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The progress on mapping ubiquitin signaling using photocrosslinking mono and di-ubiquitin probes and other ubiquitin moieties

Braxton, Courtney N 01 January 2018 (has links)
Ubiquitin (Ub) is a small, 76 amino acid, and post-translational modification (PTM) protein in eukaryotes. Modification of a substrate protein via the covalent attachment of the C-terminal glycine of Ub to the ε-amino group of lysine residues in a substrate is termed ubiquitination. Unlike, other PTM proteins, Ub can form polyUb chains at one or more of its seven lysine residues. (K6, K11, K27, K29, K33, K48, and K68). The consequence of these different polymerization sites is altered biological response with different polyUb linkages conferring different fates to target proteins. Unfortunately, the study of these chains have been limited by the inability to generate homogeneous polyUbs chains linked at known lysine residues. Furthermore, a three step enzymatic cascade consisting of activating-enzymes (E1s), conjugating enzymes (E2s), and ligase enzymes (E3s) tightly controls this modification. In response, our laboratory has developed a system that creates polyUb chains through bacterial expression and "synthetic" building blocks. Now, the main questions are what do these chains interact with in the cell and how do these interactions mediate biological responses? In an attempt to answer these questions, this dissertation looks at different molecular techniques created to capture the transient interactions of monoUb and diUb probes with Ub substrates, such as, ubiquitin binding domains (UBDs) and conjugating E2 enzymes. One molecular technique focuses on the use of incorporating a genetically encoded, photo-crosslinker, p-Benzoyl-L-phenylalanine (pBpa) into diUb probes to capture their interaction with UBDs. This sets the foundation for understanding Ub’s cellular signaling recognition of UBDs. Another technique is creating diUb probes that contain lysine derivatives, Nε-L-Thiaprolyl-L-lysine (ThzK) or Nε-L-Cysteinyl-L-lysine (CysK), and can form a disulfide bonds with E2 enzymes to capture their complex, opening an opportunity to understand mechanistically the role E2 enzymes have with polyUb chain formation. Herein, these techniques are established to help unravel the complexity of Ub signaling.

Mikrophasenseparation von photo-vernetzbaren Blockcopolymeren in dünnen Filmen / micro-phase separation of photo-crosslinkable block copolymers in thin layers

Tietz, Katharina 15 December 2014 (has links)
No description available.

Site-specific Incorporation of p-Azido-L-phenylalanine for Photo-crosslinking Nucleic Acids

Sullivan, Gabriel 03 January 2023 (has links)
Current methods for studying RNA binding proteins (RBPs) combine the use of ultraviolet (UV) crosslinking and immunoprecipitation (CLIP) to analyze RNA-protein interactions. An underexplored alternative approach is using site-specific incorporation of photoactivatable non-canonical amino acids (ncAAs) to enhance the crosslinking efficiency of many CLIP protocols. This thesis describes the incorporation of the photo-crosslinking unnatural amino acid p-azido-L-phenylalanine (AzF) into the Hepatitis C Virus (HCV) non-structural protein 3 helicase (NS3h) for photo-crosslinking and in vitro analysis of the potential binding sites found within the HCV RNA genome. From the five potential sites identified from the NS3h crystal structure for AzF incorporation, two sites, E503AzF and Q580AzF, allowed for nucleic acid photo-crosslinking with fluorescently labelled DNA substrates. We further tested if these mutations adversely affected NS3h and binding activity through a molecular beacon helicase assay and fluorescence polarization methods. We found that E503AzF unexpectedly had a faster unwinding rate than wild type (WT) NS3h and managed to have a similar binding affinity to the tested DNA substrate. Finally, we found that there was a 5-fold increase in the photo-crosslinking efficiency of nucleic acids for E503AzF NS3h mutant compared to our WT NS3h at 254 nm UV light. We are currently working on methods for our CLIP-based protocol to ensure quality RNA footprint generation and purification from photo-crosslinked NS3h. Other work contained in this thesis consists of using Prevotella sp. P5-125 Cas13b (PspCas13b), a clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) RNA-targeting system, which has been previously shown to knockdown viral RNA and mRNA through designable guide CRISPR RNA (crRNA). Here we incorporated the photo-crosslinking ncAA AzF into PspCas13b to irreversibly bind the crRNA in an attempt to enhance knockdown efficiency and longevity of viral and mRNA targets. We were able to design a crRNA that produced significant knockdown targeting the luciferase mRNA of a luciferase rennilla reporter system. When targeting an HCV subgenomic replicon luciferase reporter system, knockdown was not observed. Additionally, the WT PspCas13b had photo-crosslinking to the bound crRNA and requires further optimization for future use.

Digital Light Processing Bioprinting Full-Thickness Human Skin for Modelling Infected Chronic Wounds in Vitro

Stefanek, Evan 08 August 2022 (has links)
Chronic wounds have a detrimental impact on patient quality of life, a significant economic cost, and often lead to severe outcomes such as amputation, sepsis or death. The elaborate interplay between bacteria, cutaneous cells, immune cells, growth factors, and proteases in chronic wounds has complicated the development of new therapies that could improve outcomes for chronic wound patients. Existing in vitro models of chronic wounds do not appreciably mimic the complexity of the wound environment. In this work, tissue-engineered skin was developed with the goal of creating an in vitro platform appropriate for testing potential clinical therapies for chronic wounds. The Lumen-X, a digital light processing bioprinter, was used to create tissue-engineered skin from a 7.5% (w/v) gelatin methacryloyl hydrogel laden with primary dermal fibroblasts. This dermal layer was developed with an emphasis on providing a favourable microenvironment for the fibroblasts in order to mimic their in vivo phenotype. An epidermal layer of human keratinocytes was formed on the hydrogel surface and stratified through culture at the air-liquid-interface. The maturation of the epidermis was thoroughly characterized with histology, immunohistochemistry, and trans-epithelial electrical resistance analyses which showed a degree of maturation suitable for wound healing studies. To verify the suitability of this tissue-engineered skin for studying healing in vitro, sharp tweezers were used to create physical wounds in the epidermis which were then infected with Pseudomonas aeruginosa. Reepithelialisation, the production of the pro- inflammatory cytokine TNF-α, and the presence of bacteria were monitored over time, showing healing in wounds without infection and those treated with antibiotics, and potential biofilm formation in infected wounds. The tissue-engineered skin developed here is suitable for use as an in vitro model of the infected chronic wound environment. Future work includes developing better methods for creating the physical wound and characterizing the bacterial biofilm in order to improve the reproducibility and clarity of results. Such a model will then be well-poised to begin testing potential chronic wound therapies in vitro. / Graduate / 2023-07-26

Fabrication of Anisotropic Sol-gel Materials by Photo-Crosslinking

Wingfield, Charles 23 April 2012 (has links)
This is a report on the fabrication and characterization of anisotropic, porous materials: functionally graded cellular and compositionally anisotropic aerogels. This new class of materials was fabricated by photopolymerization of selected regions of a homogeneous monolith using visible light. Visible light is not significantly absorbed and not significantly scattered by organic molecules and oxide nanoparticles in wet gels and it allows fabrication of deeply penetrating, well-resolved patterns. Simple variations of the exposure geometry allowed fabrication of a wide variety of anisotropic materials without requiring layers or bonding.

Development of Polymer Composite Based Enabling Technologies for Lab-on-a-Chip Devices

Carias, Vinicio 20 July 2015 (has links)
This dissertation presents enabling technologies to fabricate thermo-responsive polymer composite based Lab-on-a-Chip (LOC) devices. LOC devices, also known as micro-total-analytical systems (microTAS) or microfluidic devices can amalgamate miniaturized laboratory functions on a single chip. This significant size reduction decreases the amount of required fluid volumes down to nano or pico-liters. The main commercial application of LOC devices is the biomedical fields. However, these devices are anticipated to make a technological revolution similar to the way miniaturization changed computers. In fact, medical and chemical analyses are predicted to shift from room-sized laboratories to hand-held portable devices. This dissertation is divided into three technologies. First, a series of terpolymer systems were synthesized and characterized to fabricate crosslinked coatings for phototunable swelling and create chemically patterned regions in order to conjugate cationic markers, proteins, or nanoparticles to the terpolymer coating. Second, antifouling surfaces were fabricated using magnetic thermo-responsive hydrogel structures via soft lithography. The structures were remote control activated with the use of AC magnetic fields. Finally, in order for LOC devices to fulfill its promise of bringing a laboratory to a hand-held device, they will have to be integrated with CMOS technology. Packaging will play a crucial role in this process. The last section will focus on the importance of coefficient of thermal expansion (CTE) mismatch in multi-chip modules. For the first technology, multi-functionalized terpolymer systems have been developed comprising of three units: N-isopropylacrylamide (NIPAAm), a stimuli responsive monomer that swells and collapses in response to temperature; methacryloxybenzophenone (MaBP), a photo-crosslinkable monomer that is activated at λ = 365 nm; and phenacyl methacrylate (PHEm), a photolabile protected functional group that generates localized free carboxyl groups in response to deprotection at λ = 254 nm. The multifunctional terpolymers can be spin-casted to form thin films of well-defined thickness, photo-crosslinked by a long UV wavelength light (λ = 365 nm) to form distinct structural patterns, and subsequently photo-chemically modified by a short UV wavelength light (λ = 254 nm). The photocleavage reaction by UV irradiation allows the production of free carboxylic groups that can be used to conjugate cationic markers, proteins, or nanoparticles to the terpolymer coating. Furthermore, the free carboxyl groups can be used to locally tune the swelling characteristics and transition temperature of the coatings. For the second technology, when Fe3O4 magnetic nanoparticles are integrated into PNIPAAm based composite systems, their resultant hyperthermia behavior becomes an ideal mechanism for remote controlled actuation. In this work, nano Fe3O4 octopods were seeded in fabricated PNIPAAm hydrogel micro-actuators. When the magnetic hydrogel structures were exposed to a magnetic field strength of 63 kA/m at a frequency of 300 kHz, the hydrogel micro-beams underwent a buckling effect when the field was absent and an unbuckling effect when the field was present. The hydrogel micro-beams were fabricated at an approximate distance from one another developing micromanipulating surfaces that were remote control activated. The response time, heating efficiency, and magnetic behavior were thoroughly studied. Lastly, micron sized polystyrene beads were exposed to the antifouling surfaces and movement of the beads was observed as the magnetic hydrogel micro-beams underwent their physical changes. For the third technology, a major reason of device failure in multi-chip module assemblies is a CTE mismatch between the underfill encapsulant material and the integrated circuit chip. Some of the failure mechanisms of microelectronic packaging due to CTE mismatch include fractures, delamination, or cracks through the device. In this section, the CTE of a commercially available underfill material is greatly reduced by loading the polymer resin material with hollow glass beads, to realize an overall effective CTE of 6.6 ppm/°C. Furthermore, the newly developed composite material exhibited outstanding thermomechanical stability at high temperatures beyond 150°C by holding a 3X lower CTE and a higher glass transition temperature.

Strukturcharakterisierung photochemisch vernetzter tetra-PEG Hydrogele mit unterschiedlichem Aufbau

Rohn, Mathias 23 October 2017 (has links) (PDF)
Die Funktionalisierung von tetra-PEG Makromolekülen mit fotoreaktiven Gruppen und die anschließende Umsetzung zu Hydrogelen durch fotochemische Vernetzung werden beschrieben. Die Funktionalisierung der Makromoleküle wird mittels UV-Vis- und NMR-Spektroskopie nachgewiesen, während der Verlauf der Vernetzung über die dynamische Lichtstreuung und IR-Spektroskopie betrachtet wird. Die hergestellten Hydrogele werden hinsichtlich des Sol-Anteils und der Quelleigenschaften untersucht. Über den Umsatz wird die Konzentration der Netzketten theoretisch berechnet. Einen weiteren Schwerpunkt bildet die Charakterisierung der Hydrogele hinsichtlich der mechanischen Eigenschaften. Über den Speichermodul wird die Konzentration der Netzketten experimentell bestimmt. Mittels dynamischer Lichtstreuung werden die kooperativen Diffusionskoeffizienten und Maschenweiten der Hydrogele bestimmt.

Komplexierende Glycopolymerfilme auf der Basis hochverzweigten Polyethylenimins zum Aufbau ionenselektiver Elektroden

Kluge, Jörg 10 February 2017 (has links) (PDF)
Die bisher gängigen PVC-Membranen ionenselektiver Elektroden weisen eine Reihe von Schwachstellen auf: Sie haften nur durch Adhäsion am Substrat, sodass sich bei miniaturisierten Elektroden die Membran ablösen kann; Membranbestandteile wie der Weichmacher, das Ionophor oder der Ionenaustauscher können bei der Verwendung ausgewaschen werden, sodass sich die chemischen und physikalischen Eigenschaften der Membran verschlechtern; auf der Membranoberfläche kann sich auf Grund ihrer Hydrophobie ein Biofilm ausbilden, der die Membran abschirmt. Diese Schwachstellen bewirken eine Dysfunktionalität der ionenselektiven Elektrode, weshalb im Rahmen dieser Arbeit ein Glycopolymerfilm entwickelt worden ist, der diese Schwachstellen nicht aufweist. Die in dieser Arbeit entwickelte Membran, die auf einem multifunktionalen Glycopolymer beruht, zielt auf die Egalisierung der Schwachstellen konventioneller ionenselektiver PVC-Membranen. Die entwickelte Membran kommt dabei ohne Weichmacher aus, reduziert die Ausbildung von Biofilmen, bindet kovalent an das darunterliegende organische Substrat und durch die kovalente Anbindung des Ionophors wird dessen Auswaschen verhindert. Um eine kovalente Bindung der Membran an organische Vermittlerschichten zu erreichen, wie sie bei All-solid-state-Elektroden zum Einsatz kommen, werden zunächst die photovernetzbaren Glycopolymere 12a–c entwickelt, bei denen etwa neun Photovernetzereinheiten über PEG-Spacer an den PEI25-Kern gebunden sind. Drei PEG-Spacer mit unterschiedlicher Länge werden hinsichtlich ihres Einflusses auf die Filmbildung untersucht: Sie besitzen vier (12a), acht (12b) und zwölf Ethylenglycoleinheiten (12c). Dabei zeigt sich, dass eine Spacerlänge von zwölf Ethylenglycoleinheiten für eine effektive Photovernetzung notwendig ist, weshalb für die folgenden Strukturen nur PEG12-Spacer eingesetzt werden. Um eine kovalente Anbindung des Ionophors an das Glycopolymer zu erreichen, werden verschiedene Syntheserouten genutzt und auf ihre Wirkung hin analysiert. Die frühe direkte Anbindung des Calix[4]arenderivats 3 an den PEI25-Kern der Glycopolymere 17a–c erweist sich als nachteilig, da hierdurch darauffolgende Syntheseschritte beeinträchtigt werden. Anderseits zeigen diese Glycopolymere, dass sich die Calix[4]areneinheiten nicht negativ auf die Glycopolymerfilmbildung auswirken. Zur Überwindung der erwähnten Probleme werden in den multifunktionalen Glycopolymeren 22a und 22b die Calix[4]arene wie der Photovernetzer am Ende der Syntheseroute über PEG12-Spacer angebunden. Dies erfolgt dabei über den upper rim des Calix[4]arens, da somit der lower rim, an dem sich ionenkomplexierenden Gruppen befinden, nicht beeinflusst wird. Neben der Struktur des Glycopolymers wird auch eine Methode zur Glycopolymerfilmbildung auf Modellsubstraten entwickelt. Hierfür werden Siliziumwafer mit einer hydrophilen organischen Vermittlerschicht aus (3-Glycidyloxypropyl)-trimethoxysilan (GOPS) eingesetzt. Bei der Filmbildung zeigt sich, dass die alleinige Bestrahlung mit UV-Licht nicht ausreichend ist, um eine stabile Vernetzung zu generieren. Erst nach vorausgehendem Tempern (1 h bei 120 °C) werden Filme mit einer Dicke von (42±8) nm für das Glycopolymer 12c erhalten. Die Glycopolymere 12a und 12b, die kürzere PEG-Spacer enthalten, bilden deutlich dünnere Filme aus. Für die vollständige Vernetzung ist eine Bestrahlungszeit von einer Stunde notwendig, was einer Energiedosis von etwa 290 J/cm² entspricht. Trotz möglicher freier Aminogruppen in der Struktur bilden die Glycopolymere 17a–c, bei denen unterschiedlich viele Calix[4]arene direkt an den PEI25-Kern gebunden sind, stabile Filme aus. Die sich ergebenden Schichtdicken zeigen dabei weder im Vergleich zum Glycopolymer 12c noch untereinander signifikante Unterschiede. Die Filmbildung auf dem hydrophilen GOPS wird demzufolge durch die direkt angebundenen Calix[4]arene nicht beeinträchtigt. Auf Grund des erwarteten amphiphilen Charakters der Glycopolymere 17a–c wird ihre Filmbildung nicht nur auf hydrophilen, sondern auch auf hydrophoben Modellsubstraten untersucht. Hierzu werden Siliziumwafer mit hydrophoben Vermittlerschichten aus Benzophenonsilan (BPS) und Poly-α-methylstyrol (PαMS) eingesetzt. Auf den hydrophoben Vermittlerschichten bilden die Glycopolymere 17a–c deutlich dünnere Filme aus als auf dem hydrophilen GOPS. Die Calix[4]areneinheiten sind demnach durch die Maltosehülle abgeschirmt und es treten kaum Wechselwirkungen mit den hydrophoben Substratoberflächen auf. Im Gegensatz dazu ermöglicht die Anbindung der Calix[4]arene über PEG12-Spacer den Glycopolymeren 22a und 22b auf hydrophilen wie hydrophoben Vermittlerschichten in etwa gleich dicke Filme auszubilden. Offensichtlich liegt bei diesen Glycopolymeren eine amphiphile Peripherie vor, sodass sich die Glycopolymere besonders zur Beschichtung von All-solid-state-Elektroden mit verschiedenen Mediatorschichten eignen. Die photovernetzten Glycopolymerfilme quellen auf Grund ihrer hydrophilen Eigenschaften. Der Quellungsgrad q liegt dabei niedriger, wenn hydrophobe Calix[4]arene in die Struktur eingebunden sind: q(17c) = 2,3 im Vergleich zu q(12c) = 3,6. Erfolgt die Anbindung der Calix[4]arene direkt an den PEI25-Kern, ist die Glycopolymerstruktur unflexibel, sodass der Quellungsprozess bis zu sieben Stunden benötigt. Durch die Anbindung der Calix[4]arene über PEG12-Spacer wird die Flexibilität der Glycopolymere hingegen nicht beeinträchtigt, sodass der Quellungsprozess weniger als zwei Stunden benötigt. PVC-Membranen verlieren schon nach kurzer Zeit ihre ionenselektiven Eigenschaften, weil etwa der Weichmacher aus den Membranen diffundiert und diese dadurch spröde werden. Die Glycopolymerfilme sind hingegen über einen Zeitraum von mindestens 100 Tagen gegenüber sauren (pH = 4), neutralen und basischen (pH = 10) Lösungen stabil. Die entwickelten Glycopolymere werden im Rahmen einer Kooperation mit dem Kurt-Schwabe-Institut (KSI) in Meinsberg auf All-solid-state-Elektroden als ionenselektive Membranen eingesetzt. Die Graphitelektroden werden dafür mit einer Mediatorschicht aus leitfähigem Polypyrrol (PPy) und dem Glycopolymer 17c beschichtet. Die All-solid-state-Elektroden werden hinsichtlich ihres Ansprechverhaltens gegenüber verschiedenen Ionen untersucht. Die Anbindung und Vernetzung erfolgt nach der für die Modellsubstrate optimierten Methode. Jedoch werden die Bedingungen für das Tempern angepasst, um eine Beschädigung der All-solid-state-Elektrode auszuschließen: 12 h bei 45 °C statt 1 h bei 120 °C. Dabei bildet sich ein inhomogener Belag aus, bei dem Teile der PPy-Schicht frei bleiben. Im Vergleich zur reinen und zur mit Polypyrrol (PPy) beschichteten Graphitelektrode zeigt die Elektrode, die mit einem Glycopolymerfilm versehen ist, trotz der Inhomogenität stabile und reproduzierbare Potentiale. Diese sind jedoch nicht von der Konzentration der Kationen, sondern von der der Anionen abhängig. Durch die Auftragung einer Ionentauscherschicht auf die ionenselektive Membran soll das Vordringen der Anionen in die Membran der All-solid-state-Elektrode unterbunden werden. Dadurch soll das Ansprechverhalten der All-solid-state-Elektrode auf die Kationen gelenkt werden. Entsprechende Arbeiten werden am KSI durchgeführt.

Strukturcharakterisierung photochemisch vernetzter tetra-PEG Hydrogele mit unterschiedlichem Aufbau

Rohn, Mathias 07 August 2017 (has links)
Die Funktionalisierung von tetra-PEG Makromolekülen mit fotoreaktiven Gruppen und die anschließende Umsetzung zu Hydrogelen durch fotochemische Vernetzung werden beschrieben. Die Funktionalisierung der Makromoleküle wird mittels UV-Vis- und NMR-Spektroskopie nachgewiesen, während der Verlauf der Vernetzung über die dynamische Lichtstreuung und IR-Spektroskopie betrachtet wird. Die hergestellten Hydrogele werden hinsichtlich des Sol-Anteils und der Quelleigenschaften untersucht. Über den Umsatz wird die Konzentration der Netzketten theoretisch berechnet. Einen weiteren Schwerpunkt bildet die Charakterisierung der Hydrogele hinsichtlich der mechanischen Eigenschaften. Über den Speichermodul wird die Konzentration der Netzketten experimentell bestimmt. Mittels dynamischer Lichtstreuung werden die kooperativen Diffusionskoeffizienten und Maschenweiten der Hydrogele bestimmt.

Synthèse et caractérisation d'auto-assemblages de copolymères à blocs amphiphiles photo-réticulables / Synthesis and characterization of self-assembled photo-crosslinkable amphiphilic block copolymers

Nze, René-Ponce 03 December 2014 (has links)
L’objectif de ce travail est dans un premier temps d’élaborer des fleurs macromoléculaires et des polymères hyperbranchés par auto-assemblage et réticulation de copolymères triblocs associatifs en solvants sélectifs. Dans un second temps, il s’agit d’étudier les propriétés structurales et dynamiques de ces architectures par diffusion de la lumière et rhéologie en solution sur une gamme étendue de concentration. La première partie de ce travail a consisté à synthétiser les copolymères triblocs associatifs à base de polybutadiène (PB), et de poly(oxyde d’éthylène) (POE) en les modifiant aux extrémités avec des blocs solvophobes réticulables respectivement poly(acrylate de diméthylmaléimidoéthyle)(PMDIEA), et poly(acrylate de méthacryloyloxyéthyle)(PAME). La deuxième partie de ce travail a consisté en l’élaboration de micelles "fleurs" et de polymères hyperbranchés (HyperMac) par auto-assemblage dans l’eau du copolymère PAME7-b-POE270-b-PAME7, suivi d’une réticulation des cœurs afin de figer les structures. Il a été observé par diffusion de la lumière que la taille dépend de la concentration à laquelle le polymère a été réticulé. Les dynamiques locales ainsi que la compressibilité osmotique sont indépendantes de l'architecture (étoile, fleur ou HyperMac) à forte concentration. Il a également été observé une autosimilarité des structures obtenues quels que soient leurs types. Les mesures de rhéologie montrent une augmentation de la viscosité avec la taille et le degré de ramification des architectures. La dépendance en concentration de la viscosité des solutions de "fleurs" est identique à celle des solutions d'étoiles. / The objective of this work is a first step to develop flower-like and hyperbranched polymers by selfassembling and crosslinking of associative triblock copolymers in selective solvents. The second aim is to study structural and dynamic properties of these architectures in solution by light scattering and rheology on a broad range of concentrations. The first part of this work consisted in synthesizing triblock copolymers based on polybutadiene (PB), and poly(ethylene oxide) (PEO) by end-capping them with crosslinkable solvophobic blocks; poly(dimethyl maleimido ethyl acrylate) (PDMIEA) and poly(methacryloyloxyethyl acrylate) (PMEA), respectively. The second part of this work consisted in elaborating flowers-like and hyperbranched polymers (HyperMac) by self-assembling the PAME7-b-PEO270-b-PAME7 copolymer in water, followed by crosslinking the micelles cores in order to freeze the structures. Light scattering revealed that the size of the objects depended on the concentration at which the polymers were crosslinked. Local dynamics and osmotic compressibility were independent of the architecture (star, flower or HyperMac) at high concentrations. In addition, a self-similarity of the structures was observed regardless their types. Rheology measurements showed an increase of viscosity with the size and the branching degree of the architectures. The concentration dependence of the viscosity was the same for star- and flower-like polymer in water.

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