El promotor del gen PsEND1 de guisante se expresa de forma específica en tejidos que conforman la arquitectura de la antera desde estadios tempranos del desarrollo. En el presente trabajo hemos fusionado el promotor PsEND1 con el gen citotóxico barnasa para producir ablación celular temprana en las anteras y obtener plantas transgénicas androestériles PsEND1::barnasa en cultivares de tomate con interés agronómico-comercial. Este procedimiento biotecnológico indujo el desarrollo de frutos partenocárpicos en las plantas androestériles mostrando que existe una relación entre la androesterilidad temprana y el desarrollo autónomo del ovario en esta especie. La aplicación de inhibidores de biosíntesis de GAs en ovarios PsEND1::barnasa no polinizados, tales como el paclobutrazol, bloqueó la fructificación y desarrollo del fruto, efecto que fue revertido mediante la aplicación de GA3. Se ha realizado un análisis de la producción y la calidad de los genotipos transgénicos PsEND1::barnasa de los cultivares Micro-Tom, p73 y Moneymaker, comparándolos con sus respectivos genotipos silvestres. En los cultivares Micro-Tom y Moneymaker la producción de los genotipos PsEND1::barnasa y los genotipos silvestres fue similar. En los genotipos transgénicos se produjeron frutos de menor peso y tamaño que los frutos silvestres, pero también un mayor número de frutos por planta. Los genotipos silvestres produjeron un menor número de frutos pero de mayor peso y tamaño. El contenido en sólidos solubles (expresado en ºBrix) fue mayor en los genotipos PsEND1::barnasa mientras que la acidez titulable fue igual o menor en los genotipos transgénicos que en los silvestres. El índice de sabor del fruto, estimado mediante la relación ºBrix/acidez titulable, fue elevado en los frutos de todos los genotipos transgénicos PsEND1::barnasa, indicando que estos frutos tendrían mejor sabor que los frutos de los genotipos silvestres. Los análisis de compuestos volátiles mostraron que los genotipos transgénicos presentaban cambios importantes en el perfil de compuestos volátiles. Los compuestos derivados de carotenoides, lípidos y algunos compuestos fenólicos fueron más abundantes en los genotipos transgénicos. Estos compuestos están asociados con notas florales, notas frutales y notas frescas, por tanto, los frutos partenocárpicos PsEND1::barnasa analizados podrían tener un aroma más afrutado y floral que los frutos de los genotipos silvestres. Otros compuestos fenólicos (metilsalicilato y etilsalicilato) y los derivados de leucina e isoleucina, en general, han disminuido en los genotipos transgénicos respecto a los silvestres. Estos compuestos están asociados con estadios inmaduros del fruto y aportan sensación de estancamiento o de ambiente viciado. Esta disminución indicaría una mayor calidad organoléptica de los frutos partenocárpicos de tomate. El análisis de metabolitos primarios, realizado con las dos líneas PsEND1::barnasa que más diferían respecto al genotipo silvestre, reveló un incremento en el contenido de aminoácidos y azúcares en los genotipos transgénicos evaluados. Este incremento indicaría que los frutos de estos genotipos tendrían mayor valor nutritivo y mejor sabor que los frutos silvestres. Por otra parte, se ha realizado un análisis transcriptómico global en ovarios PsEND1::barnasa y silvestres en diferentes estadios de desarrollo que mostró que el desarrollo del fruto partenocárpico PsEND1::barnasa es similar al que presenta el silvestre después de ser polinizado. En el estadio 1 de desarrollo (5-6 días antes de la antesis) se detectaron cambios de expresión de 1.940 genes, gran parte de ellos relacionados con procesos de regulación. Entre ellos cabe destacar un elevado número de genes relacionados con metabolismo, regulación y transporte de auxinas y giberelinas así como diversos factores de transcripción reprimidos pertenecientes a la familia MADS-box. / Medina Herranz, M. (2010). Androesterilidad ligada a la obención de frutos partenocárpicos en cultivares comerciales de tomate (Solanum lycopersicum L.) [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/7581

El tomate es uno de los cultivos más populares y con un consumo más extendido en todo el mundo. Durante los últimos años se ha convertido en un sistema modelo para los estudios de cuajado y desarrollo del fruto el cual es un proceso clave en el ciclo de vida de las plantas. Actualmente se han producido numerosos avances en el conocimiento de las bases moleculares del proceso de maduración del fruto de tomate (revisado en Seymour y col. 2013). Sin embargo, es poco lo que se sabe de los procesos de desarrollo temprano del ovario y de cuajado del fruto aunque desde el punto de vista agronómico tienen gran importancia en el producto final. En el laboratorio se han venido desarrollando herramientas para el estudio de la fructificación. El principal objetivo de este proyecto de TESIS es la identificación y análisis funcional de nuevos genes implicados en el desarrollo temprano del ovario y en el cuajado del fruto de tomate. Para ello se han planteado dos aproximaciones: una aproximación genómica que pretende analizar los cambios globales a nivel de expresión que tienen lugar durante el desarrollo autónomo del ovario que tiene lugar en plantas androestériles de tomate generadas en el laboratorio. El segundo abordaje es genético y en él se caracterizará genética y molecularmente un mutante de tomate con desarrollo partenocárpico de frutos. La identificación y análisis funcional de nuevos genes involucrados en la fructificación en tomate proporcionará información necesaria del control genético del procesos de fructificación en plantas con frutos carnosos. Además, la modificación de la expresión de estos genes permitirá en el futuro abordajes biotecnológicos dirigidos que proporcionen un mayor control sobre el proceso de fructificación y sobre la calidad de los productos obtenidos. / Rojas Gracia, P. (2014). Identificación de genes que regulan el desarrollo del ovario y el cuajado del fruto de tomate (Solanum lycopersicum L.) [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/43768

Las giberelinas (GAs) son hormonas vegetales que regulan diversos procesos del desarrollo vegetativo y reproductivo de las plantas. Los niveles de GAs activas están regulados principalmente por enzimas de biosíntesis como las GA 20-oxidasas (GA20ox) y GA 3- oxidasas (GA3ox) y por enzimas de catabolismo como las GA 2-oxidasas (GA2oxs). En tomate (Solanum lycopersicum L.) las GA2oxs están codificadas por una familia multigénica de 5 miembros, SlGA2ox. El objetivo principal de nuestro trabajo es estudiar el papel de los genes SlGA2ox en el desarrollo de tomate. Para determinar como están regulados estos genes estudiamos su patrón de expresión en tejidos vegetativos y reproductivos de tomate y en respuesta a variaciones en los niveles endógenos de GAs. Se observó que los genes SlGA2ox tienen un alto grado de redundancia y que, en plántulas, no son inducibles por GAs. Los genes con mayores niveles de expresión en los tejidos vegetativos resultaron ser los genes SlGA2ox3, - 4 y -5 mientras que los genes SlGA2ox1 y SlGA2ox2 parecen ser importantes en el control del crecimiento del ovario ya que están reprimidos en ovarios polinizados en crecimiento y se inducen en ovarios no fertilizados. Para estudiar la función de estos genes en el desarrollo de la planta se empleó un abordaje de genética reversa usando silenciamiento génico post-transcripcional múltiple y simple. Para el silenciamiento múltiple se usó una construcción de tipo horquilla con una secuencia quimérica homóloga a los cinco genes (shRNA2ox) y para el silenciamiento del gen SlGA2ox1 se usó una construcción de tipo micro-RNA artificial (amiRNA2ox1). Ambas construcciones indujeron el silenciamiento, siendo éste más eficiente cuánto más abundante es el mensajero diana. El silenciamiento múltiple inducido por la construcción 35S::shRNA2ox provocó un incremento significativo de los niveles de la giberelina activa GA4 en ovarios. Además, los ovarios no fertilizados crecían mucho más en las plantas transgénicas que en las plantas silvestres (al menos 30 veces más) y presentaban cierto grado de capacidad partenocárpica que no poseían las plantas silvestres, desarrollando entre un 5 y un 37% de frutos partenocárpicos. Los ovarios polinizados de las plantas transgénicas se desarrollaban algo más rápido inicialmente, pero producían frutos del mismo tamaño a los silvestres. Estos resultados sugieren que el papel de las GAs en el crecimiento del fruto de tomate puede estar mediado, al menos en parte, por las GA 2-oxidasas. En el desarrollo vegetativo de estas plantas no se detectaron los efectos fenotípicos clásicos de la superproducción de GAs, ni se detectó ningún incremento en los niveles de GAs en tallos ni en ápices. Sin embargo se observó una inhibición significativa de la ramificación lateral que parecía deberse a un mayor contenido de GA4 detectado en las yemas axilares. Este fenotipo, no esperado, era suprimido eficientemente cuando se inhibía la síntesis de GAs mediante la aplicación del inhibidor paclobutrazol. Estos resultados sugieren un papel para las GAs como represores de la ramificación y que las GA 2-oxidasas son importantes en el control de la aparición de ramas laterales mediado por GAs. En las plantas 35S::amiRNA2ox1, donde solo se silenció el gen SlGA2ox1, a diferencia de lo que ocurre en las plantas de silenciamiento múltiple, no se detectaron cambios en los niveles de GAs activas, ni alteraciones en la ramificación, ni se mostraron efectos reproducibles sobre la partenocarpia. De estos resultados se deduce que el silenciamiento del gen SlGA2ox1 no es suficiente para inducir cambios significativos en el fenotipo de las plantas de tomate probablemente debido a la redundancia génica. En resumen, las GA 2-oxidasas parecen tener un papel en la regulación de los niveles de GAs en los ovarios y en las yemas axilares de tomate y su silenciamiento génico puede inducir crecimiento partenocárpico de los ovarios e inhibición de la ramificación. / Martínez Bello, L. (2014). Estudio del papel de los enzimas de catabolismo GA 2-oxidasas en el desarrollo de tomate (solanum lycopersicum L.) [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/37884

[EN] END1 is an anther-specific gene of pea (Pisum sativum. L) that displays specific expression in the cell lines that will develop the epidermis, connective, middlle layer and endothecium tissues from very early stages (anther primordium) to late stages of the anther development. The END1 promoter region drives the uidA (GUS) gene expression specifically to the anthers of Arabidopsis thaliana, Nicotiana tabacum and Lycopersicon esculentum. The chimaeric END1::GUS gene is regulated exactly like the endogenous END1. The spatial and temporal expression pattern of END1 and the functionality of its promoter region in different plant species suggested us the possibility to use its promoter region for biotechnological applications. We fused the 2’7 kb END1 5’ region with the ribonuclease barnase gene. The barnase is a natural ribonuclease isolated from Bacillus amyloliquefaciens. The chimaeric END1::barnasa gene was introduced into Arabidopsis, tobacco and tomato plants. The expression of the chimaeric gene inhibited anther morphogenesis and efficiently produced male-sterile transgenic plants. A detailed histological study of the development of both, WT and transgenic anthers, showed severe morphological differences from very early stages of anther development. The effects of barnase in transgenic anthers appeared when the anther was at the stage of anther primordium and it was composed by undifferentiated cells. Our results show that the END1 promoter might be a biotechnological tool to generate male-sterile plants for the production of hybrid crop plants. Tomato male-sterile transgenic plants produced parthenocarpic fruits. This observation suggests that male-sterility in tomato is related to the induction of parthenocarpic fruits. To identify and characterize cis-regulatory elements involved in the promoter strength and specificity, expression analysis were performed using constructs containing the END1 promoter, modified by deleting different nucleotide sequences, and the β-glucuronidase gene. Our results reveal that the 5’ region -336/-6 is sufficient to direct properly the spatial and temporal END1 gene expression and also, suggest that the END1 might be a target gene of floral organ identity genes of classes B and C. / [ES] END1 es un gen de guisante (Pisum sativum L.) específico de antera que comienza a expresarse desde estadios tempranos del desarrollo (primordio de antera) en aquellas líneas celulares que darán lugar a los tejidos epidermis, conectivo, capa intermedia y endotecio, y en estos tejidos una vez desarrollados. La región promotora de dicho gen es capaz de dirigir la expresión específica del gen uidA (GUS) a las anteras de plantas de diferentes especies (Arabidopsis thaliana, Nicotiana tabacum y Lycopersicon esculentum). El patrón de expresión del gen GUS en esas plantas es similar al del gen END1 en guisante. Esta especificidad que confiere el promotor de END1 para la expresión de un gen foráneo en las anteras ofrecía la posibilidad de utilizarlo, fusionándolo a un gen citotóxico, como una herramienta biotecnológica para la obtención de plantas transgénicas androestériles. En este trabajo, hemos fusionado la región 5’ completa (-2736/-6) del promotor de END1 a la secuencia codificante de la ribonucleasa extracelular producida por el Bacillus amyloliquefaciens, barnasa. Con esta construcción hemos transformado dos plantas modelo, Arabidopsis y tabaco y una planta de interés agronómico, el tomate. La expresión del gen citotóxico barnasa donde END1 es activo, trajo como consecuencia una degeneración de tejidos de la antera que inhibió el desarrollo de los granos de polen. Las plantas transgénicas resultantes fueron androestériles. Los estudios a nivel histológico de las anteras transgénicas mostraron que los efectos de la barnasa comienzan a observarse muy pronto en el primordio de antera, cuando este está constituido sólo por células indiferenciadas, y continúa observándose a lo largo del desarrollo de la misma. De manera general, al final del programa de desarrollo, las anteras transgénicas eran de menor tamaño, su morfología era distinta de las de las anteras silvestres correspondientes, y en su interior se observaba el tejido conectivo colapsado y una estructura amorfa en lugar de granos de polen viable. La posible pérdida de las células parietales primarias por la acción ribonucleasa podría estar afectando la diferenciación de las células esporógenas, contiguas en el territorio del futuro microsporangio. Estos resultados muestran que el promotor de END1 podría ser una herramienta biotecnológica útil en los programas de obtención de semillas híbridas de diferentes cultivos de interés agronómico. En el caso particular del tomate, todas las plantas transgénicas androestériles produjeron frutos partenocárpicos. Este resultado muestra que existe una relación entre la androesterilidad y el desarrollo autónomo del ovario en esa especie. Por otra parte, se ha realizado un análisis del promotor del gen END1. Para este análisis se realizaron delecciones sucesivas de la región 5’ del gen y los fragmentos resultantes se fusionaron transcripcionalmente al gen delator uidA (GUS). Con estas construcciones se transformaron plantas de A. thaliana y se estudió la expresión del gen uidA mediante el ensayo histoquímico de la actividad de la β-glucuronidasa. Hemos visto que el fragmento de 366/-6 de la región 5’ es la secuencia mínima con capacidad para dirigir la correcta expresión espacial y temporal del gen END1. La pérdida de la expresión de GUS en las anteras de las plantas de Arabidopsis thaliana transformadas con el fragmento de la región 5’ donde se elimina el motivo CArG2, apoya la hipótesis de que END1 podría estar regulado directamente por los genes de identidad de órgano de clase B y C. / [CA] END 1 és un gen de pèsol (Pisum sativum L.) específic d'antera que comença a expressar-se des d'estadis primerencs del desenvolupament (primordi d'antera) en aquelles línies cel·lulars que donaran lloc als teixits epidèrmics, connectiu, capa intermèdia i endoteci, i en aquests teixits una vegada desenvolupats. La regió promotora d'aquest gen és capaç de dirigir l'expressió específica del gen uidA (GUS) a les anteres de plantes de diferents espècies (Arabidopsis thaliana, Nicotiana tabacum i Lycopersicon esculentum). El patró d'expressió del gen GUS en aquestes plantes és similar al del gen END1 en pèsol. Aquesta especificitat que confereix el promotor d' END 1 per a l'expressió d'un gen forà les anteres oferia la possibilitat d'utilitzar-lo, fusionant-lo a un gen citotòxic, com una ferramenta biotecnològica per a l'obtenció de plantes transgèniques androestèrils. En aquest treball, hem fusionat la regió 5' completa (-2736/-6) del promotor d' END1 a la seqüència codificant de la ribonucleasa extracel·lular produïda per Bacillus amyloliquefaciens, barnasa. Amb aquesta construcció hem transformat dos plantes model, Arabidopsis i tabac i una planta d'interés agronòmic, la tomata. L'expressió del gen citotòxic barnasa a on END1 és actiu, porta com a conseqüència una degeneració de teixits de l'antera que va inhibir el desenvolupament dels grans de pol·len. Les plantes transgèniques resultants foren androestèrils. Els estudis a nivell histològic de les anteres transgèniques mostraren que els efectes de la barnasa comencen a observar-se molt prompte en el primordi d'antera, quant aquest está constituït només per cèl·lules indiferenciades, i continua observant-se al llarg del desenvolupament de la mateixa. De forma general, al final del programa de desenvolupament, les anteres transgèniques eren de menor mida , la seua morfologia era diferent de la de les anteres silvestres corresponents , i al seu interior s'observava el teixit connectiu col lapsat i una estructura amorfa en lloc de grans de pol·len viable. La possible pèrdua de les cèl·lules parietals primàries per l'acció ribonucleasa podria estar afectant la diferenciació de les cèl·lules esporògenes,contigües en el territori del futur microesporangi. Aquests resultats mostren que el promotor d' END1 podria ser una ferramenta biotecnològica útil en els programes d'obtenció de llavors híbrides de diferents cultius d'interès agronòmic. En el cas particular de la tomata, totes les plantes transgèniques androestèrils produïren fruits partenocàrpics. Aquestresultat mostra que existeix una relació entre l'androstèrilitat i el desenvolupament atònom de l'ovari en eixa espècie. D' altra banda, s' ha realitzat una anàlisi del promotor del gen END1. Per a aquesta anàlisi és realitzaren delecions successives de la regió 5' del gen i els fragments resultants es fusionaren transcripcionalment al gen delator uidA (GUS). Amb estes construccions és transformaren plantes de A. thaliana i es va estudiar l'expressió del gen uidA mitjançant l'assaig histoquímic de l'activitat de la beta-glucuronidasa. Hem vist que el fragment de 366/-6 de la regió 5' ès la seqüència mínima amb capacitat per a dirigir la correcta expressió espacial i temporal de gen END1. La pèrdua de l'expressió de GUS en les anteres de les plantes d'Arabidopsis thaliana transformades amb el fragment de la regió 5' a on és elimina el motiu CArG2, recolza la hipòtesi que END1 podria estar regulat directament pels gens d'identitat d'òrgan de la classe B i C. / Este trabajo ha sido financiado por el Ministerio de Ciencia y Tecnología mediante los proyectos BIO2000-0940 y BIO2003-01171. Ha sido posible la realización del mismo gracias a la beca otorgada por las Cortes Valencianas en su programa de ayuda a los países del tercer mundo, a las becas de acción social otorgadas por el Rector de la Universidad Politécnica de Valencia Justo Nieto Nieto y a los contratos de trabajo adjudicados a los proyectos antes mencionados. / Roque Mesa, EM. (2004). Análisis funcional y aplicaciones biotecnológicas del promotor del gen END1 de guisante (Pisum sativum L.) [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/114847

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Esta transição é iniciada em resposta aos eventos de polinização e fertilização, os quais induzem o início dos processos fisiológicos e moleculares, que, ao final, irão originar o fruto. A frutificação é fundamental para reprodução nas plantas com flores (Angiospermas). Já foi demonstrado que hormônios (tais como auxina e giberelina) podem atuar em paralelo com fatores de transcrição durante o desenvolvimento do fruto. Alguns desses fatores de transcrição são pós-transcricionalmente regulados por microRNAs. MicroRNAs, são pequenos RNAs (20-22 nt) que regulam pós-transcricionalmente a expressão de genes endógenos, modelando o transcriptoma e a produção de proteínas.Entretanto, vias genéticas orquestradas por microRNAs associadas com o desenvolvimento de ovário, e consequentemente, do fruto em tomateiro (Solanum lycopersicum L.), permanecem pouco exploradas. Neste trabalho, foi investigada a contribuição da via SlymiR159/GAMYB-like durante o processo de desenvolvimento do ovário e frutificação em tomateiro. O miR159 e seus alvos (SlyGAMYB1 e 2) são dinamicamente expressos durante os estágios de desenvolvimento do ovário e consequentemente do fruto. Eventos transgênicos de tomateiro (cv. Micro-Tom) apresentando super-expressão do precursor SlyMIR159 (denominados OE-159) exibiram frutificação precoce quando comparadas aos controles. Notavelmente, todos os eventos OE-159 apresentaram formação de frutos partenocárpicos. Tal alteração no padrão de frutificação pode estar correlacionada a repressão do gene SlyGAMYB1 em períodos pré-antese de desenvolvimento do ovário, é possível que a atividade do fator de transcrição SlyGAMYB1 seja importante para prevenir o início da frutificação antes da polinização. Além disso, a via regulada pelo miR167/SlyARF8A mostrou-se desregulada em ovários pré-antese de plantas transgênicas OE-159. Adicionalmente, mesmo com o fenótipo de partenocarpia e frutificação precoce, não houve alterações na quantidade de hormônios (e.g. giberelina, ácido abscisico e auxina) relacionados à formação de frutos nas plantas transgênicas OE-159. Contudo, a via miR159/GAMYB-like encontra-se reprimida nos primeiros estágios da frutificação (após polinização e fertilização) e a expressão do SlyARF8A (alvo do miR167) encontra-se induzida na presença de auxina. Em conjunto, nossos dados sugerem que o crosstalk entre as vias moduladas pelos microRNAs miR159 e miR167, integrados com a via de sinalização de auxina, é importante para a frutificação em tomateiro. / Fruit set, defined as the shift from quiescent ovary to a fast-growing young fruit, is a key process for fruit production in flowering plants. It has been shown that hormones (such as auxin and gibberellin) act in parallel with transcription factors during fruit set. Some of these are post-transcriptionally regulated by microRNAs (miRNAs). MiRNAs are a group of small non coding RNAs (21-22 nt) that act by regulating post-transcriptionally genes in plants and animals However, microRNA-regulated genetic pathways associated with tomato (Solanum lycopersicum L.) ovary development and fruit set remain poorly exploited. Here, we investigated the functional role of miRNA159/SlyGAMYBlike in tomato ovary development and fruit set. MiR159 and its targets were dynamically expressed in developing flowers, ovaries and fruit tissues. Transgenic tomato (cv. Micro-Tom) plants over-expressing the SlyMIR159 (termed OE-159) exhibited fruit set earlier when compared with control plants. Strikingly, all transgenic lines presented parthenocarpy fruits. Such developmental modification may be a result of the repression of SlyGAMYB1 in pre-anthesis ovaries, our data suggest that SlyGAMYB1 activity is important to prevent fruit set before pollination. In addition as a consequence of this repression, the miR167 node (miR167/SlyARF8 pathway) was mis-regulated in OE-159 ovaries. In addition, we observed that levels of auxin, gibberellin (GA) and abscisic acid (ABA) in pre-anthesis ovaries of several transgenic lines overexpressing the SlyMIR159 were similar to those of the control. Moreover, our experiments suggested that auxin and GA may act repressing the miR159 node during fruit set initiation, in order to release the miR167-targeted SlyARF8A expression during fruit set. Our data show how two microRNA nodes (miR159 and miR167) integrated with hormone signalling into a circuit that coordinates successive steps along ovary and fruit development.

Orientador: Fábio Tebaldi Silveira Nogueira / Resumo: O processo de frutificação é definido como a transição de um ovário em estágio quiescente para estágio de iniciação de formação do fruto. Esta transição é iniciada em resposta aos eventos de polinização e fertilização, os quais induzem o início dos processos fisiológicos e moleculares, que, ao final, irão originar o fruto. A frutificação é fundamental para reprodução nas plantas com flores (Angiospermas). Já foi demonstrado que hormônios (tais como auxina e giberelina) podem atuar em paralelo com fatores de transcrição durante o desenvolvimento do fruto. Alguns desses fatores de transcrição são pós-transcricionalmente regulados por microRNAs. MicroRNAs, são pequenos RNAs (20-22 nt) que regulam pós-transcricionalmente a expressão de genes endógenos, modelando o transcriptoma e a produção de proteínas.Entretanto, vias genéticas orquestradas por microRNAs associadas com o desenvolvimento de ovário, e consequentemente, do fruto em tomateiro (Solanum lycopersicum L.), permanecem pouco exploradas. Neste trabalho, foi investigada a contribuição da via SlymiR159/GAMYB-like durante o processo de desenvolvimento do ovário e frutificação em tomateiro. O miR159 e seus alvos (SlyGAMYB1 e 2) são dinamicamente expressos durante os estágios de desenvolvimento do ovário e consequentemente do fruto. Eventos transgênicos de tomateiro (cv. Micro-Tom) apresentando super-expressão do precursor SlyMIR159 (denominados OE-159) exibiram frutificação precoce quando comparadas aos controles. Notavelment... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Fruit set, defined as the shift from quiescent ovary to a fast-growing young fruit, is a key process for fruit production in flowering plants. It has been shown that hormones (such as auxin and gibberellin) act in parallel with transcription factors during fruit set. Some of these are post-transcriptionally regulated by microRNAs (miRNAs). MiRNAs are a group of small non coding RNAs (21-22 nt) that act by regulating post-transcriptionally genes in plants and animals However, microRNA-regulated genetic pathways associated with tomato (Solanum lycopersicum L.) ovary development and fruit set remain poorly exploited. Here, we investigated the functional role of miRNA159/SlyGAMYBlike in tomato ovary development and fruit set. MiR159 and its targets were dynamically expressed in developing flowers, ovaries and fruit tissues. Transgenic tomato (cv. Micro-Tom) plants over-expressing the SlyMIR159 (termed OE-159) exhibited fruit set earlier when compared with control plants. Strikingly, all transgenic lines presented parthenocarpy fruits. Such developmental modification may be a result of the repression of SlyGAMYB1 in pre-anthesis ovaries, our data suggest that SlyGAMYB1 activity is important to prevent fruit set before pollination. In addition as a consequence of this repression, the miR167 node (miR167/SlyARF8 pathway) was mis-regulated in OE-159 ovaries. In addition, we observed that levels of auxin, gibberellin (GA) and abscisic acid (ABA) in pre-anthesis ovaries of several tran... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

El cuajado del fruto es uno de los procesos más importantes del desarrollo vegetal, de él dependen la reproducción y propagación de la planta, cuando se trata de especies silvestres, y la producción en el caso de las especies cultivadas. El estudio de los genes regulados durante este proceso es crucial para comprender mejor los mecanismos implicados y mejorar el cuajado, especialmente en condiciones ambientales adversas. El objetivo general de esta tesis es estudiar el desarrollo del carpelo y el cuajado partenocárpico en tomate, lo que servirá de base para la mejora del cuajado. Para ello se empleó la técnica de sustracción de genotecas y los datos de expresión génica de la especie modelo Arabidopsis. Además, se realizó un estudio de conservación entre ambas especies y se encontró un alto grado de correlación, superior al 75%. Para seguir profundizando en el estudio de los genes implicados en el cuajado del fruto, se realizó un análisis transcriptómico del desarrollo, cuajado normal (variedad UC82) y partenocárpico (línea RP75/59) en tomate. El estudio detallado de los genes diferencialmente expresados ha permitido determinar que en la línea RP75/59 la alta concentración de GAs en el carpelo se debe a la sobre-expresión de la GA20-oxidasa 3. Por último, en esta tesis el análisis de la generación F2 desarrollada a partir de RP75/59 y UC82 ha permitido clarificar la partenocarpia de estos materiales y desarrollar una población segregante que servirá de base para realizar el cartografiado e identificación de genes implicados en el control de este carácter. / Pascual Bañuls, L. (2010). Análisis del cuajado y desarrollo partenocárpico del fruto en solanáceas: identificación de genes implicados [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/8330

[EN] In order to identify the genes controlling developmental traits and abiotic stress tolerance in tomtato, our laboratory is performing an insertion mutagenesis program, in collaboration with the groups of Dr. Rafael Lozano (Almería University) and Dr. Mª Carmen Bolarín (CEBAS-Murcia). This PhD thesis is part of our insertion mutagenesis program and aims to keep deepening in the genetic dissection of relevant traits from an agronomic perspective using the generation and characterization of tomato T-DNA lines. With the goal of increasing the collection of tomato T-DNA lines previously generated in our group, we generated 974 new T-DNA lines. This collection of tomato T-DNA lines was evaluated in the greenhouse in order to detect dominant or semi-dominant mutants altered in vegetative and/or reproductive traits. In particular we paid special attention to mutants with changes in fruit set, since the altered genes in those mutants could play a role in the yield of tomato cultivars. The transition from ovary to a developing fruit (i.e. fruit set), occurs once the flower has reached the anthesis stage, and depends on the pollination and fecundation. However, the fruit development can also happen independently of pollination through a process named parthenocarpy. It is known that the growth regulators, mainly auxins and gibberellins, are involved in both kinds of fruit set processes. Even so, the genetic mechanisms that trigger the transition from ovary to fruit remain largely unknown. Accordingly, tomato mutants can be a valuable tool to shed light on the molecular and genetic basis that promote pollination-dependent or independent fruit set processes. Given the enormous interest raised by parthenocarpy, the work carried out in the context of this PhD thesis has been mainly focused on several seedless fruits mutants. The characterization of those mutants revealed alterations in vegetative plant development (e.g. leaf architecture) and/or reproductive development (e.g. fruit morphology) have been observed, suggesting that changes in endogenous levels of growth regulators (e.g. auxins and gibberellins) are closely related to the parthenocarpic fruit development. According to the histological analysis, most of the mutants showed cytological androsterility, and part of them also displayed deficiencies during the pollen sacs formation, a trait also related to parthenocarpic fruit development. Furthermore, it has been observed an increased fruit set rate in some parthenocarpic mutants leading to a higher fruit production per plant. Some mutants displayed a tight correlation between the alteration in floral whorls or fruit tissues and the expression of the GUS reporter gene included in the T-DNA, suggesting that the gen responsible of the mutant phenotype could be tagged by a T-DNA insert. Finally, the phenotypic, genetic and molecular characterization of the back-cross progeny of the Tom24 mutant suggests that this phenotype could be a consequence of a T-DNA insert which is not transmitted to the offspring due to a lethal effect in both types of gametes (male and female). / [ES] Con el fin de identificar genes que controlan caracteres del desarrollo y tolerancia a estrés abiótico, estamos abordando un programa de mutagénesis insercional en colaboración con los grupos del Dr. Lozano (Universidad de Almería) y la Dra. Bolarín (CEBAS-Murcia). Esta Tesis Doctoral se enmarca en el contexto de este programa de mutagénesis insercional y tiene como objetivo central seguir profundizando en la disección genética de caracteres relevantes desde un punto de vista agronómico a través de la generación y caracterización de líneas T-DNA de tomate. Con el objetivo de ampliar la colección que previamente se ha generado en nuestro grupo, se han obtenido 974 líneas T-DNA de tomate y se ha llevado a cabo la evaluación de estas líneas a fin de detectar mutantes dominantes o semidominantes afectados en caracteres vegetativos y/o reproductivos. En particular, la identificación de mutantes con cambios en el cuajado y desarrollo del fruto tiene una enorme relevancia a nivel agronómico dado que los genes alterados en estos mutantes intervienen sobre caracteres que contribuyen a la producción de un cultivar. El proceso de cuajado, es decir, la transición desde el ovario a un fruto en desarrollo, ocurre una vez la flor alcanza el estadio de antesis, y depende del éxito de la polinización y de la fecundación. No obstante, el desarrollo del fruto puede ser independiente de la polinización a través de un proceso denominado partenocarpia. En ambos procesos de cuajado, dependiente e independiente de polinización, están implicadas señales hormonales, especialmente auxinas y giberelinas (GAs). Aún así, la base genética de los mecanismos que desencadenan la transición del ovario a fruto es en gran medida desconocida. En este sentido, la disponibilidad de mutantes de tomate puede ser una herramienta muy valiosa para avanzar en el conocimiento de las bases moleculares y genéticas que promueven el cuajado del fruto dependiente e independiente de polinización. Habida cuenta del interés que suscita la partenocarpia, el trabajo realizado en el contexto de esta Tesis Doctoral se ha centrado en una serie de mutantes que desarrollan frutos sin semillas. La caracterización de estos mutantes ha permitido observar alteraciones en el desarrollo vegetativo (e.g. arquitectura foliar) y/o reproductivo (e.g. morfología del fruto) que sugieren cambios en los niveles endógenos de hormonas (e.g. auxinas y giberelinas) estrechamente vinculadas al desarrollo partenocápico del fruto. El análisis histológico ha indicado que la mayor parte de los mutantes exhiben androesterilidad citológica, y algunos también muestran alteraciones en la formación de los sacos polínicos o el desarrollo de la antera, un carácter que también está vinculado al desarrollo partenocápico del fruto. Por otro lado, se ha comprobado que la mayor tasa de cuajado de algunos mutantes partenocárpicos promueve una mayor producción por planta. En algunos mutantes se ha observado una estrecha relación entre la expresión del delator y la mutación, es decir, la actividad GUS se detecta en los órganos afectados, lo que sugiere que el gen responsable del fenotipo mutante se encuentra etiquetado por un T-DNA. Por último, la caracterización fenotípica, genética y molecular de plantas de la progenie de retrocruce del mutante Tom24 sugiere que el fenotipo se debe a un inserto de T-DNA que no se transmite a la descendencia debido a que provoca letalidad en ambos tipos de gametos (masculinos y femeninos). / [CA] Pel tal d'identificar els gens que controlen caràcters del desenvolupament i tolerància a estrès abiòtic, estem abordant un programa de mutagènesi insercional en col·laboració amb els grups del Dr. Lozano (Universidad de Almería) y la Dra. Bolarín (CEBAS-Murcia). Aquesta Tesi Doctoral s'emmarca en el context d'aquest programa de mutagènesi insercional y té l'objectiu central seguir profunditzant en la dissecció genètica de caràcters rellevants des d'un punt de vista agronòmic a través de la generació y caracterització de línies T-DNA de tomaca. Amb l'objectiu d'ampliar la col·lecció que prèviament s'ha generada en el nostre grup, s'han obtingut 974 línies T-DNA de tomaca y s'ha dut a terme l'avaluació d'aquestes línies amb la finalitat de detectar mutants dominants o semidominants afectats en caràcters vegetatius i/o reproductius. En particular, la identificació de mutants amb canvis en el quallat i desenvolupament del fruit té una enorme rellevància a nivell agronòmic atès que els gens alterats en aquests mutants intervenen sobre caràcters que contribueixen a la producció de un cultivar. El procés del quallat, és a dir, la transició des de l'ovari a un fruit en desenvolupament, passa una vegada la flor arriba a l'estadi d'antesi, y depèn de l'èxit de la pol·linització i de la fecundació. No obstant, el desenvolupament del fruit pot ser independent de la pol·linització a través d'un procés denominat partenocàrpia. En ambos processos de quallat, dependent o independent de pol·linització, estan implicats senyals hormonals, especialment auxines i gibberel·lines (GAs). Tot i així, la base genètica dels mecanismes que desencadenen la transició de l'ovari al fruit és en gran mesura desconeguda. En aquest sentit, la disponibilitat de mutants de tomaca pot ser una eina molt valuosa per a avançar en el coneixement de les bases moleculars y genètiques que promouen el quallat del fruit depenent o independent de pol·linització. Tenint en compte de l'interès que suscita la partenocàrpia, el treball realitzat en el context d'aquesta Tesi Doctoral s'ha centrat en una sèrie de mutants que desenvolupen fruits sense llavors. La caracterització d'aquests mutants ha permès observar alteracions en el desenvolupament vegetatiu (e.g. arquitectura foliar) i/o reproductiu (e.g. morfologia del fruit) que suggereixen canvis en els nivells endògens d'hormones (e.g. auxines i gibberel·lines) estretament vinculades al desenvolupament partenocàrpic del fruit. L'anàlisi histològic ha indicat que la major part del mutants exhibeixen androesterilitat citològica, i alguns també mostren alteracions en la formació del sacs pol·linics o el desenvolupament de l'antera, un caràcter que també està vinculat amb es desenvolupament partenocàrpic del fruit. D'altra banda, s'ha comprovat que la major taxa de quallat d'alguns mutants partenocàrpics promou una major producció per planta. En alguns mutants s'ha observat una estreta relació entre l'expressió del delator i la mutació, és a dir, l'activitat GUS es detecta en els òrgans afectats. Això suggereix que el gen responsable del fenotip mutant està etiquetat per un T-DNA. Per últim, la caracterització fenotípica, genètica i molecular de plantes de la progènie de retro-encreuament del mutant Tom24 suggereix que el fenotip és causa de un insert T-DNA que no es transmet a la descendència pel fet que provoca letalitat en ambos tipus de gàmetes (masculins y femenins). / Goergen, G. (2016). Generación de líneas T-DNA de tomate (Solanum lycopersicum L.), identificación de mutantes de inserción afectados en caracteres del desarrollo y caracterización de mutantes de fruto partenocárpico [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/62360

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:33:32Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2008-11-27Bitstream added on 2014-06-13T18:45:21Z : No. of bitstreams: 1 nicodemo_d_dr_jabo.pdf: 529924 bytes, checksum: 436115f2f4f07ab45288d9c5ed7c0e35 (MD5) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / O cultivo em estufas propicia a obtenção de produtos de excelente qualidade, porém, os agentes polinizadores que contribuem na maximização da produção não são adaptados a ambientes fechados. Utilizando três cultivares tipo Japonês e duas tipo Aodai de pepino (Cucumis sativus L.) foram realizados dois experimentos em três estufas localizadas na USP/Ribeirão Preto. Os objetivos foram estudar a biologia floral das cultivares no que se refere ao número de flores produzidas por planta, período de antese, porcentagem de açúcares do néctar, produção e viabilidade dos grãos de pólen, receptividade do estigma e atratividade de flores e, a importância das abelhas Jataí (Tetragonisca angustula), Iraí (Nannotrigona testaceicornis) e Africanizadas (Apis mellifera) quanto a freqüência das abelhas nas flores, tempo e tipo de coleta e produção de frutos quanto ao peso, comprimento e diâmetro. O manejo das abelhas africanizadas foi estudado e um modelo de núcleo com dois alvados desenvolvido. As flores das cultivares avaliadas têm antese de, aproximadamente, 10 horas. A viabilidade dos grãos de pólen e a receptividade do estigma não são limitantes na polinização de pepino Japonês e Aodai. Os índices de frutificação de pepino Japonês por partenocarpia são altos (78 %), porém há aumento de 19% quando ocorre polinização por abelhas. A cultivar Aodai depende dos insetos para produção de frutos, sendo que flores visitadas até às 10h30 originaram frutos mais pesados. As abelhas Africanizadas se adaptaram a colméia com dois alvados, visitando flores em parte do dia dentro da estufa, promovendo a polinização, e o restante fora, ambiente com maior oferta de recursos. / The cultivation in greenhouses allows obtaining products of excellent quality, however, the pollinators that contribute maximizing the production are not adapted to the indoor environment. Using three Japanese and two Aodai cultivars of cucumber (Cucumis sativus L.) were conducted two experiments in three greenhouses located in USP / Ribeirão Preto. The aims were to study the cultivars floral biology with regard to the number of flowers produced per plant, anthesis period, the percentage of sugars in nectar, production and viability of pollen grains, stigma receptivity and attractiveness of flowers, and the importance of Jataí (Tetragonisca angustula), Iraí (Nannotrigona testaceicornis) and Africanized honeybees (Apis mellifera) with regard to the frequency of bees in the flowers, time and type of collection and fruit weight, length and diameter. The management of Africanized bees has been studied and a hive with two entrances was developed. The anthesis period was approximately of 10 hours. The viability of pollen grains and the receptivity of stigma did not limit the pollination of Japanese cucumber and Aodai. The parthenocarpy fruit set of Japanese cucumber was high (78%), but there is an increase of 19% in fruit set when the flowers were pollinated by bees. The cultivar Aodai depends on the insects for production of fruits. Flowers visited until 10h30 originated the heaviest ones. Africanized bees adapted itself to the hive with two entrances, visiting flowers in part of the day inside the greenhouse, promoting pollination, and the rest outside, the environment with greater supply of resources.

Submitted by Deyse Queiroz (deysequeirozz@hotmail.com) on 2018-05-23T13:54:28Z No. of bitstreams: 1 JOYCE EMANUELE DE MEDEIROS - DISSERTAÇÃO PPGSA PROFISSIONAL 2013..pdf: 1718564 bytes, checksum: 08bf95bc06f72832fe2269039eb98219 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-05-23T13:54:28Z (GMT). No. of bitstreams: 1 JOYCE EMANUELE DE MEDEIROS - DISSERTAÇÃO PPGSA PROFISSIONAL 2013..pdf: 1718564 bytes, checksum: 08bf95bc06f72832fe2269039eb98219 (MD5) Previous issue date: 2013 / A partenocarpia em melancia agrega valor aos frutos, entretanto, para seu cultivo, o produtor poderá encontrar dificuldades, como: adaptação dos híbridos às condições regionais, alto preço das sementes, baixa germinação e baixo vigor das plântulas, além da necessidade de cultivar na mesma área uma variedade diploide como fonte de pólen para as triploides. Assim, objetivou-se avaliar o efeito da aplicação da citocinina CPPU, em diferentes concentrações, na indução da frutificação partenocárpica em melancieiras diploide e triploide. A pesquisa foi constituída por dois experimentos conduzidos em campo no Câmpus da UFCG, em PombalPB, no período de 15/12/2012 a 02/03/2013 utilizando-se o híbrido triploide ‘Extasy’ e a variedade diploide ‘Crimson Sweet’. Para ambos os experimentos, os tratamentos foram compostos por cinco concentrações do regulador de crescimento CPPU (0,75; 1,0; 1,5; 2,5 e 3,5 mg L-1 ) mais testemunha (polinização natural). O delineamento experimental utilizado foi o de blocos casualizados, com quatro repetições. A aplicação do CPPU ocorreu de forma exógena no ovário das flores na antese por dois dias consecutivos. As características avaliadas foram: taxa fotossintética (A), condutância estomática (gs), transpiração (E), concentração intercelular de CO2 (Ci), eficiência no uso da água (EUA), clorofilas, carotenoides, número de folhas, área foliar, massa seca das folhas, do caule e dos frutos e massa seca total, produção total e comercial, massa média dos frutos comercializáveis, número de frutos por planta, número de frutos comercializáveis por planta, índice de formato do fruto, espessura da casca e da polpa, sólidos solúveis, acidez titulável, pH, SS/AT e ácido ascórbico. O CPPU foi eficiente na indução da frutificação em melancieiras diploide ‘Crimson Sweet’ e triploide ‘Extasy’, independentemente da concentração utilizada. A concentração 2,5 mg L-1 de CPPU aplicada nas melancieiras diploides proporcionou o maior número de frutos comercializáveis por planta, maior produção total e produção comercial comparada à testemunha, já nas triploides possibilitou maior número de frutos por planta, número de frutos comercializáveis por planta, produção total e produção comercial em relação à testemunha. A indução da frutificação com CPPU na melancieira ‘Crimson Sweet’ não interferiu no acúmulo de massa seca, no crescimento e nas características fisiológicas da planta comparada à testemunha. Na ‘Extasy’, proporcionou maior acúmulo de massa seca no fruto, redução na massa seca das folhas, do caule e crescimento da planta, incremento na condutância estomática e na assimilação de CO2 quando comparada à testemunha. Nas melancieiras ‘Crimson Sweet’, a concentração de CPPU 2,5 mg L-1 proporcionou maior condutância estomática, taxa fotossintética e acúmulo de massa seca no fruto. Na melancieira ‘Extasy’, as concentrações de CPPU foram indiferente nas trocas gasosas e no crescimento da planta. / Parthenocarpy in watermelon adds value to fruits, however, for its cultivation, the producer may encounter difficulties such as: adaptation of hybrid to regional conditions, high seed prices, low germination and seedling vigor, beyond the need to cultivate, in the same area, a diploid variety as source of pollen for triploids. Thus, the objective was to evaluate the effect of application of cytokinin CPPU at different concentrations, in the induction of fruiting partenocarpic in diploid and triploid watermelon plants. The study comprised two field experiments conducted in the field in Campus of UFCG in Pombal -PB, from 12/15/2012 to 03/02/2013 using the triploid hybrid 'Extasy' and diploid variety 'Crimson Sweet'. For both experiments, treatments consisted of five concentrations of growth regulator CPPU (0.75, 1.0, 1.5, 2.5 and 3.5 mg L- 1 ) and the control (natural pollination). The experimental design was a complete randomized block designed with four replications. The application of CPPU occurred exogenously in the ovary of flowers for two consecutive days at anthesis. The variables evaluated were: photosynthetic rate (A), stomatal conductance (gs), transpiration (E), intercellular CO2 concentration (Ci), water use efficiency (EUA), chlorophylls, carotenoids, number of leaves, leaf area, dry mass of leaves, stem and fruit and total dry matter, total and marketable yield, average weight of marketable fruit , number of fruits per plant, number of marketable fruits per plant, fruit shape index, shell thickness and pulp, soluble solids, titratable acidity, pH, SS/TA and ascorbic acid. The CPPU was efficient in inducing fruiting of diploid watermelon 'Crimson Sweet' and triploid 'Extasy’, regardless of the concentration used. The concentration 2.5 mg L- 1 of CPPU applied in diploid watermelon provided the greatest number of marketable fruits per plant, higher total and marketable yield production compared to control, and in the triploid plants in increased the number of fruits per plant, number of fruits marketable per plant, total production and commercial production compared to control. Induction of fruiting with CPPU in watermelon ‘Crimson Sweet’ had no effect on dry matter accumulation, growth and physiological characteristics of the plant compared to the control. In 'Extasy', CPPU provided a greater accumulation of dry matter in the fruit decreased dry mass of leaves, stem and plant growth, increase in stomatal conductance and CO2 assimilation compared to the control. In watermelon 'Crimson Sweet' the concentration of 2.5 mg L- 1 yielded higher stomatal conductance, photosynthetic rate and dry matter accumulation in the fruit. In watermelon 'Extasy', concentrations of CPPU were indifferent gas exchange and plant growth.