Some yeast strains secrete extracellular polypeptide toxins known to have potential growth inhibitory activity on other sensitive yeast genera but are immune to their own toxins. These yeast strains are termed as killer yeasts and their toxins are designated as killer proteins or killer toxins. Killer phenotypes are classified into 11 typical types (K1-K11). The toxic actions of yeast killer proteins on sensitive cells show differences and one of the most important toxic actions involves the selective functional damage by hydrolyzing major cell wall components. Because mammalian cells lack a cell wall, novel highly selective antifungals tend to be harmless to people by targeting important cell wall components specific to fungi. We have previously characterized the K9 type yeast killer protein isolated from Hansenula mrakii. This protein is stable at pH and temperature values appropriate for its medical usage. Antifungal activity of this protein was tested against 23 human pathogenic yeast and 9 dermathophyte strains. Pathogenic yeast strains found to be susceptible and both the MIC and MFC values ranged from 0.25 to 8 &micro / g/ml except C. parapsilosis and C guilliermondii isolates. 9 dermatophyte strains were not susceptible to this protein and MICs were &gt / 64 &micro / g/ml. According to the cell killing analysis toxin activity starts within the first 4 hours and complete cell death was observed for the 4, 8 and 16 times the MIC concentrations at 24 hour. The results obtained from this study might make the potential use of this protein possible as a selective antimycotic agent.

Some yeast strains under certain conditions secrete into the medium polypeptide toxins which are inhibitory to sensitive cells. These yeast strains are termed as killer yeasts and their toxins are designated as killer proteins or killer toxins. Killer proteins are classified into 11 typical types (K1-K11). These toxins have different killing mechanisms on sensitive cells. Some of them hydrolyze major cell wall component &amp / #946 / -1,3- glucans. As mammalian cells lack cell walls research and development of novel highly selective antifungals are mostly focused on the agents which target the components of the fungal cell wall. We have previously characterized the K5 type killer protein. This protein is an exo &amp / #946 / -1,3-glucanase which is stable at pH&rsquo / s and temperatures appropriate for its medical usage. &amp / #946 / -1,3- glucan hydrolyzing activity of the K5 type killer protein highlighted the potential use of this protein as a selective antimycotic agent. Antifungal activity of the K5 type yeast killer protein was tested against 26 human pathogenic yeast and 9 dermathophyte strains and found to be affective on all of the tested strains. Toxin MIC50, MIC100 and MFC values were found to be between 0.25-4, 0.5-8, 1-8 &micro / g/ml respectively except Candida krusei isolates. Cell killing analysis revealed that toxin activity starts within first 2 hours and complete cell death time differs due to the susceptibility of strains to the K5 type yeast killer protein. K5 type yeast killer protein would be used as a novel and selective agents with the results obtained from this study.

Made available in DSpace on 2016-08-12T19:15:31Z (GMT). No. of bitstreams: 1 ShamyraGAS_Dissert.pdf: 1345668 bytes, checksum: 408f47b3e8a408dc7702858d04d13fc8 (MD5) Previous issue date: 2015-02-27 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Silk Flower [Calotropis procera (Aiton) W.T. Aiton] is a plant that has been highlighted by the case of a species that has several features such as animal feed, traditional medicine, agriculture, environment, cosmetics and textile industry, and may also act to combat pests, fungi and viruses through mechanisms defense associated with your latex. This study aimed to evaluate latex fluid from Silk Flower in inhibiting the development of pathogenic fungi of Macrophomina phaseolina, Rhizoctonia solani, Colletotrichum musae and Monosporascus cannonballus and study the genetic diversity from Silk Flower genotypes using the RAPD and ISSR molecular markers. Twenty samples of species of leaves were collected in the Grossos/RN and Mossoró/RN cities (ten plants from each city). The plants latex were tested on four different types of phytopathogenic fungi, Macrophomina phaseolina, Rhizoctonia solani, Colletotrichum musae and Monosporascus cannonballus with two different methods (adding latex to the culture medium before and after polymerization middle), and with two different concentration level (neat and diluted 1:1). For molecular analysis, DNA of each plant was extracted with 11 RAPD primers and 10 ISSR primers. For latex analyzes, it was observed that there was no inhibitory effect for any of Macrophomina phaseolina, Rhizoctonia solani, Colletotrichum musae and Monosporascus cannonballus isolates in any of the concentrations tested under the conditions studied. Molecular results showed a good standard for both amplification of DNA markers, showing the formation of different groups, and the presence of genetic variability has been detected. For the analysis with molecular markers there was the formation of the four distinct groups, and in the ISSR marker was observed the formation of six groups. When it was analyzed the two markers in a corresponding manner it was possible to detect the formation of seven distinct groups showing the existence of variability. The difference in the results of both markers can be explained by the case of two markers that covered different regions of the genome / Flor de Seda [Calotropis procera (Aiton) W.T. Aiton] é uma planta que tem recebido destaque por se tratar de uma espécie que possui diversas funcionalidades como alimentação animal, medicina tradicional, agricultura, meio ambiente, indústria cosmética e têxtil, podendo também atuar no combate à pragas, fungos e vírus através de mecanismos de defesa associados ao seu látex. Objetivou-se nesse estudo avaliar fluidos laticíferos da Flor de Seda na inibição do desenvolvimento de fungos fitopatogênicos de Macrophomina phaseolina, Rhizoctonia solani, Colletotrichum musae e Monosporascus cannonballus e estudar a divergência genética de genótipos de Flor de Seda por meio de marcadores moleculares RAPD e ISSR. Vinte amostras de folhas da espécie foram coletadas na cidade de Grossos/RN e na cidade de Mossoró/RN no Campus Leste da UFERSA (dez plantas para cada local de coleta). O látex das plantas foram testados em quatro diferentes tipos de fungos fitopatogênicos, Macrophomina phaseolina, Rhizoctonia solani, Colletotrichum musae e Monosporascus cannonballus com duas diferentes metodologias (adicionando o látex ao meio de cultura antes e após a polimerização do meio) e com dois níveis diferentes de concentração (puro e diluído 1:1). Para as análises moleculares, o DNA de cada uma das plantas foi extraído com 11 primers RAPD e 10 primers ISSR. Para as análises do látex, foi observado que não houve efeito inibitório para nenhum dos isolados de Macrophomina phaseolina, Rhizoctonia solani, Colletotrichum musae e Monosporascus cannonballus em nenhuma das concentrações testadas nas condições estudadas. Os resultados moleculares obtidos revelaram um bom padrão de amplificação para ambos os marcadores de DNA, mostrando à formação de grupos distintos, tendo sido detectada a presença de variabilidade genética. Para as análises com os marcadores RAPD houve a formação de quatro grupos distintos, e para o marcador ISSR foi possível observar a formação de seis grupos. Quando se analisou os dois marcadores de forma correlacionada foi possível detectar a formação de sete grupos distintos demonstrando a existência de variabilidade. A diferença encontrada nos resultados de ambos marcadores pode ser explicada por se tratar de dois marcadores que cobriram diferentes regiões do genoma

Made available in DSpace on 2016-08-12T19:18:49Z (GMT). No. of bitstreams: 1 ShamyraGAS_Dissert.pdf: 1345668 bytes, checksum: 408f47b3e8a408dc7702858d04d13fc8 (MD5) Previous issue date: 2015-02-27 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Silk Flower [Calotropis procera (Aiton) W.T. Aiton] is a plant that has been highlighted by the case of a species that has several features such as animal feed, traditional medicine, agriculture, environment, cosmetics and textile industry, and may also act to combat pests, fungi and viruses through mechanisms defense associated with your latex. This study aimed to evaluate latex fluid from Silk Flower in inhibiting the development of pathogenic fungi of Macrophomina phaseolina, Rhizoctonia solani, Colletotrichum musae and Monosporascus cannonballus and study the genetic diversity from Silk Flower genotypes using the RAPD and ISSR molecular markers. Twenty samples of species of leaves were collected in the Grossos/RN and Mossoró/RN cities (ten plants from each city). The plants latex were tested on four different types of phytopathogenic fungi, Macrophomina phaseolina, Rhizoctonia solani, Colletotrichum musae and Monosporascus cannonballus with two different methods (adding latex to the culture medium before and after polymerization middle), and with two different concentration level (neat and diluted 1:1). For molecular analysis, DNA of each plant was extracted with 11 RAPD primers and 10 ISSR primers. For latex analyzes, it was observed that there was no inhibitory effect for any of Macrophomina phaseolina, Rhizoctonia solani, Colletotrichum musae and Monosporascus cannonballus isolates in any of the concentrations tested under the conditions studied. Molecular results showed a good standard for both amplification of DNA markers, showing the formation of different groups, and the presence of genetic variability has been detected. For the analysis with molecular markers there was the formation of the four distinct groups, and in the ISSR marker was observed the formation of six groups. When it was analyzed the two markers in a corresponding manner it was possible to detect the formation of seven distinct groups showing the existence of variability. The difference in the results of both markers can be explained by the case of two markers that covered different regions of the genome / Flor de Seda [Calotropis procera (Aiton) W.T. Aiton] é uma planta que tem recebido destaque por se tratar de uma espécie que possui diversas funcionalidades como alimentação animal, medicina tradicional, agricultura, meio ambiente, indústria cosmética e têxtil, podendo também atuar no combate à pragas, fungos e vírus através de mecanismos de defesa associados ao seu látex. Objetivou-se nesse estudo avaliar fluidos laticíferos da Flor de Seda na inibição do desenvolvimento de fungos fitopatogênicos de Macrophomina phaseolina, Rhizoctonia solani, Colletotrichum musae e Monosporascus cannonballus e estudar a divergência genética de genótipos de Flor de Seda por meio de marcadores moleculares RAPD e ISSR. Vinte amostras de folhas da espécie foram coletadas na cidade de Grossos/RN e na cidade de Mossoró/RN no Campus Leste da UFERSA (dez plantas para cada local de coleta). O látex das plantas foram testados em quatro diferentes tipos de fungos fitopatogênicos, Macrophomina phaseolina, Rhizoctonia solani, Colletotrichum musae e Monosporascus cannonballus com duas diferentes metodologias (adicionando o látex ao meio de cultura antes e após a polimerização do meio) e com dois níveis diferentes de concentração (puro e diluído 1:1). Para as análises moleculares, o DNA de cada uma das plantas foi extraído com 11 primers RAPD e 10 primers ISSR. Para as análises do látex, foi observado que não houve efeito inibitório para nenhum dos isolados de Macrophomina phaseolina, Rhizoctonia solani, Colletotrichum musae e Monosporascus cannonballus em nenhuma das concentrações testadas nas condições estudadas. Os resultados moleculares obtidos revelaram um bom padrão de amplificação para ambos os marcadores de DNA, mostrando à formação de grupos distintos, tendo sido detectada a presença de variabilidade genética. Para as análises com os marcadores RAPD houve a formação de quatro grupos distintos, e para o marcador ISSR foi possível observar a formação de seis grupos. Quando se analisou os dois marcadores de forma correlacionada foi possível detectar a formação de sete grupos distintos demonstrando a existência de variabilidade. A diferença encontrada nos resultados de ambos marcadores pode ser explicada por se tratar de dois marcadores que cobriram diferentes regiões do genoma

O carrapato Rhipicephalus microplus é o principal ectoparasita de bovinos. O controle de R. microplus baseia-se principalmente no uso de acaricidas químicos, o que contribuiu para o problema emergente da seleção de populações de carrapatos resistentes. Portanto, há a necessidade do desenvolvimento de métodos mais eficientes/sustentáveis de controle, como o controle biológico utilizando fungos acaropatogênicos. A eficácia do fungo Metarhizium anisopliae de forma isolada ou em associação com acaricida químico para controle do carrapato bovino já foi evidenciada em condições de campo utilizando uma cepa de carrapatos resistente à acaricidas. No entanto, pouco se sabe sobre os mecanismos moleculares de R. microplus envolvidos na sua interação com M. anisopliae e com acaricidas. Assim, o objetivo do presente estudo foi avaliar a resposta de larvas de R. microplus expostas ao fungo, ao acaricida e à associação de ambos. Primeiramente foi realizado um estudo para determinar a metodologia mais indicada para avaliar o efeito in vitro do fungo M. anisopliae sobre larvas de R. microplus. Para isso, comparamos o Teste de Pacote de Larvas modificado (TPL) e o Teste de Imersão de Larvas (TIL). Os valores de tempo letal mediano (TL50) obtido na maior concentração de M. anisopliae (108conídios/mL) foram 24,8 e 9,2 dias para o TPL e TIL, respectivamente. A mortalidade após 21 dias foi de 38% e 98% para o TPL e TIL respectivamente, na mesma concentração. O TIL demonstrou ser o teste mais indicado a ser utilizado, sendo, portanto, escolhido para realização dos experimentos futuros. Em seguida foi realizado um estudo para comparar a suscetibilidade de diferentes isolados de R. microplus ao fungo M. anisopliae. Foram avaliados 67 isolados de campo. Para tanto, as larvas de R. microplus foram imersas em uma suspensão de M. anisopliae (108conídios/mL) durante 5 min. Os tempos letais medianos (TL50) variaram de 2,6 a 24,9 dias A mortalidade observada no 15º dia após o tratamento variou de 26,3 a 100% nas amostras testadas. Esses resultados demonstraram que as populações de campo de R. microplus apresentam uma alta variação em sua suscetibilidade a M. anisopliae. Por fim, foi realizada uma análise transcricional (RNAseq) de larvas de R. microplus expostas a M. anisopliae, cipermetrina, associação de ambos e do controle (não-tratado). A análise dos transcritos dos quatro grupos gerou um total de 507.792 sequências com um tamanho total de 303.160.891 pb. Foram encontrados 31 genes diferencialmente expressos no grupo controle quando comparado com M. anisopliae, 39 com cipermetrina e 73 com M. anisopliae + cipermetrina. M. anisopliae e o grupo da associação apresentaram 81 genes diferencialmente expressos e M. anisopliae e cipermetrina, 46. Houve 177 genes diferencialmente expressos ao comparar M. anisopliae + cipermetrina com larvas expostas à cipermetrina Os resultados deste estudo demonstraram que a associação M. anisopliae + cipermetrina aumentou a expressão de genes relacionados a resposta à agressão, provavelmente pelo fato da associação provocar uma agressão maior ao carrapato e este responder de forma mais rápida, levando à superexpressão de genes de defesa. As descobertas deste estudo fornecem informações sobre as vias e mecanismos moleculares de R. microplus ativados em resposta à interação de M. anisopliae e a acaricida. Além disso, esses estudos estabelecem as bases para pesquisas futuras sobre genes-chave que controlam a suscetibilidade de R. microplus a M. anisopliae. O sinergismo evidenciado em nossos estudos comprova a ideia de que o controle integrado, utilizando o controle biológico com o controle químico é uma opção tanto para o controle de cepas de carrapatos resistentes à acaricidas, quanto para um controle mais rápido de cepas de carrapatos que não apresentam resistência ou que apresentem resistência intermediária. / The tick Rhipicephalus microplus is the major cattle ectoparasite. The control of R. microplus is based mainly on the use of chemical acaricides, which contributed to the emerging problem of the selection of tick populations resistant to acaricides. Therefore, there is a need for the development of more efficient/sustainable methods of control, such as biological control using acari pathogenic fungi. The effectiveness of the fungus Metarhizium anisopliae alone or in association with chemical acaricide to control the bovine tick has already been evidenced under field conditions using an acaricide resistant tick strain. However, to date, little is known about the molecular pathways of R. microplus involved with its interaction with M. anisopliae and with acaricides. Thus, the aim of the present study is to evaluate the response of R. microplus larvae exposed to the fungus, the acaricide and the association of both. Firstly, a study was carried out to determine the most appropriate methodology to evaluate the in vitro effect of the fungus M. anisopliae on larvae of R. microplus tick. For this, we compared the Modified Larval Packet Test (LPT) and the Larval Immersion Test (LIT). The values of lethal time (LT50) obtained in the highest concentration of M. anisopliae (108conidia / mL) were 24.8 and 9.2 days for LPT and LIT, respectively. Mortality after 21 days was 38% and 98% for LPT and LIT, respectively, at the same concentration. The LIT proved to be the most indicated test to be used and was therefore chosen to carry out the following experiments Then, a study was performed to compare the susceptibility of different R. microplus isolates to M. anisopliae fungus. Sixty-seven field isolates were evaluated. For this, R. microplus larvae were immersed in a suspension of M. anisopliae (108conidia/mL) for 5 min. Lethal times (LT50) ranged from 2.6 to 24.9 days. Mortality observed on the 15th day after treatment ranged from 26.3 to 100% in the tested samples. These results demonstrated that R. microplus field populations showed a high variation in their susceptibility to M. anisopliae. Finally, a RNAseq analysis of R. microplus larvae exposed to M. anisopliae, cypermethrin, association of both or untreated (control) was performed. Analysis of the transcripts of the four groups generated a total of 507,792 sequences with a total length of 303,160,891 bp. We found 31 differentially expressed genes in the control group when compared to M. anisopliae, 39 with cypermethrin and 73 with M. anisopliae + cypermethrin. M. anisopliae and the association group had 81 differentially expressed genes and M. anisopliae and cypermethrin, 46 There were 177 differentially expressed genes when comparing M. anisopliae + cypermethrin with cypermethrin exposed larvae. The results of this study demonstrated that the association of M. anisopliae + cypermethrin increased the expression of genes related to response to aggression, possibly because the M. anisopliae + cypermethrin association causes a greater aggression to the tick and, then it could respond quickly, leading to overexpression of defense genes. The findings of this study provide information on the pathways and molecular mechanisms of R. microplus in response to the interaction of M. anisopliae and acaricides. In addition, these studies establish the basis for future research on key genes that control the susceptibility of R. microplus to M. anisopliae. The synergism evidenced in our studies confirms the idea that integrated control using biological control and chemical control is an option both for the control of acaricide resistant tick strains and for a faster control of tick strains that do not show resistance or exhibit intermediate resistance.

O carrapato Rhipicephalus microplus é o principal ectoparasita de bovinos. O controle de R. microplus baseia-se principalmente no uso de acaricidas químicos, o que contribuiu para o problema emergente da seleção de populações de carrapatos resistentes. Portanto, há a necessidade do desenvolvimento de métodos mais eficientes/sustentáveis de controle, como o controle biológico utilizando fungos acaropatogênicos. A eficácia do fungo Metarhizium anisopliae de forma isolada ou em associação com acaricida químico para controle do carrapato bovino já foi evidenciada em condições de campo utilizando uma cepa de carrapatos resistente à acaricidas. No entanto, pouco se sabe sobre os mecanismos moleculares de R. microplus envolvidos na sua interação com M. anisopliae e com acaricidas. Assim, o objetivo do presente estudo foi avaliar a resposta de larvas de R. microplus expostas ao fungo, ao acaricida e à associação de ambos. Primeiramente foi realizado um estudo para determinar a metodologia mais indicada para avaliar o efeito in vitro do fungo M. anisopliae sobre larvas de R. microplus. Para isso, comparamos o Teste de Pacote de Larvas modificado (TPL) e o Teste de Imersão de Larvas (TIL). Os valores de tempo letal mediano (TL50) obtido na maior concentração de M. anisopliae (108conídios/mL) foram 24,8 e 9,2 dias para o TPL e TIL, respectivamente. A mortalidade após 21 dias foi de 38% e 98% para o TPL e TIL respectivamente, na mesma concentração. O TIL demonstrou ser o teste mais indicado a ser utilizado, sendo, portanto, escolhido para realização dos experimentos futuros. Em seguida foi realizado um estudo para comparar a suscetibilidade de diferentes isolados de R. microplus ao fungo M. anisopliae. Foram avaliados 67 isolados de campo. Para tanto, as larvas de R. microplus foram imersas em uma suspensão de M. anisopliae (108conídios/mL) durante 5 min. Os tempos letais medianos (TL50) variaram de 2,6 a 24,9 dias A mortalidade observada no 15º dia após o tratamento variou de 26,3 a 100% nas amostras testadas. Esses resultados demonstraram que as populações de campo de R. microplus apresentam uma alta variação em sua suscetibilidade a M. anisopliae. Por fim, foi realizada uma análise transcricional (RNAseq) de larvas de R. microplus expostas a M. anisopliae, cipermetrina, associação de ambos e do controle (não-tratado). A análise dos transcritos dos quatro grupos gerou um total de 507.792 sequências com um tamanho total de 303.160.891 pb. Foram encontrados 31 genes diferencialmente expressos no grupo controle quando comparado com M. anisopliae, 39 com cipermetrina e 73 com M. anisopliae + cipermetrina. M. anisopliae e o grupo da associação apresentaram 81 genes diferencialmente expressos e M. anisopliae e cipermetrina, 46. Houve 177 genes diferencialmente expressos ao comparar M. anisopliae + cipermetrina com larvas expostas à cipermetrina Os resultados deste estudo demonstraram que a associação M. anisopliae + cipermetrina aumentou a expressão de genes relacionados a resposta à agressão, provavelmente pelo fato da associação provocar uma agressão maior ao carrapato e este responder de forma mais rápida, levando à superexpressão de genes de defesa. As descobertas deste estudo fornecem informações sobre as vias e mecanismos moleculares de R. microplus ativados em resposta à interação de M. anisopliae e a acaricida. Além disso, esses estudos estabelecem as bases para pesquisas futuras sobre genes-chave que controlam a suscetibilidade de R. microplus a M. anisopliae. O sinergismo evidenciado em nossos estudos comprova a ideia de que o controle integrado, utilizando o controle biológico com o controle químico é uma opção tanto para o controle de cepas de carrapatos resistentes à acaricidas, quanto para um controle mais rápido de cepas de carrapatos que não apresentam resistência ou que apresentem resistência intermediária. / The tick Rhipicephalus microplus is the major cattle ectoparasite. The control of R. microplus is based mainly on the use of chemical acaricides, which contributed to the emerging problem of the selection of tick populations resistant to acaricides. Therefore, there is a need for the development of more efficient/sustainable methods of control, such as biological control using acari pathogenic fungi. The effectiveness of the fungus Metarhizium anisopliae alone or in association with chemical acaricide to control the bovine tick has already been evidenced under field conditions using an acaricide resistant tick strain. However, to date, little is known about the molecular pathways of R. microplus involved with its interaction with M. anisopliae and with acaricides. Thus, the aim of the present study is to evaluate the response of R. microplus larvae exposed to the fungus, the acaricide and the association of both. Firstly, a study was carried out to determine the most appropriate methodology to evaluate the in vitro effect of the fungus M. anisopliae on larvae of R. microplus tick. For this, we compared the Modified Larval Packet Test (LPT) and the Larval Immersion Test (LIT). The values of lethal time (LT50) obtained in the highest concentration of M. anisopliae (108conidia / mL) were 24.8 and 9.2 days for LPT and LIT, respectively. Mortality after 21 days was 38% and 98% for LPT and LIT, respectively, at the same concentration. The LIT proved to be the most indicated test to be used and was therefore chosen to carry out the following experiments Then, a study was performed to compare the susceptibility of different R. microplus isolates to M. anisopliae fungus. Sixty-seven field isolates were evaluated. For this, R. microplus larvae were immersed in a suspension of M. anisopliae (108conidia/mL) for 5 min. Lethal times (LT50) ranged from 2.6 to 24.9 days. Mortality observed on the 15th day after treatment ranged from 26.3 to 100% in the tested samples. These results demonstrated that R. microplus field populations showed a high variation in their susceptibility to M. anisopliae. Finally, a RNAseq analysis of R. microplus larvae exposed to M. anisopliae, cypermethrin, association of both or untreated (control) was performed. Analysis of the transcripts of the four groups generated a total of 507,792 sequences with a total length of 303,160,891 bp. We found 31 differentially expressed genes in the control group when compared to M. anisopliae, 39 with cypermethrin and 73 with M. anisopliae + cypermethrin. M. anisopliae and the association group had 81 differentially expressed genes and M. anisopliae and cypermethrin, 46 There were 177 differentially expressed genes when comparing M. anisopliae + cypermethrin with cypermethrin exposed larvae. The results of this study demonstrated that the association of M. anisopliae + cypermethrin increased the expression of genes related to response to aggression, possibly because the M. anisopliae + cypermethrin association causes a greater aggression to the tick and, then it could respond quickly, leading to overexpression of defense genes. The findings of this study provide information on the pathways and molecular mechanisms of R. microplus in response to the interaction of M. anisopliae and acaricides. In addition, these studies establish the basis for future research on key genes that control the susceptibility of R. microplus to M. anisopliae. The synergism evidenced in our studies confirms the idea that integrated control using biological control and chemical control is an option both for the control of acaricide resistant tick strains and for a faster control of tick strains that do not show resistance or exhibit intermediate resistance.

A antracnose, que tem como agentes causais os fungos Colletotrichum gloeosporioides e C. acutatum, é uma das principais doenças que afetam a cultura da goiabeira. Não há no Brasil, fungicidas registrados para o controle da doença em pós-colheita. Em vista disso e da preocupação em relação à saúde humana e o respeito ao ambiente vem crescendo pesquisas envolvendo a utilização de agentes alternativos para o controle de doenças. Foi verificado em trabalho prévio que a levedura S. cerevisiae, apresentou atividade antagônica in vitro contra vários fitopatógenos, dentre eles C. gloeosporioides. Essa inibição foi atribuída à produção de uma mistura de compostos orgânicos voláteis (COVs), sendo que os álcoois 3-metil-1-butanol (3M1B) e 2-metil-1-butanol (2M1B) foram apontados como os principais responsáveis por essa atividade. Considerando a importância do manejo pós-colheita e o potencial da utilização de COVs no controle da antracnose, os objetivos desse trabalho foram avaliar o efeito in vitro dos COVs 3M1B e 2M1B identificados a partir de S. cerevisiae no desenvolvimento de Colletotrichum sp, elucidar alguns dos possíveis mecanismos de ação atuantes no processo inibitório e avaliar a utilização dos COVs no controle pós-colheita da antracnose em frutos de goiaba. Foi observado aumento da inibição do crescimento micelial dos fitopatógenos à medida que houve aumento da concentração dos compostos, chegando a 100% a partir da dose de 1µL mL-1 de ar. Os menores valores de MIC50 para C. gloeosporioides e C. acutatum, foram 0,34 e 0,31 quando tratados com os compostos 3M1B e a mistura 3M1B:2M1B (10:1; v/v), respectivamente. Ambos os fitopatógenos retomaram o crescimento quando transferidos para novo meio na ausência dos COVs, caracterizando a natureza fungistática da inibição. A esporulação de C. acutatum também foi totalmente inibida nas doses testadas. Também foram observados efeitos negativos sobre a produção de biomassa fúngica por C. gloeosporioides e C. acutatum, em média 64,9% e 55,4% menores, respectivamente, após a exposição aos COVs. Com relação aos possíveis mecanismos de ação atuantes no processo inibitório, os ensaios indicam que os voláteis podem causar aumento na permeabilidade da membrana plasmática, tendo como consequência a perda de eletrólitos. Foram verificados maiores níveis de peroxidação dos lipídios de membrana quando expostos aos voláteis, indicando um possível processo de estresse oxidativo. Não foram verificadas alterações significativas no conteúdo de proteínas do micélio dos fitopatógenos. O potencial de utilização do 3M1B no controle da antracnose em pós-colheita foi avaliado em frutos inoculados com C. acutatum e posteriormente tratados com o volátil por 10h. A incidência e a severidade da doença nos frutos tratados alcançaram valores 5 e 6,25 vezes maiores, respectivamente, quando comparado com o controle no último dia de avaliação. Também foi avaliado o efeito do tratamento sobre qualidades físico-químicas dos frutos, e não foram observadas alterações em nenhum dos parâmetros avaliados. Os COVs utilizados nesse estudo são capazes de interferir no desenvolvimento de C. gloeosporioides e C. acutatum, porém nas condições experimentais do trabalho, mostraram-se inadequados para o controle da antracnose em goiaba. / The anthracnose, which has as causal agents the fungi Colletotrichum gloeosporioides and C. acutatum, is one of the main diseases that affect guava plants. In Brazil, there are not fungicides registered for the control of the disease in post-harvest conditions. This aspect and the concern about human health and the environment, made increase researches involving the use of alternative agents to control diseases. In a previous study, it was shown that the yeast S. cerevisiae exhibited antagonistic activity in vitro against several pathogens, including C. gloeosporioides. This inhibition was attributed to the production of a mixture of volatile organic compounds (VOCs), and the alcohols 3-methyl-1-butanol (3M1B) and 2-methyl-1-butanol (2M1B) were identified as the main ones, responsible for the activity. Considering the importance of post-harvest management and the potential use of VOCs in the anthracnose control, the objectives of this study were the evaluation of the in vitro effect of 3M1B and 2M1B VOCs identified from S. cerevisiae on the development of Colletotrichum, the elucidation of some of the possible mechanisms acting during the inhibitory process and the evaluation of the use of VOCs in postharvest anthracnose control of guava fruits. An increased inhibition was observed in mycelial growth of the pathogens as the concentration of the compounds increased, reaching 100% of inhibition in the dose 1L mL-1 of air. The lowest values of MIC50 for C. gloeosporioides and C. acutatum were 0.34 and 0.31, respectively when treated with the compound 3M1B and the mixture 3M1B:2M1B (10:1; v/v). Both pathogens regained growth when transferred to a new medium in the absence of VOCs, thus characterizing the fungistatic nature of the inhibition. The sporulation of C. acutatum was also completely inhibited at all tested doses. There were negative effects on the production of fungal biomass by C. gloeosporioides and C. acutatum, being 64.9% and 55.4% lower on average, respectively, after exposure to VOCs. Regarding the possible mechanisms actinng in the inhibitory process, the results indicated that the volatiles could increase the permeability of the plasma membrane, resulting in the loss of electrolytes. It was observed higher levels of peroxidation of membrane lipids when exposed to volatiles, suggesting a oxidative stress process. There were not significant alterations in protein content of the pathogen mycelium. The potential use of 3M1B in postharvest anthracnose control was evaluated in fruits inoculated with C. acutatum and subsequently treated for 10h with the volatile. The incidence and severity of disease in the treated fruits showed values 5 and 6.25 higher, respectively, when compared to the control treatment on the last day of evaluation. The effect of treatment was evaluated on the physico-chemical quality of the fruits, and no changes were observed in any of the parameters. The VOCs used in this study are able to interfere on the development of C. gloeosporioides and C. acutatum, but, under the experimental conditions of the work, the VOCs were not adequate to control the anthracnose of guava.

A levedura Saccharomyces cerevisiae tem potencial para o controle de doenças em algumas plantas, devido à capacidade de induzir resistência e de elicitar mecanismos de defesa. Entretanto, no processo de purificação de compostos elicitores presentes na parede celular de S. cerevisiae foi observado um baixo rendimento, dificultando a realização de experimentos, principalmente em campo. Assim, com o objetivo de otimizar o processo de extração do (s) elicitor (es) presentes na parede celular da levedura, células em suspensão foram autoclavadas por minutos ou horas, uma vez ou seqüencialmente. Em seguida, foi avaliado o conteúdo de carboidratos e de proteínas destas preparações que foram testadas na produção de fitoalexinas em mesocótilos de sorgo, previamente tratados ou não com abrasivo carborundum, e na germinação de conídios e formação de apressórios por Colletotrichum lagenarium e Colletotrichum sublineolum. Em função da maior concentração de carboidratos e da atividade elicitora em mesocótilos de sorgo, a preparação de levedura autoclavada por 4 horas seqüencialmente foi submetida ao processo de purificação. Cromatografias de troca iônica (CTI), com tampão Tris-HCl ou bicarbonato de amônio na eluição da coluna DEAE-Celulose, foram realizadas para separar as frações com maior poder elicitor das de baixo poder elicitor. Frações de ambas as cromatografias, induziram o acúmulo de fitoalexinas em mesocótilos de sorgo, previamente tratados ou não com abrasivo carborundum. Entretanto, frações provenientes da cromatografia com tampão bicarbonato de amônio foram capazes de inibir em 100% a germinação de conídios e a formação de apressórios dos fitopatógenos. Na proteção de pepino em câmara de crescimento, houve redução da área lesionada somente quando as plântulas de pepino receberam as frações provenientes da CTI com tampão Tris-HCl, dois dias antes da inoculação com o patógeno. Em casa-de-vegetação, fração proveniente da CTI com tampão bicarbonato de amônio conferiu proteção às plântulas de pepino contra C. lagenarium, mas sem aumento na atividade de peroxidases. Plantas de sorgo tratadas com as frações de ambas as cromatografias, apresentaram tendência a uma redução da área lesionada nas folhas tratadas e folhas superiores, com produção de fitoalexinas. A maior produção de fitoalexinas em plantas de sorgo foi observada em folhas tratadas com a preparação bruta da levedura autoclavada por 4 horas seqüencialmente. Os resultados do presente trabalho indicam a existência de compostos termoestáveis na parede celular da levedura, liberados em maior concentração em função da autoclavagem seqüencial, capazes de induzir o acúmulo de fitoalexinas em mesocótilos e folhas de sorgo, com atividade antifúngica sobre C sublineolum e C. lagenarium e potencial para induzir resistência local em pepino contra C. lagenarium e resistência local e sistêmica em sorgo contra C. sublineolum. / The yeast Saccharomyces cerevisiae has potential in the control of diseases in some plants by the ability to induce resistance and elicits defence mechanisms. However, in the process of purification of elicitor (s) present in the cell wall of S. cerevisiae a low efficiency was observed during the process, making difficult to carry out experiments, mainly in field. Thus, to optimize the process of extraction of the elicitor (s) present in the cell wall of the yeast, cells in suspension were autoclaved by minutes or hours, once or in sequence. After autoclaving the carbohydrate and proteins content of these preparations were determinate and they were tested in phytoalexin accumulation in sorghum mesocotyls, previously treated or not with the abrasive carborundum, and conidia germination and appressorium formation by Colletotrichum lagenarium and Colletotrichum sublineolum. Because of the higher carbohydrate content and the highest elicitor activity in sorghum mesocotyls, the preparation autoclaved by 4 hours in sequence was selected for the purification process. Ion exchange chromatography (IEC) using Tris-HCl or ammonium bicarbonate buffer for column elution, were used to separate fractions with higher elicitation activity from those exhibiting lower elicitation activity. Fractions from the chromatography obtained using either buffer induced the accumulation of phytoalexin in sorghum mesocotyls, previously treated or not with the abrasive carborundum. However, the fractions from the chromatography with ammonium bicarbonate buffer were able to inhibit in 100% the conidia germination and appressorium formation by the phytopathogens. In the protection of cucumber in growth chamber, there was a reduction in symptoms only when the cucumber seedlings were treated with the fractions from the IEC with Tris-HCl buffer, two days before the inoculation with the fungus. In greenhouse, fraction from the IEC with ammonium bicarbonate buffer was able to protect cucumber seedlings against C. lagenarium, but without increase peroxidases activity. Sorghum plants treated with the fractions, obtained using either buffer, exhibited reduced infection in the treated leaves and leaves just above, with phytoalexin production. The highest phytoalexin production in sorghum plants was observed in leaves treated with the crude preparation of the yeast autoclaved by 4 hours sequentially. The results of the present study indicate the presence of termoestable compounds in the cell wall of the yeast, released in higher concentrations in function of the sequential autoclavage, that are able to induce phytoalexin accumulation in sorghum mesocotyls and leaves, with antifungal activity on C. sublineolum and C. lagenarium and potential to induce local resistance in cucumber against C. lagenarium and local and systemic resistance in sorghum against C. sublineolum.

Colletotrichum species are considered one of the most economically important plant pathogens. They cause many losses in tropical, subtropical and temperate regions affecting a wide range of plant species. In tropical and subtropical regions C. gloeosporioides and C. acutatum are associated with significant losses on pre and post-harvest anthracnoses. There are still many features to understand about Colletotrichum biology and its systematics. The accurate identification of species involved with each anthracnose is of high relevance to establish management strategies to control the disease. Although the great advances on Colletotrichum systematics, species complex such as C. gloeosporioides and C. acutatum are used in a broad sense in Brazil. These complexes were recently investigated and showed to be highly genetic and geographic variable. In this study multigene analysis were carried out based on ITS, GAPDH, CHS-1, TUB2 and CAL or HIS3 partial sequences for strains of C. gloesporioides and C. acutatum complexes collected from fruit crops in Brazil. Strains from different countries and exepitypes and others sequences available on GenBank from the species accepted on both complexes were added on dataset. Six strains from C. gloeosporiodes complex and five for C. acutatum were selected based on multigene phylogeny to investigate the pathogenicity through inoculations on detached fruit. The multigene phylogenies showed the occurrence of species in Brazil related to those complexes with a high genetic variability among them. The phylogeny of Brazilian strains belonging to the C. gloeosporioides complex showed that C. siamense represents the most genetically and host-specific variable clade. In contrast, C. asianum clade grouped only strains isolated from mango. The strains from this clade used on pathogenic test were not able to infect avocado and one of the strains caused symptoms only on mango. All strains from Brazil grouped in one subclade within the C. fructicola clade and seem to represent a genetically distinct group. C. theobromicola is first reported causing anthracnose on acerola fruit. Three new species (C. polyphialidicum, C. paranaense and C. pruni) belonging to the C. acutatum complex were recognized and their morphologic descriptions were provided. The pathogenic test for the strains in the C. acutatum complex showed their cross infection ability, but in some cases the larger lesions were produced on the original host. Most brazilian strains from C. acutatum complex grouped in one subclade within the C. nymphaeae clade and seem to be genetically distinct. / Fungos do gênero Colletotrichum são considerados um dos mais importantes economicamente na Fitopatologia. Espécies desse gênero são encontradas amplamente disseminadas e estão associadas a diversas espécies de plantas hospedeiras. Em regiões tropicais e subtropicais, espécies dos complexos C. gloeosporioides e C. acutatum são a principal causa das antracnoses em pré e póscolheita de frutos e consequentemente causam significantivas perdas. Ainda há muitos aspectos a serem compreendidos sobre o gênero Colletotrichum, como a biologia e a sistemática. A acurada identificação das espécies associadas a antracnoses é de suma importância para o estabelecimento de estratégias de controle. No entanto, apesar dos grandes avanços na sistemática desse gênero, complexos de espécies como aquelas citadas acima são tratados de modo genérico no Brasil. Estes complexos de espécies foram recentemente estudados e considerados geneticamente e geograficamente variáveis. Neste sentido, o presente trabalho teve como objetivo caracterizar isolados de Colletotrichum spp. associados a diferentes frutos e regiões do Brasil por meio de análise filogenética. Para análise multilocus, foram utilizadas sequências parciais dos genes ITS, GAPDH, CHS-1, TUB2 and CAL ou HIS3. Sequências de espécies-tipos disponíveis no GenBank e de isolados de diferentes países foram adicionadas ao conjunto de dados. Com base nos resultados obtidos por meio de filogenia multilocus, seis isolados do complexo C. gloeosporiodes e cinco do complexo C. acutatum foram escolhidos para testes de patogenicidade cruzada. A espécie C. siamense, pertencente ao complexo C. gloeosporioides, foi a mais variável geneticamente e quanto ao hospedeiro de origem. Diferentemente, apenas isolados obtidos de manga se agruparam no clado C. asianum. Isolados agrupados neste clado não infectaram abacate e um dos isolados (CPC 20969) causou sintomas apenas em manga. No clado C. fructicola, isolados coletados no Brasil se agruparam em um subclado e parecem representar um grupo geneticamente distinto. A espécie C. theobromicola é relatada pela primeira vez em acerola. Foram identificadas três novas espécies, C. polyphialidicum, C. paranaense e C. pruni, pertencentes ao complexo C. acutatum. Isolados brasileiros agrupados no clado C. nymphaeae parecem representar um grupo geneticamente distinto, todos se agruparam em um subclado. Isolados do complexo C. acutatum utilizados no teste de patogenicidade provocaram sintomas nos hospedeiros testados, porém, em algumas inoculações, as lesões foram maiores no hospedeiro de origem.

O carrapato Rhipicephalus microplus é o principal ectoparasita de bovinos. O controle de R. microplus baseia-se principalmente no uso de acaricidas químicos, o que contribuiu para o problema emergente da seleção de populações de carrapatos resistentes. Portanto, há a necessidade do desenvolvimento de métodos mais eficientes/sustentáveis de controle, como o controle biológico utilizando fungos acaropatogênicos. A eficácia do fungo Metarhizium anisopliae de forma isolada ou em associação com acaricida químico para controle do carrapato bovino já foi evidenciada em condições de campo utilizando uma cepa de carrapatos resistente à acaricidas. No entanto, pouco se sabe sobre os mecanismos moleculares de R. microplus envolvidos na sua interação com M. anisopliae e com acaricidas. Assim, o objetivo do presente estudo foi avaliar a resposta de larvas de R. microplus expostas ao fungo, ao acaricida e à associação de ambos. Primeiramente foi realizado um estudo para determinar a metodologia mais indicada para avaliar o efeito in vitro do fungo M. anisopliae sobre larvas de R. microplus. Para isso, comparamos o Teste de Pacote de Larvas modificado (TPL) e o Teste de Imersão de Larvas (TIL). Os valores de tempo letal mediano (TL50) obtido na maior concentração de M. anisopliae (108conídios/mL) foram 24,8 e 9,2 dias para o TPL e TIL, respectivamente. A mortalidade após 21 dias foi de 38% e 98% para o TPL e TIL respectivamente, na mesma concentração. O TIL demonstrou ser o teste mais indicado a ser utilizado, sendo, portanto, escolhido para realização dos experimentos futuros. Em seguida foi realizado um estudo para comparar a suscetibilidade de diferentes isolados de R. microplus ao fungo M. anisopliae. Foram avaliados 67 isolados de campo. Para tanto, as larvas de R. microplus foram imersas em uma suspensão de M. anisopliae (108conídios/mL) durante 5 min. Os tempos letais medianos (TL50) variaram de 2,6 a 24,9 dias A mortalidade observada no 15º dia após o tratamento variou de 26,3 a 100% nas amostras testadas. Esses resultados demonstraram que as populações de campo de R. microplus apresentam uma alta variação em sua suscetibilidade a M. anisopliae. Por fim, foi realizada uma análise transcricional (RNAseq) de larvas de R. microplus expostas a M. anisopliae, cipermetrina, associação de ambos e do controle (não-tratado). A análise dos transcritos dos quatro grupos gerou um total de 507.792 sequências com um tamanho total de 303.160.891 pb. Foram encontrados 31 genes diferencialmente expressos no grupo controle quando comparado com M. anisopliae, 39 com cipermetrina e 73 com M. anisopliae + cipermetrina. M. anisopliae e o grupo da associação apresentaram 81 genes diferencialmente expressos e M. anisopliae e cipermetrina, 46. Houve 177 genes diferencialmente expressos ao comparar M. anisopliae + cipermetrina com larvas expostas à cipermetrina Os resultados deste estudo demonstraram que a associação M. anisopliae + cipermetrina aumentou a expressão de genes relacionados a resposta à agressão, provavelmente pelo fato da associação provocar uma agressão maior ao carrapato e este responder de forma mais rápida, levando à superexpressão de genes de defesa. As descobertas deste estudo fornecem informações sobre as vias e mecanismos moleculares de R. microplus ativados em resposta à interação de M. anisopliae e a acaricida. Além disso, esses estudos estabelecem as bases para pesquisas futuras sobre genes-chave que controlam a suscetibilidade de R. microplus a M. anisopliae. O sinergismo evidenciado em nossos estudos comprova a ideia de que o controle integrado, utilizando o controle biológico com o controle químico é uma opção tanto para o controle de cepas de carrapatos resistentes à acaricidas, quanto para um controle mais rápido de cepas de carrapatos que não apresentam resistência ou que apresentem resistência intermediária. / The tick Rhipicephalus microplus is the major cattle ectoparasite. The control of R. microplus is based mainly on the use of chemical acaricides, which contributed to the emerging problem of the selection of tick populations resistant to acaricides. Therefore, there is a need for the development of more efficient/sustainable methods of control, such as biological control using acari pathogenic fungi. The effectiveness of the fungus Metarhizium anisopliae alone or in association with chemical acaricide to control the bovine tick has already been evidenced under field conditions using an acaricide resistant tick strain. However, to date, little is known about the molecular pathways of R. microplus involved with its interaction with M. anisopliae and with acaricides. Thus, the aim of the present study is to evaluate the response of R. microplus larvae exposed to the fungus, the acaricide and the association of both. Firstly, a study was carried out to determine the most appropriate methodology to evaluate the in vitro effect of the fungus M. anisopliae on larvae of R. microplus tick. For this, we compared the Modified Larval Packet Test (LPT) and the Larval Immersion Test (LIT). The values of lethal time (LT50) obtained in the highest concentration of M. anisopliae (108conidia / mL) were 24.8 and 9.2 days for LPT and LIT, respectively. Mortality after 21 days was 38% and 98% for LPT and LIT, respectively, at the same concentration. The LIT proved to be the most indicated test to be used and was therefore chosen to carry out the following experiments Then, a study was performed to compare the susceptibility of different R. microplus isolates to M. anisopliae fungus. Sixty-seven field isolates were evaluated. For this, R. microplus larvae were immersed in a suspension of M. anisopliae (108conidia/mL) for 5 min. Lethal times (LT50) ranged from 2.6 to 24.9 days. Mortality observed on the 15th day after treatment ranged from 26.3 to 100% in the tested samples. These results demonstrated that R. microplus field populations showed a high variation in their susceptibility to M. anisopliae. Finally, a RNAseq analysis of R. microplus larvae exposed to M. anisopliae, cypermethrin, association of both or untreated (control) was performed. Analysis of the transcripts of the four groups generated a total of 507,792 sequences with a total length of 303,160,891 bp. We found 31 differentially expressed genes in the control group when compared to M. anisopliae, 39 with cypermethrin and 73 with M. anisopliae + cypermethrin. M. anisopliae and the association group had 81 differentially expressed genes and M. anisopliae and cypermethrin, 46 There were 177 differentially expressed genes when comparing M. anisopliae + cypermethrin with cypermethrin exposed larvae. The results of this study demonstrated that the association of M. anisopliae + cypermethrin increased the expression of genes related to response to aggression, possibly because the M. anisopliae + cypermethrin association causes a greater aggression to the tick and, then it could respond quickly, leading to overexpression of defense genes. The findings of this study provide information on the pathways and molecular mechanisms of R. microplus in response to the interaction of M. anisopliae and acaricides. In addition, these studies establish the basis for future research on key genes that control the susceptibility of R. microplus to M. anisopliae. The synergism evidenced in our studies confirms the idea that integrated control using biological control and chemical control is an option both for the control of acaricide resistant tick strains and for a faster control of tick strains that do not show resistance or exhibit intermediate resistance.