For the past 20 years, chronic kidney disease (CKD) has remained one of the major causes of death worldwide. Cardiovascular events account for approximately 50% of deaths in CKD patients, underscoring the clinical relevance of the observed cardiac changes. These changes define uremic cardiomyopathy (UCM) and include left-ventricular hypertrophy (LVH), LV dilatation, and LV systolic and diastolic dysfunction. LVH is seen as the primary manifestation of UCM and is caused by a multitude of different systems including in-creased pre- and afterload and the renin-angiotensin system (RAS). More recent studies found that myocardial dysfunction is apparent before changes in the ventricular geome-try, like hypertrophy, occur to the uremic heart. This leads to the conclusion that LVH is not the cause of cardiac dysfunction, but one of the alterations caused by factors related to the uremic state itself. Among these factors that are independent of pressure and vol-ume overload, are cardiotonic steroids as well as the parathyroid hormone and the endo-thelin (ET-1) system. But we suggest a different substance to play an important role in UCM: Urea. Patients in end-stage renal disease (ESRD) display increased oxidative stress and urea has been found to increase levels of oxidative stress, at least in endothelial cells. Therefore, we investigated the effect that elevated urea levels, as seen in patients undergoing dialysis, have on cardiomyocytes. As the oxidative stress in a cell is regulated by mitochondrial processes, we suspected the mitochondrial orchestrator PGC-1α to play an important role. The uremic heart is in a state of elevated oxidative stress. This has been presented by multiple authors before. By conducting immunofluorescent staining for reactive oxygen species (ROS), we tried to replicate their findings and illustrate elevated levels of ROS. As the fluorescence analysis did not bear significant results, we approached oxidative stress from a different angle: Via mass spectrometry, we looked at the amino acids methionine, cysteine and betaine which are highly involved in sustaining the oxidative balance in the cell. Our findings in the media of urea-treated HL-1 cells lead us to the conclusion, that these cardiomyocytes were in a state of low antioxidative resources. Next, to find the intracellular mechanisms that connect uremia to oxidative stress and compromised energetics, we investigated possible downstream effectors of uremia. The urea-treated cardiomyocytes exhibited significant alterations regarding upstream effec-tors of PGC-1α: The protein kinases Akt and Erk were expressed and phosphorylated dif-ferently in a western blot analysis of uremic h9c2 cells and in mice with induced kidney failure. To combine these findings regarding the protein kinases Akt and Erk and oxidative stress, the Erk/p38 pathways seems conclusive (figure 20). This pathway links uremia and oxidative stress to intracellular effectors that have been found to influence the develop-ment of uremic cardiomyopathy. Another life-threatening alteration in uremic cardiomyopathy is a corrupted cardiac func-tion. The myocardium of uremic patients has shown to be more susceptible to ischemic damage and most patients receiving dialysis experience repeated episodes of intradialytic impairments in cardiac function. The urea-treated cardiomyocytes had a significantly higher oxygen consumption rate due to an inefficiently increased metabolism, most likely caused by an increased level of uncoupling. Taken together, the results of this study indicate that urea by itself plays a role in the de-velopment of uremic cardiomyopathy. So-called high-physiologic levels of urea have led to a mitochondrial inefficiency and an increase of oxidative stress in cardiomyocytes. The protein kinases Akt and Erk may work as effectors of urea to induce these changes via the Erk/p38 pathway. It seems very likely that the mitochondrial changes are mediated by the mitochondrial orchestrator PGC-1α. These observations might lead to further studies in-vestigating urea levels in dialysis patients. In the future, these might lead to a change of practice regarding tolerated urea levels in dialysis and help reduce the cardiac mortality of patients with chronic kidney disease. / Chronische Niereninsuffizienz ist eine der häufigsten Todesursachen weltweit. Da etwa die Hälfte dieser Todesfälle auf kardiovaskuläre Ursachen zurückzuführen sind, ist ein genaues Verständnis der kardialen Veränderungen entscheidend. Zu diesen zählen links-ventrikuläre Hypertrophie, linksventrikuläre Dilatation sowie systolischer und diastoli-scher Funktionsverlust. Zusammen prägen diese Veränderungen den Begriff der Urämischen Kardiomyopathie (UCM). Verschiedene Systeme spielen bei UCM zusammen, wie beispielsweise eine erhöhte Vor- und Nachlast und das Renin-Angiotensin-Aldosteron-System (RAAS). Sie führen zur primären Manifestation der UCM: Die linksventrikuläre Hypertrophie (LVH). Allerdings konnten aktuellere Studien zeigen, dass die Funktion des urämischen Myokards bereits abnimmt, noch bevor Veränderungen der Ventrikelstruktur, wie Hypertrophie, messbar sind. Demnach ist LVH nicht einzig die Ursache des kardialen Funktionsverlusts, sondern eine von vielen Veränderungen bei chronischer Niereninsuffi-zienz. Zu den Faktoren, die unabhängig von Blutdruck und Volumensteigerung sind und eine Rolle bei den oben geschilderten Veränderungen spielen, gehören kardiotonische Steroide, das Parathyroidhormon und das Endothelinsystem (ET-1-System). Wir sehen Grund zur Annahme, dass Urea (Harnstoff) ein weiterer dieser Faktoren ist, der zu Verän-derungen des Herzmuskels führt und die Entstehung von UCM begünstigt. Dialysepatien-ten haben ein erhöhtes Level an oxidativem Stress und es wurde gezeigt, dass Urea in Endothelzellen zu erhöhtem oxidativem Stress führt. Deshalb behandelten wir Kardiomyozyten mit sogenannten hochphysiologischen Urea-Konzentrationen und untersuchten diese anschließend. Dabei setzten wir einen Schwerpunkt auf mitochondriale Prozesse, die zu erhöhtem oxidativen Stress führen können. Unser Interesse galt dabei insbesonde-re dem Transkriptionsfaktor PGC-1α, der als Regulator der Mitochondrien und Dirigent des intrazellulären Metabolismus gilt. Um ebenfalls erhöhte Konzentrationen von oxidativem Stress nachzuweisen, experimen-tierten wir mit immunofluoreszenten Färbungen. Hierdurch konnten wir nur einen Trend ohne Signifikanz feststellen. Deshalb näherten wir uns dem Problem aus einer anderen Richtung: mittels Massenspektrometrie. Wir untersuchten die Aminosäuren Methionin, Cystein und Betain, die für die Regulation des oxidativen Gleichgewichts wichtig sind. Im Medium von mit Urea behandelten HL-1 Zellen konnten wir nachweisen, dass die untersuchten Kardiomyozyten signifikant geringere Konzentrationen an antioxidativ wirkenden Aminosäuren hatten. Als nächstes untersuchten wir die intrazellulären Mechanismen zwischen Urämie und oxidativem Stress. In den mit Urea behandelten h9c2 Zellen und im Mausmodell fand sich eine signifikante Konzentrationssteigerung der Proteinkinase B (PKB/Akt) und Proteinkinase Erk. Diese Enzyme beeinflussen auch den Transkriptionsfaktor PGC-1α. Zusammenfüh-ren lassen sich unsere bisherigen Ergebnisse mittels der Erk/p38 Signalskaskade (Abb. 20). Urämie führt darin über Oxidativem Stress zu einer Beeinflussung intrazellulärer Effektoren, die zur Entstehung von Urämischer Kardiomyopathie beitragen. Eine weitere lebensbedrohliche Komplikation von Urämischer Kardiomyopathie ist die Verringerung der Herzfunktion. Bei urämischen Patienten ist das Myokard anfälliger für ischämiebedingten Schaden und bei den meisten Dialysepatienten zeigen sich wiederholt Episoden, in denen die Herzfunktion geschwächt ist. In der Zellkultur konnten wir dazu passende Veränderungen nachweisen. Aufgrund eines ineffizienten Metabolismus verbrauchten die mit Urea behandelten Zellen signifikant mehr Sauerstoff. Ursache dafür ist wahrscheinlich ein vermehrtes Entkoppeln (Uncoupling) der Mitochondrien. Zusammengefasst zeigt diese Studie, dass Urea in der Entwicklung von Urämischer Kardiomyopathie eine wichtige Rolle spielt. Hoch-physiologische Konzentrationen von Urea im Blut führen über die Erk/p38 Signalkaskade und die Proteinkinasen PKB und Erk zu einer ineffizienten Funktion der Mitochondrien und erhöhen den intrazellulären oxidativen Stress. Wir halten es für wahrscheinlich, dass der Transkriptionsfaktor PGC-1α die dazu führenden mitochondrialen Veränderungen reguliert. Diese Erkenntnisse können weitere Studien anregen, die die tolerierte Konzentration von Urea bei Dialysepatienten untersu-chen. Zukünftig kann dies zu einer strengeren Einstellung der Urea-Werte bei Dialysepati-enten führen. Möglicherweise lässt sich dadurch die Mortalität der Patienten mit chroni-scher Niereninsuffizienz senken.

Die Verfütterung von Fetten mit mehrfach ungesättigter Fettsäuren (PUFA) stellt seit Jahren eine nebenwirkungsfreie Alternative in der Behandlung atopischer Erkrankungen wie der Caninen Atopischen Dermatitis (CAD) dar. Zahlreiche Studien belegen die antiinflammatorische Wirkung der PUFA und die damit verbundene Besserung der klinischen Symptomatik. Diese antiinflammatorische Wirkung kommt auf molekularer Ebene zustande, indem die supplementierten Fettsäuren die Eigenschaften zellulärer Membranen verändern, intrazelluläre Signalwege und Enzyme beeinflussen sowie die Expression verschiedener Gene modulieren. Die cytosolische Phospholipase A2 (cPLA2) stellt eines der Schlüsselenzyme im Rahmen der Synthese proinflammatorischer Eikosanoide dar, die allergische Symptome wie Juckreiz und Hautrötungen bedingen. Sie spaltet bevorzugt Arachidonsäure (AA) aus der sn2-Position membranständiger Phospholipide ab und stellt somit das Substrat für die Synthese von Entzündungsmediatoren wie Prostaglandinen, Leukotrienen und Thromboxanen zur Verfügung. Peroxisomen-Proliferator-aktivierte Rezeptoren (PPAR) gehören zur Großfamilie der Kernrezeptoren. Besonders die Isoform PPARγ ist an der Regulation der Expression verschiedener proinflammatorischer Proteine beteiligt, wie z.B. der Cyclooxygenase (COX). PUFA gehören zu den natürlichen Liganden dieser Rezeptoren, was die Vermutung nahe legt, dass zumindest ein Teil der Wirkungen über die Beeinflussung dieser Rezeptoren vermittelt wird. Über die Beeinflussung der Expression des cPLA2-Gens durch PPAR existieren zurzeit noch keine Erkenntnisse. Mastzellen spielen eine zentrale Rolle im Rahmen der Pathogenese allergischer Erkrankungen. Auf einen allergenen Stimulus hin sind sie in der Lage, präformierte (z.B. Histamin) und de novo synthetisierte Entzündungsmediatoren (z.B. Eikosanoide) freizusetzen und damit die für allergische Erkrankungen typischen Symptome hervorzurufen. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war es, an einer caninen Mastozytomzelllinie (C2) die zeitabhängigen Effekte der Supplementierung des Zellkulturmediums mit jeweils 20 μM n3- PUFA (α-Linolensäure LE, C18:3n3; Eikosapentaensäure EPA, C20:5n3) und n6-PUFA (Linolsäure LA, C18:2n6; Arachidonsäure AA, C20:4n6) auf das Wachstum, das zelluläre Fettsäurenmuster, die Histaminfreisetzung, die Aktivität und Expression der cPLA2 sowie die Expression von PPARγ zu untersuchen. Vergleichend wurden die C2 auch im Grundmedium kultiviert. Zur Untersuchung des Einflusses der PUFA auf das Wachstum der Zellen erfolgte die Kultivierung über einen Zeitraum von 8 Tagen. Um die zeitabhängigen Effekte feststellen zu können, wurden die Zellen 6 h, 48 h bzw. 6 Tage in den entsprechenden Medien bzw. dem Grundmedium kultiviert und danach die folgenden Verfahren angewendet. – Bestimmung des zellulären Fettsäurenmusters mittels Gaschromatographie (GC) – Bestimmung der Histaminfreisetzung mit Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) – Bestimmung der Aktivität der cPLA2 über Messung der freigesetzten [3H]Arachidonsäure – Bestimmung der Expression der cPLA2 und des PPARγ mittels Western Blot. Die Ergebnisse zeigen, dass die Fettsäuren-Supplementierung keinerlei Auswirkung auf das Zellwachstum hat. Sie führt aber zur Anreicherung der jeweils angebotenen Fettsäure sowie ihrer Elongations- und Desaturierungsprodukte. Die Effekte auf die spontane und auch auf die Mastoparan-stimulierte Histaminfreisetzung waren zeitabhängig sehr unterschiedlich. Die Zugabe der Fettsäuren hatte auf die spontane cPLA2-Aktivität der Zellen nur bei längerer Kultivierungsdauer (6 d) einen Einfluss, wobei es zu einer Minderung der Aktivität nach PUFA- Gabe kam. Im Gegensatz dazu zeigten die Mastoparan-stimulierten C2 nur nach 6- stündiger Kultivierung eine signifikante Erhöhung der cPLA2-Aktivität in den mit den n6-FS supplementierten Medien. Die cPLA2-Expression war in ihrer Höhe von der Kultivierungsdauer abhängig. Nach 6 h zeigten die PUFA-supplementierten C2 eine im Vergleich zum Grundmedium gesteigerte Expression, unabhängig von der Art der zugesetzten Fettsäure. Nach 48 h war die Expression in den C20-PUFA-supplementierten C2 deutlich erhöht, während sie nach 6-tägiger Kultivierung in den mit C20-PUFA angereicherten Medien signifikant reduziert war. Der fehlende Zusammenhang zwischen der Aktivität des Enzyms und der Höhe der cPLA2-Expression lassen auf eine unterschiedliche Regulation dieser beiden Parameter schließen. Die PPARγ-Expression verhielt sich, besonders nach 48-stündiger und 6- tägiger Kultivierung, umgekehrt zur cPLA2-Expression. Dabei deutet das annähernd gegensätzliche Verhalten von cPLA2 und PPARγ nach 48 h und 6 d auf eine mögliche Beteiligung des Kernrezeptors an der Regulation der cPLA2-Expression hin. Aus den vorliegenden Untersuchungen geht somit deutlich hervor, dass die C2 mit der cPLA2 und dem PPARγ zwei bedeutende Regulatoren von Entzündungsprozessen exprimieren und somit als Modell zur Erforschung der Pathogenese der CAD geeignet sind.

No description available.

No description available.

No description available.

Die Verfütterung von Fetten mit mehrfach ungesättigter Fettsäuren (PUFA) stellt seit Jahren eine nebenwirkungsfreie Alternative in der Behandlung atopischer Erkrankungen wie der Caninen Atopischen Dermatitis (CAD) dar. Zahlreiche Studien belegen die antiinflammatorische Wirkung der PUFA und die damit verbundene Besserung der klinischen Symptomatik. Diese antiinflammatorische Wirkung kommt auf molekularer Ebene zustande, indem die supplementierten Fettsäuren die Eigenschaften zellulärer Membranen verändern, intrazelluläre Signalwege und Enzyme beeinflussen sowie die Expression verschiedener Gene modulieren. Die cytosolische Phospholipase A2 (cPLA2) stellt eines der Schlüsselenzyme im Rahmen der Synthese proinflammatorischer Eikosanoide dar, die allergische Symptome wie Juckreiz und Hautrötungen bedingen. Sie spaltet bevorzugt Arachidonsäure (AA) aus der sn2-Position membranständiger Phospholipide ab und stellt somit das Substrat für die Synthese von Entzündungsmediatoren wie Prostaglandinen, Leukotrienen und Thromboxanen zur Verfügung. Peroxisomen-Proliferator-aktivierte Rezeptoren (PPAR) gehören zur Großfamilie der Kernrezeptoren. Besonders die Isoform PPARγ ist an der Regulation der Expression verschiedener proinflammatorischer Proteine beteiligt, wie z.B. der Cyclooxygenase (COX). PUFA gehören zu den natürlichen Liganden dieser Rezeptoren, was die Vermutung nahe legt, dass zumindest ein Teil der Wirkungen über die Beeinflussung dieser Rezeptoren vermittelt wird. Über die Beeinflussung der Expression des cPLA2-Gens durch PPAR existieren zurzeit noch keine Erkenntnisse. Mastzellen spielen eine zentrale Rolle im Rahmen der Pathogenese allergischer Erkrankungen. Auf einen allergenen Stimulus hin sind sie in der Lage, präformierte (z.B. Histamin) und de novo synthetisierte Entzündungsmediatoren (z.B. Eikosanoide) freizusetzen und damit die für allergische Erkrankungen typischen Symptome hervorzurufen. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war es, an einer caninen Mastozytomzelllinie (C2) die zeitabhängigen Effekte der Supplementierung des Zellkulturmediums mit jeweils 20 μM n3- PUFA (α-Linolensäure LE, C18:3n3; Eikosapentaensäure EPA, C20:5n3) und n6-PUFA (Linolsäure LA, C18:2n6; Arachidonsäure AA, C20:4n6) auf das Wachstum, das zelluläre Fettsäurenmuster, die Histaminfreisetzung, die Aktivität und Expression der cPLA2 sowie die Expression von PPARγ zu untersuchen. Vergleichend wurden die C2 auch im Grundmedium kultiviert. Zur Untersuchung des Einflusses der PUFA auf das Wachstum der Zellen erfolgte die Kultivierung über einen Zeitraum von 8 Tagen. Um die zeitabhängigen Effekte feststellen zu können, wurden die Zellen 6 h, 48 h bzw. 6 Tage in den entsprechenden Medien bzw. dem Grundmedium kultiviert und danach die folgenden Verfahren angewendet. – Bestimmung des zellulären Fettsäurenmusters mittels Gaschromatographie (GC) – Bestimmung der Histaminfreisetzung mit Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) – Bestimmung der Aktivität der cPLA2 über Messung der freigesetzten [3H]Arachidonsäure – Bestimmung der Expression der cPLA2 und des PPARγ mittels Western Blot. Die Ergebnisse zeigen, dass die Fettsäuren-Supplementierung keinerlei Auswirkung auf das Zellwachstum hat. Sie führt aber zur Anreicherung der jeweils angebotenen Fettsäure sowie ihrer Elongations- und Desaturierungsprodukte. Die Effekte auf die spontane und auch auf die Mastoparan-stimulierte Histaminfreisetzung waren zeitabhängig sehr unterschiedlich. Die Zugabe der Fettsäuren hatte auf die spontane cPLA2-Aktivität der Zellen nur bei längerer Kultivierungsdauer (6 d) einen Einfluss, wobei es zu einer Minderung der Aktivität nach PUFA- Gabe kam. Im Gegensatz dazu zeigten die Mastoparan-stimulierten C2 nur nach 6- stündiger Kultivierung eine signifikante Erhöhung der cPLA2-Aktivität in den mit den n6-FS supplementierten Medien. Die cPLA2-Expression war in ihrer Höhe von der Kultivierungsdauer abhängig. Nach 6 h zeigten die PUFA-supplementierten C2 eine im Vergleich zum Grundmedium gesteigerte Expression, unabhängig von der Art der zugesetzten Fettsäure. Nach 48 h war die Expression in den C20-PUFA-supplementierten C2 deutlich erhöht, während sie nach 6-tägiger Kultivierung in den mit C20-PUFA angereicherten Medien signifikant reduziert war. Der fehlende Zusammenhang zwischen der Aktivität des Enzyms und der Höhe der cPLA2-Expression lassen auf eine unterschiedliche Regulation dieser beiden Parameter schließen. Die PPARγ-Expression verhielt sich, besonders nach 48-stündiger und 6- tägiger Kultivierung, umgekehrt zur cPLA2-Expression. Dabei deutet das annähernd gegensätzliche Verhalten von cPLA2 und PPARγ nach 48 h und 6 d auf eine mögliche Beteiligung des Kernrezeptors an der Regulation der cPLA2-Expression hin. Aus den vorliegenden Untersuchungen geht somit deutlich hervor, dass die C2 mit der cPLA2 und dem PPARγ zwei bedeutende Regulatoren von Entzündungsprozessen exprimieren und somit als Modell zur Erforschung der Pathogenese der CAD geeignet sind.

No description available.

Die peroxisomalen ABC-Transporter Pxa1p und Pxa2p sind Halbtransporter. Genetische Studien ergaben Hinweise, dass sie zur Bildung aktiver Transporter heterodimerisieren und am Import von langkettigen Fettsäuren in die Peroxisomen von S. cerevisiae beteiligt sind. Es wurden epitopmarkierte Varianten der Proteine als Komplex isoliert. Damit wurde gezeigt, dass Pxa1p und Pxa2p ein stabiles Heterodimer bilden. Zur Charakterisierung der ATP Bindeeigenschaften wurden die Transporter mit 8-azido-[alpha-32P]-ATP inkubiert und kovalent verknüpft. Dabei konnte gezeigt werden, dass Pxa1p und Pxa2p eine unsymmetrische Bindung des ATP Analogons aufweisen. Pxa2p bindet deutlich mehr azido-ATP als Pxa1p, bei sehr ähnlichen Dissoziationskonstanten. Die reduzierte ATP Bindung von Pxa1p spiegelt sich durch degenerierte Sequenzmotive der an der ATP Bindung beteiligten Sequenzen wieder. Die isolierten ABC-Transporter wurden für ATPase Messungen eingesetzt. Sie zeigten eine basale ATPase Aktivität, die durch Zugabe langkettiger Coenzym A aktivierter Fettsäuren, wie Oleoyl-CoA und Palmitoyl-CoA stimulierbar war. Eine Lysin Mutation im Walker A Motiv von Pxa1p hatte keine Funktionalitätseinbuße zur Folge. Dieselbe Mutation bei Pxa2p führte im Wachstumstest auf Festmedium mit Ölsäure als Kohlenstoffquelle zu einem deutlich verlangsamten Wachstum. Diese Ergebnisse korrespondieren mit der beobachteten unsymmetrischen ATP Bindung von Pxa1p und Pxa2p, da bei dem schwächer bindenden Pxa1p die Mutation wirkungslos blieb. Keine Übereinstimmung war bei den ATPase Aktivitätsmessungen der aufgereinigten Mutanten zu verzeichnen. Beide Mutanten zeigten eine unbeeinträchtigte ATPase Aktivität. Die ABC-Transporter wurden in Proteoliposomen eingebaut und für Transportmessungen mit einem Spin-Label markierten Oleoyl-CoA verwendet. Die Transportmessungen zeigten einen ATP abhängigen Transport, woraus geschlossen wurde, dass Pxa1p-Pxa2p tatsächlich Coenzym A Ester langkettiger Fettsäuren transportiert. / The peroxisomal ABC-transporters Pxa1p and Pxa2p are half transporters. Previous genetic investigations have demonstrated that Pxa1p and Pxa2p have to dimerise in order to build a functional transporter, which is very likely involved in the import of long chain fatty acids into peroxisomes of S. cerevisiae. In this work, tagged versions of the proteins were purified as a complex. This proved for the building of a stable hetero dimer. For characterisation of the ATP binding properties, the transporters were incubated and cross linked with 8-azido-[alpha-32P]-ATP. This revealed an asymmetric binding of the ATP analogue. Pxa2p binds much more azido-ATP, than Pxa1p, while the dissociation constants are rather similar. The poorer ATP binding of Pxa1p is reflected by degenerated sequence motifs in the nucleotide binding fold. The purified ABC-transporters have been used for ATPase assays. They showed a basal ATPase activity, which could be stimulated by addition of long chain fatty acid CoAs, like oleoyl-CoA and palmitoyl-CoA. Mutants with a lysine mutation in the walker A motive of Pxa1p led to no functional impairment, while the corresponding lysine mutation in Pxa2p led to reduced growth on agar plates with oleic acid as sole carbon source. The result corresponds with the ATP binding properties of Pxa1p. Because of the poorer ATP binding, even in the wild type protein, the mutation was not supposed to have a big influence. No accordance was found in respect to the ATPase measurements of the isolated mutant proteins. Both mutants revealed unaffected ATPase activity. The purified ABC-transporters were reconstituted in proteoliposomes and used for translocation assays of a spin-labelled oleoyl-CoA derivative. The measurements revealed an ATP dependent transport of the oleoyl-CoA analogue. This led to the conclusion, that Pxa1p-Pxa2p is indeed the transporter of long chain acetyl CoA esters, which were transported in an ATP dependent manner.