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Design et synthèse stéréocontrôlée d’oligoglycomimétiques de type phostone et hydroxylamine / Design and stereocontrolled synthesis of phostones and hydroxylamine-type glycomimetics

Ferry, Angélique 08 November 2013 (has links)
L’importance des oligosaccharides, et plus particulièrement des β-glucanes et des mannanes, dans les processus biologiques, confère à ces familles de biomolécules des propriétés riches et variées. Celles-ci permettent d’envisager des applications potentielles dans de nombreux domaines, et notamment dans le cas de problèmes de santé publique majeurs, tels que les maladies cardiovasculaires, le cancer ou encore les infections. Néanmoins, malgré les énormes avancées faites en glycochimie, la synthèse d’oligosaccharides à longue chaîne reste un défi synthétique important. La synthèse de glycomimétiques, proches structurellement des sucres naturels et accessibles via une chimie efficace, nous a semblé judicieuse. Inspirés du design des glycomimétiques existants, nous avons élaboré la synthèse de deux mimes du centre anomérique : le premier de type phosphonate et le second de type hydroxylamine.Le lien phosphonate a été choisi car il nous permet de garder un centre stéréogène sur la position anomérique, donnant ainsi la possibilité de créer les deux configurations α et β. Ceci nécessite cependant l’élaboration d’une synthèse stéréosélective. Le lien inter-résidus a donc été construit par couplage stéréosélectif entre une espèce phosphonite-borane diastéréopure et un alcool de type phostone, suivi d’une oxydation stéréospécifique de la fonction phosphonite-borane en phosphonate. Les phosphonite-boranes ont été obtenus en cinq étapes à partir du D-glucal (Schéma 2). L’étape clé de couplage passe par un mécanisme faisant intervenir deux activations successives de la fonction phosphorée apportant la réactivité nécessaire pour une attaque de l’alcool. Des stéréosélectivités variables ont été obtenues en fonction des conditions réactionnelles et du groupement protecteur en position 2 du substrat de départ. Cependant, seuls des alcools primaires peuvent être introduits. Trois dimères phostone-phostone possédant un lien (1→6) ont ainsi été obtenus. Le choix du lien hydroxylamine a été motivé par le fait que la barrière d’inversion de l’azote dans ce type de fonction est faible, ce qui implique que l’atome d’azote n’est pas stéréogène. Cette particularité permet d’éviter une synthèse stéréosélective du centre anomérique. De plus, les hydroxylamines étant peu basiques, elles ne seront pas protonées en milieu physiologique et pourraient donc être de bons mimes des glycanes naturels. Le lien inter-résidus a été construit via une double amination réductrice entre un dialdéhyde et une hydroxylamine portée par une pipéridine polyhydroxylée. Ces deux composés ont été obtenus par un processus diastéréo- et énantiosélectif à partir du cyclopentadiénylure de sodium. La combinaison de deux groupements protecteurs Boc sur l’hydroxylamine s’est révélée être la plus adéquate pour le bon déroulement de l’étape clé de double amination réductrice. Cette séquence implique deux étapes « one-pot » consistant en la formation d’une dioxime, qui subit dans un second temps une réduction, pour former l’hétérocycle. Ce processus de création du lien inter-résidus a pu être réitéré avec succès pour la synthèse d’un dimère / The importance of oligosaccharides in biological processes and particularly β-glucanes and mannanes, gives to these families of biomolecules numerous properties. These natural polymers may find potential applications in many areas, particularly in the case of major public health problems such as cardiovascular disease, cancer or infections.Despite many advances in this field, many challenges remain particularly pertaining to the assembly of higher oligosaccharides. The synthesis of glycomimetics, structurally close to natural sugars and accessible via an efficient chemistry could be an alternative. Inspired by the known glycomimetics, we have elaborated the synthesis of two new mimetics of the anomeric center: cyclic phosphonate (phostone) and hydroxylamine. The phosphonate linkage was chosen because it contains a stereogenic center on the anomeric position, with the possibility to create the two configurations α and β via a stereoselective synthesis. The linkage was built by a stereoselective coupling step between a diastereopure phosphonite-borane and a phostone-type alcohol, followed by a stereospecific oxidation of the phosphonite-borane function into phosphonate. The phosphonite-boranes were obtained in five steps from D-glucal (Scheme 2). The mechanism of the key coupling step involves two successive activations of the phosphorus function for the alcohol attack. Different stereoselectivities were obtained depending on the reaction conditions and the protecting group on the position 2. However, only primary alcohols can be introduced. Three phostone-phostone dimers possessing a (1→6) linkage were synthesized.The choice of the hydroxylamino linkage was motivated by the fact that the nitrogen barrier of inversion in this type of function is low, which means that the nitrogen is not stereogenic. This characteristic avoids a stereoselective synthesis of the anomeric center. Moreover, hydroxylamines being weakly basic, they won’t be protonated in physiological conditions and could be good mimetics of natural glycans. The linkage was built via a double reductive amination between a dialdehyde and a hydroxylamine carried by a polyhydroxylated piperidine. These two compounds were obtained by a diastereo- and enantioselective process from sodium cyclopentadienylide. The combinaison of two Boc protecting groups on the hydroxylamine proved to be the most appropriate for the key double reductive amination. This process consists in a « one-pot » two-steps sequence consisting in the formation of a dioxime, followed by its reduction to form the heterocycle. This process could be successfully reiterated for dimer and trimer synthesis
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Chemoselective synthesis of functional drug conjugates

Kasper, Marc-André 15 January 2020 (has links)
In der vorliegenden Arbeit wird eine modulare Reaktionssequenz von zwei aufeinanderfolgenden chemoselektiven Umwandlungen vorgestellt: Es wird gezeigt, dass Vinyl- und Ethynylphosphonamidate chemoselektiv mit Cysteinen von Proteinen und Antikörpern reagieren. Weiterhin wird gezeigt, dass elektrophile Phosphonamidate durch eine vorhergehende chemoselektive Staudinger-Phosphonit Reaktion zwischen Aziden und ungesättigten Phosphoniten in das gewünschte Molekül eingebaut werden können. Hierbei wird ein elektronenreiches Phosphonit in ein elektronenarmes Phosphonamidat umgewandelt, welches somit für die nachfolgende Thiol-Addition aktiviert wird. Die beschriebene Methode erweitert das bestehende Repertoire von Biokonjugationen durch die Einführung eines neuen Konzepts: Eine chemoleselektive Reaktion, die Reaktivität für eine nachfolgende Biokonjugation induziert. Da Phosphonamidat-Konjugationen an Cysteine herausragende Eigenschaften, wie hohe Selektivität für Cysteine, saubere Reaktionsprodukte und eine hervorragende Stabilität mitbringen, wird im zweiten Teil beschrieben wie Phosphonamidate für die Anbindung von zytotoxischen Wirkstoffen an tumor-bindende Antikörper genutzt werden können um Antikörper-Wirkstoff-Konjugate (ADCs) herzustellen. Ein einfaches Syntheseprotokoll für die Herstellung, ausgehend von einem nicht gentechnisch veränderten Antikörper mit nur geringen Überschüssen des Wirkstoffs wird vorgestellt. Phosphonamidat-verbundene ADCs zeigen im direkten Vergleichen zum zugelassenen, Maleimid-verbundenen Adcetris überlegende Eigenschaften, wie eine erhöhte Stabilität in Serum und eine erhöhte in vivo Wirksamkeit in einem Tumor Mausmodel. Zusammenfassend verbindet die hier vorgestellte Methode einen einfachen synthetischen Zugang mit hoher Selektivität, überragender Konjugat-Stabilität und der Möglichkeit hochwirksame Wirkstoffkonjugate herzustellen und wird daher aller Voraussicht nach einen großen Beitrag zum Gebiet der zielgerichteten Therapie leisten. / The present work introduces a modular reaction sequence of two chemoselective manipulations in a row. It is shown that vinyl- and ethynylphosphonamidates react selectively with cysteine residues on proteins and antibodies. Most importantly, those electrophilic phosphonamidates can be incorporated into a given molecule in another preceding chemoselective Staudinger-phosphonite reaction (SPhR) from unsaturated phosphonites and azides. During this reaction, an electron-rich phosphonite is transformed into an electron-deficient phosphonamidate that is thereby activated for the subsequent thiol addition. The described technique thereby extends the existing repertoire of bioconjugations by introducing a new concept in protein synthesis: A chemoselective reaction that induces reactivity for a subsequent bioconjugation. Since phosphonamidate conjugations to cysteine hold outstanding features such as high selectivity for cysteine, clean reaction products and excellent stability of the protein adducts in biological environments, it is described in the second part of the present work how ethynylphosphonamidates can be employed for the conjunction of tumor-sensing antibodies and cytotoxic drugs to generate Antibody-Drug-Conjugates (ADCs). A simple synthetic protocol starting from unengineered antibodies, using only a slight excess of the desired drug in a one-pot synthesis protocol is introduced. In a direct comparison to the maleimide containing FDA-approved Adcetris, phosphonamidate linked ADCs show a superior behaviour in terms of linkage stability in serum, combined with an increased in vivo efficacy in a tumor xenograft mouse model. Taken together, the method described herein combines simple synthetic access with high selectivity, superior conjugate stability and the possibility to synthesize highly efficacious drug conjugates and is therefore likely to have a great contribution to the field of targeted therapeutics.
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Ubiquitin-phosphonamidates and -phosphonothiolates for DUB targeting and protein ubiquitination

Schwagerus, Sergej 18 January 2022 (has links)
Im ersten Teil dieser Arbeit wurde die Staudinger-Phosphonit-Reaktion auf Azidohomoalanin-haltiges Ubiquitin angewendet, um ortsspezifisch modifizierte Alkinphosphonamidat-Ubiquitine zu erzeugen. Diese Ubiquitin-basierten Sonden wurden bei neutralem pH-Wert in selektiven Konjugationen mit DUBs, die ein Cystein im aktiven Zentrum beinhalten, eingesetzt, auch in Anwesenheit anderer Thiole. Dabei beobachteten wir DUB-Spezifitäten in Abhängigkeit von der Phosphonamidat-Position innerhalb der Sonde. Die DUB-Selektivität konnte auch an Pull-Down-Experimenten aus Zelllysaten gezeigt werden. Zusätzlich konnte die Cystein-Selektivität der Sonde an ausgewählten konjugierten DUBs mittels MS/MS-Analyse nachgewiesen werden. Wir beobachteten auch unterschiedliche Ausmaße der DUB-Inhibition bei der Inkubation mit den verschiedenen Phosphonamidat-Sonden. Im Hinblick auf das DUB-Targeting in lebenden Zellen untersuchten wir auch Bedingungen für zellpenetrierende Peptid-konjugierte Ubiquitine für einen Transport der Sonde in das Zytosol der Zellen. Im zweiten Teil der Arbeit haben wir die neuartige, chemisch induzierte Phosphonothiolat Elektrophile für Thiol-Konjugation angewendet, um unhydrolysierbare ubiquitinierte Substrate herzustellen. Es gelang uns, ein hoch elektrophiles Ubiquitin-Vinylphosphonothiolat mit guter Ausbeute zu erzeugen. Wir konnten die frisch hergestellte Sonde in Konjugationen mit Cysteinen an ausgewählten Proteinen einsetzen. Um unser Konzept zu etablieren, generierten wir ein monoubiquitiniertes α-Synuclein und demonstrierten dessen strukturelle Integrität in einer enzymatischen Ubiquitinierung des Konjugats. Außerdem stellten wir ein künstlich K48-verknüpftes Diubiquitin her, das von spezifischen Antikörpern ähnlich erkannt wurde wie das native K48-verknüpfte Diubiquitin, aber in Gegenwart von DUBs sich als stabil erwies. Das Ubiquitin-Vinylphosphonothiolat zeigte ebenfalls eine selektive DUB-Konjugation, wenn nur kurze Inkubationszeiten verwendet wurden. / In the first part of this thesis a Staudinger-phosphonite reaction was applied on azidohomoalanine-containing ubiquitin to generate site-specifically modified alkynephosphonamidate ubiquitins. These ubiquitin-based probes were utilized in selective conjugations of active site cysteine-containing DUBs at neutral pH, even in the presence of other thiols. Furthermore, we observed DUB specificities depending on the phosphonamidate position within the probe. The selectivity could also be demonstrated in pull-down experiments from cell lysates. Moreover, the probe’s cysteine selectivity within chosen conjugated DUBs could be determined using MS/MS analysis. Consequently, we observed varying extents of DUB inhibition upon incubation with the different phosphonamidate probes. For DUB targeting in living cells we also investigated conditions of cell penetrating peptide conjugated ubiquitin in order to successfully deliver them to the cytosol. In the second part of this thesis, we applied the novel chemically induced phosphonothiolate electrophiles for thiol conjugation to produce unhydrolyzable ubiquitinated substrates. Starting from a disulfide-activated cysteine ubiquitin mutant, we managed to generate a highly electrophilic ubiquitin vinylphosphonothiolate in satisfactory yield. We could apply the freshly prepared probe in conjugations with cysteines on selected proteins, in which the conjugation product showed to be remarkably stable. To establish our concept, we prepared monoubiquitinated α-synuclein and demonstrated its structural integrity in the performance of an enzymatical ubiquitination of the conjugate. Furthermore, we produced an artificially K48-linked diubiquitin, which was similarly recognized by specific antibodies as the native K48-linked diubiquitin and was not hydrolyzed in the presence of DUBs. The ubiquitin vinylphosphonothiolate displayed also selective DUB conjugation, when only short incubations were used.

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