toxique ultérieure. La thermotolérance induite par des températures modérées de l'ordre de 39-40°C (ce qui correspond physiologiquement à un état fiévreux) a été peu étudiée et est mal comprise. Les deux objectifs principaux de cette étude sont : (i) d'évaluer si l'induction d'un système de défense par une température modérée et non-létale (40°C) peut permettre de protéger la cellule contre l'activation de la cascade apoptotique par le stress oxydatif, et (ii) de comprendre les mécanismes moléculaires détaillés de l'apoptose induite par le stress oxydatif. L'apoptose est évaluée au niveau des voies de signalisation médiées par les mitochondries, des récepteurs de mort et le réticulum endoplasmique (RE) dans des cellules HeLa. L'objectif premier est de déterminer si un choc thermique modéré peut induire un mécanisme de défense cellulaire autre que les Hsps. En effet, une thermotolérance modérée (40°C, 3h) induit une augmentation du taux de plusieurs antioxydants et protéines de stress du RE. L'expression protéique et l'activité enzymatique de la manganèse superoxyde dismutase (MnSOD) et de la catalase sont augmentées dans les cellules thermotolérantes, comparées aux contrôles (37°C). Les niveaux intracellulaires de glutathion et de y-glutamylcysteine synthétase, l'enzyme qui synthétise le glutathion, sont aussi augmentés. Ceci peut être expliqué par l'augmentation de la production de dérivés réactifs de l'oxygène (reactive oxygen species, ROS) dans les cellules thermotolérantes. De plus, l'expression des protéines de stress du RE, PERK, p-PERK, eIF2α et p-eIF2α, est accrue dans ces cellules. Cela démontre que la thermotolérance modérée accroit les effets pro-survie de la voie PERK/eIF2α de réponse aux mauvais repliements de protéines (unfolded protein response, UPR). Le second objectif a pour but de déterminer les mécanismes de l'apoptose induite par le stress oxydatif. Lorsqu'elles sont exposées à du peroxyde d'hydrogène (H2O2), les cellules entrent en apoptose via les voies des mitochondries, des récepteurs de mort et du RE. L'activation de la cascade mitochondriale de l'apoptose implique la translocation de Bax à la mitochondrie, la dépolarisation de la membrane mitochondriale, la libération du cytochrome c, l'activation des caspases -9 et -3 et la condensation de la chromatine du noyau. De plus, H2O2 cause l'activation de p53 et l'induction de sa protéine cible PUMA, ainsi que l'apoptose caspase-indépendante impliquant le facteur d'induction de l'apoptose (AIF). Ces évènements sont tous inhibés dans les cellules thermotolérantes, ce qui suggère qu'une exposition préalable à des températures modérées et physiologiques peut protéger les cellules contre l'apoptose mitochondriale déclenchée par le stress oxydatif, qu'elle soit caspase-dépendante ou -indépendante. De plus, H2O2 active la voie d'apoptose du Fas récepteur de mort par l'induction du ligand FasL, le recrutement de la protéine FADD à la membrane plasmique et l'activation des caspases -8 et -2. Ceci mène au clivage de Bid et à la voie mitochondriale de l'apoptose. Tous ces évènements sont diminués dans les cellules thermotolérantes, ce qui démontre une fois de plus le rôle anti-apoptotique de cette réponse adaptative. L'induction de FasL, l'activation des caspases -8 et -2 et l'apoptose sont inhibées par pifithrin-α, un inhibiteur de p53, ce qui suggère que p53 agit en amont dans l'activation de la voie des death receptors par H2O2. Une exposition courte (15 min) des cellules au H2O2 donne lieu à l'activation de l'UPR, comme le confirment l'augmentation de l'expression de p-PERK, p-eIF2α, p-IRE1α et du clivage de ATF6. Une exposition plus longue (1-3 h) au H2O2 induit l'apoptose liée au RE, durant laquelle l'expression de CHOP ainsi que l'activité enzymatique de la calpaïne et des caspase -7, -4, -12 et -3 augmentent. Tous ces évènements pro-apoptotiques sont diminués dans les cellules thermotolérantes. Il a été montré que le calcium, la calpaïne et la caspase -7 agissent en amont de l'activation de l'apoptose liée au RE par H2O2. De plus, la réponse adaptative (UPR) prédomine lors d'expositions courtes au H2O2 (stress léger) tandis que lors d'expositions plus longues (stress sévère), c'est l'apoptose liée au RE qui est la plus fréquente. En conclusion, cette étude permet d'ajouter aux connaissances sur l'effet anti-apoptotique et protecteur de la réponse adaptative induite par un stress modéré, tel une fièvre, sur le stress oxydatif. Cette étude améliore également notre compréhension de l'activation de la cascade apoptotique par le pro-oxydant H2O2, cascade qui a d'importantes répercussions sur la santé humaine si l'on considère le rôle des ROS dans les pathologies majeures que sont le cancer, le diabète, les maladies cardiovasculaires ou encore les maladies neurodégénératives. ______________________________________________________________________________

Thèse de doctorat : Enzymologie moléculaire et Biologie structurale : Nancy 1 : 2007. / Titre provenant de l'écran-titre. Bibliogr.

Reproduction de : Thèse de doctorat : Qualité et sécurité des aliments : Toulouse, INPT : 2006. / Titre provenant de l'écran-titre. Bibliogr. 146 réf.