À l'heure actuelle, l'obésité est une pathologie qui prend de l'ampleur. Elle est associée à maintes pathologies, dont la résistance à l'insuline et la dysfonction endothéliale. Selon les lits vasculaires, les impacts de ces phénomènes peuvent avoir des conséquences physiologiques importantes. Précédemment, nous avons démontré qu'il y avait une augmentation de 30 à 50% de la perméabilité endothéliale dans le muscle strié du modèle de rat Zucker obèse. Pour sa part, le tissu adipeux est unique de par ses fonctions métaboliques, endocrines et sa microcirculation. Trois facteurs impliqués dans le contrôle de la microcirculation et de la perméabilité vasculaire dans ce tissu nous ont intéressés: le facteur de croissance de l'endothélium vasculaire, la NO synthétase endothéliale et l'angiotensine II via son récepteur de type 1. Tout d'abord, le VEGF est reconnu pour augmenter l'angiogénèse et la perméabilité vasculaire. La eNOS est une enzyme qui produit le NO à partir de la L-arginine. En dehors de son rôle classique de vasorelaxation, le NO stimule l'expression du VEGF et parallèlement, le VEGF active la production de NO: il y a donc synergie entre ces deux facteurs. L'angiotensine II est un peptide qui engendre une forte vasoconstriction, via son récepteur AT[indice inférieur 1]R. Notre hypothèse de recherche est que la microcirculation du tissu adipeux possède un rôle primordial dans l'obésité, étant donné que celui-ci tient une place importante sur le plan métabolique et endocrinien. Nos objectifs ont consisté à évaluer s'il y avait des changements dans la perméabilité endothéliale chez le rat Zucker obèse par la méthode du Bleu d'Evans, par des mesures de l'expression des trois facteurs étudiés (Western et qRT-PCR) et par l'observation en microscopie électronique des caractéristiques morphologiques des cellules endothéliales, dans les divers types de tissus adipeux (sous-cutané, rétropéritonéal et épididymique). Nos résultats ont démontré qu'il existe une grande hétérogénéité dans la perméabilité des divers sous-types de tissu adipeux. Contrairement aux autres organes, cette perméabilité est majoritairement à la baisse. De plus, nos expériences ont permis d'observer plusieurs changements significatifs dans l'expression protéique de la eNOS, de l'AT[indice inférieur 1]R et du VEGF A et ceci, principalement dans le tissu adipeux sous-cutané. Les changements protéiques de ces trois facteurs ne corrèlent pas exactement avec les changements de perméabilité observés avec le Bleu d'Evans, ce qui nous permet d'affirmer que la régulation de la perméabilité vasculaire est régulée par une myriade d'autres facteurs. D'autre part, les résultats préliminaires obtenus en microscopie électronique ne nous ont pas permis d'identifier de changements marquants au niveau de la morphologie des cellules endothéliales. Ceci suggère que les changements de perméabilité ne sont pas la conséquence de changements morphologiques, mais plutôt fonctionnels et en relation avec différents facteurs vasoactifs. En somme, nos résultats ont permis d'établir qu'il y a une grande hétérogénéité entre les divers sous-types de tissu adipeux, au point de vue de la perméabilité et de l'expression de certains facteurs vasoactifs. De plus, ces expériences nous ont démontré que le contrôle de la perméabilité vasculaire est un phénomène très complexe qui implique une multitude de phénomènes. La compréhension de ces derniers [phénomènes] dans le tissu adipeux pourrait permettre l'élaboration de traitements ayant la capacité de limiter l'expansion de ce tissu en diminuant sa perméabilité vasculaire, ceci afin de restreindre les effets néfastes liés à l'obésité.

L'infarctus du myocarde est une maladie très répandue dans les pays industrialisés. La condition d'ischémie-reperfusion qui en est à l'origine endommage les tissus par la production accrue d'espèces oxygénées réactives (EOR) qui conduisent les cellules à un état de stress oxydatif. L'oxyde nitrique (NO·) est non seulement une EOR mais aussi une molécule de signalisation importante dans le système cardiovasculaire. Plusieurs effets cytoprotecteurs du NO· et de ses dérivés ont été démontrés dans le coeur ischémie-reperfusé, mais des effets cytotoxiques ont aussi été rapportés. La céruloplasmine (CP) est une glycoprotéine à cuivre circulante multifonctionnelle. Quoiqu'elle soit étudiée depuis longtemps, certaines de ses propriétés demeurent incomprises. Elle est entre autres reconnue comme un antioxydant circulant très important. L'équipe du Dr Mateescu a d'ailleurs rapporté qu'elle protège le coeur isolé des EOR durant l'ischémie-reperfusion. D'autres équipes ont toutefois montré une activité pro-oxydante de la CP qui ferait d'elle un facteur de risque associé aux maladies cardiovasculaires. Deux activités de la CP ont récemment été mises en évidence in vitro: la synthèse de nitrosothiols (RSNO) et de nitrites (NO₂¯) deux dérivés du NO· considérés comme des formes d'entreposage qui prolongeraient la durée de vie de ce facteur. Nous avons donc posé l'hypothèse d'une implication de la CP dans la potentialisation des effets du NO· par ses nouvelles activités. Le but de cette étude était ainsi d'évaluer l'effet cytoprotecteur de la combinaison CP + NO· et de vérifier l'implication d'une activité S-nitrosante et/ou nitrite-synthase de la CP. Pour ce faire, des cultures de cardiomyocytes de rats nouveau-nés ont été soumises à un stress oxydatif généré par l'ajout de H₂O₂ au milieu de culture. L'effet toxique ou protecteur de la CP et d'un donneur de NO·, le PAPA NONOate, a été déterminé par la mesure de la viabilité cellulaire à l'aide d'une coloration au Hoechst 33342 et à l'iodure de propidium. Les dérivés RSNO et NO₂¯du NO· ont été mesurés dans les milieux de culture par les réactifs colorimétriques de Griess ou par la sonde fluorescente DAN, après une optimisation de ces méthodes de dosage. Les résultats, qui vont à l'encontre de l'hypothèse de départ, ont montré que ni la CP, ni la combinaison CP + NO· ne protègent les cardiomyocytes du H₂O₂. La CP a même exercé un effet cytotoxique sur les cellules en présence de H₂O₂. Le NO· à faible concentration procure une certaine protection contre le H₂O₂, mais en intensifie la toxicité à forte concentration. En conditions acellulaires, l'activité S-nitrosante de la CP sur le glutathion a été confirmée et est comparable à celle de la littérature. La synthèse de NO₂¯ n'a toutefois pas été observée à des niveaux détectables. Des faits nouveaux ont aussi été révélés: la CP est capable d'« auto-nitrosation » et l'albumine inhibe l'activité S-nitrosante de la CP. Cette étude indiquerait que l'action cardioprotectrice de la CP contre les dommages causés par l'ischémie-reperfusion n'inclurait pas une protection contre le H₂O₂, ni une potentialisation de l'action du NO· contre ce H₂O₂. L'albumine présente dans le milieu de culture pourrait avoir masqué les possibles interactions entre la CP et le NO·. Ce dernier résultat suggère que la CP circulante aurait peu d'impact sur le métabolisme du NO· en situation physiologique. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : Céruloplasmine, Oxyde nitrique, Cardiomyocytes, Stress oxydatif, S-nitrosation.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

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La céruloplasmine (CP) est une protéine à cuivre plasmatique qui constitue, entre autres, un important marqueur de l'inflammation et possède plusieurs propriétés antioxydantes, incluant la capacité à piéger des espèces oxygénées réactives (EOR) et à contrer la génération de •OH par une activité ferroxydase. Des études antérieures ont aussi attribué à la CP une action protectrice sur un cœur de rat isolé soumis à l'ischémie-reperfusion, mais les mécanismes de cette cardioprotection n'ont pas tous été élucidés. Dans le passé, une étude a montré une action dépolarisante de la CP sur les membranes de cellules de neuroblastome, impliquant possiblement des canaux à K+. Par conséquent, un effet de la CP sur le potentiel d'action et les contractions des cardiomyocytes constitue une hypothèse du mécanisme de cardioprotection par la CP. De plus, la littérature relate deux nouvelles activités enzymatiques de la CP, qui pourraient logiquement contrer les effets délétères du H2O2 lors de l'ischémie-reperfusion. Premièrement, la CP exercerait une activité NO-oxydase permettant de former des thiols S-nitrosés (RSNO). Ainsi, la possibilité que la CP protège les thiols de protéines cellulaires par S-nitrosation est envisageable. Deuxièmement, l'activité glutathion(GSH)-peroxydase consommatrice de H2O2 de la CP pourrait aussi contribuer à protéger les cellules cardiaques. Les objectifs de cette étude visaient donc à évaluer, au niveau cellulaire, l'implication des activités dépolarisante, NO-oxydase/RSNO-synthase et GSH-peroxydase de la CP dans la cardioprotection. Des études de microscopie de fluorescence dynamique ont été faites pour déterminer l'effet de la CP sur les contractions des cardiomyocytes de rats nouveau-nés en culture en suivant les influx calciques. Aussi, les activités NO-oxydase/RSNO-synthase et GSH-peroxydase de la CP ont été vérifiées en milieu acellulaire, respectivement par dosage fluorimétrique du NO+, par dosage colorimétrique de Griess des RSNO et par dosage colorimétrique du H2O2 résiduel. A partir des conditions optimales déterminées en milieu acellulaire, l'effet protecteur des différentes combinaisons de CP avec les molécules potentiellement impliquées (GSH, Cys, NO•) a été analysé par mesure de la viabilité des cardiomyocytes de rats nouveau-nés en culture soumis à un stress oxydatif par le H2O2. La microscopie de fluorescence dynamique n'a pas permis d'obtenir d'effets reproductibles de la CP sur la contractilité des cardiomyocytes. L'activité NO-oxydase/RSNO-synthase de la CP, ainsi que la capacité de la protéine à diminuer le H2O2 en présence de GSH, ont été validées en conditions acellulaires. Cependant, seule la combinaison de la CP avec le GSH a protégé significativement les cardiomyocytes de l'effet létal du H2O2. Ce résultat confère pour la première fois une importance physiologique à la collaboration antioxydante des deux molécules. Le mécanisme cardioprotecteur par la CP et le GSH demeure énigmatique, puisque les dosages acellulaires n'ont pas permis de confirmer l'activité GSH-peroxydase précédemment attribuée à la CP. En effet, une action sacrificielle de la CP pourrait avoir masqué son activité catalytique. Néanmoins, ce mécanisme serait sensible à la présence de NO•, qui diminue la protection offerte par la CP et le GSH. Le NO• pourrait S-nitroser et inactiver un résidu Cys important dans l'action d'ébouage de la CP envers le H2O2. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : Céruloplasmine, oxyde nitrique, stress oxydatif, cardiomyocyte, glutathion

Thèse numérisée par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.

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Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.