Ce travail s'inscrit dans le cadre général de la mise au point et de l'étude d'agents potentiellement photothérapeutiques. Dans cette optique, les recherches menées dans notre laboratoire sont consacrées principalement à l'étude de complexes photooxydants de ruthénium(II) contenant des ligands -déficients TAP (1,4,5,8-tétraazaphénanthrène). Ces composés sont en effet capables, sous illumination, d'oxyder différentes biomolécules pour mener, notamment, à la formation de photoadduits qui pourraient perturber le fonctionnement d'enzymes cellulaires in vivo. La première partie de ce travail a été consacrée à la mise au point d'un nouveau système d'ancrage de ces complexes. Elle décrit les voies de synthèse et de purification de deux nouveaux ligands fonctionnalisés: la phen" et le TAP", ainsi que celles de trois nouveaux complexes chélatés par ces nouveaux ligands: le Ru(TAP)2phen"2+, le Ru(TAP)2TAP"2+ et le Ru(phen)2phen"2+. Ces composés ont été attachés, via une liaison oxime, sur oligonucléotides synthétiques et sur polymères biodégradables. La seconde partie de notre travail a été consacrée à l'étude photochimique de conjugués oligonucléotide-complexe sous forme de simples et de doubles brins. Pour les conjugués à base du Ru(TAP)2phen2+, nous avons pu mettre en évidence un photocrosslinking lorsque des guanines étaient présentes dans le brin complémentaire. La formation de ce photoadduit est moins efficace que celle observée avec l'ancien système et montre une dépendance en l'extrémité d'ancrage du complexe (5' ou 3'). Pour les conjugués fonctionnalisés avec le Ru(TAP)32+, nous avons montré que le photocrosslinking, dans le duplexe avec guanines, était moins efficace à cause de la photodéchélation de ce composé. De plus, nous avons pu mettre en évidence un quenching de la luminescence par les bases adénines dans les conjugués simples et doubles brins sans guanine ainsi qu'un photocrosslinking dans le duplexe sans guanine. Enfin, nous avons pu déterminer pour la première fois le rendement quantique de la réaction de photojonction via les bases guanines. Nous avons ensuite étudié, d'un point de vue photophysique et photochimique, des conjugués complexe-polymère biodégradable dont le rôle sera de faire pénétrer les composés photoréactifs à l'intérieur des cellules. D'une part, nous avons montré que la présence du polymère avait peu d'influence sur les propriétés photophysiques des complexes. D'autre part, l'utilisation de différentes techniques, nous a permis de démontrer que les complexes ancrés chimiquement sur ces macromolécules sont toujours capables de photooxyder la guanine et de mener à la formation de photoadduits sur GMP et sur oligonucléotides. Finalement, la dernière partie de notre travail a été consacrée à l'étude des complexes photoréactifs Ru(TAP)2phen2+ et Ru(TAP)32+ en présence de dérivés de la tyrosine. Nous avons pu mettre en évidence un quenching de la luminescence de ces complexes par la tyrosine, la N-acétyl-tyrosine et le tripeptide lysine-tyrosine-lysine. La formation de photoproduits a été montrée par spectroscopie d'absorption et une influence de la concentration en oxygène et de la chaîne principale de l'acide aminé a été observée. Enfin, suite à une étude par HPLC et ES-MS, la formation de dimères de la tyrosine et de complexes ayant perdu un ligand TAP et rechélatés par une tyrosine a pu être proposée.

Une compréhension sans cesse plus pointue des processus élémentaires de transferts de charges et d’énergie, qui sont à la base même de nombreux processus biologiques, permet non seulement l’élaboration mais aussi l’amélioration de la mise au point de molécules photoactives utiles dans différentes applications. C'est le cas (i) de systèmes moléculaires et supramoléculaires destinés à mimer efficacement la photosynthèse, ou encore (ii) de molécules photoactives capables d’interagir avec des macromolécules biologiques et d’induire une transformation de ces biomolécules. C’est dans ce cadre général que s’inscrit l’élaboration de nouveaux complexes polyazaaromatiques de Ru(II) capables d’interagir avec la double hélice d’ADN et de photoréagir avec sa base la plus réductrice, la guanine, par transfert d’électron photoinduit. C’est sur la base de ces processus que des nouveaux agents antitumoraux photoactivables ont pu être développés. L’utilisation de complexes de Ru(II) dans le design d’entités supramoléculaires polymétalliques destinées à jouer le rôle de collecteurs de lumière et permettant ainsi de mimer les systèmes d’antennes naturels s’intègre également dans cette démarche. L’ensemble de notre travail s’est concentré sur ces deux domaines d’applications. Par l’étude de différents processus de transfert de charges/d’énergie au sein des complexes seuls (processus intramoléculaires) ou en interaction avec un environnement spécifique (processus intermoléculaires), nous avons souhaité mettre en évidence l’intérêt de l’utilisation d’un nouveau ligand plan étendu, le tpac, au sein de complexes du Ru(II). Un tel ligand permet en effet de conférer d’une part une affinité élevée des complexes résultants pour l’ADN, et d’autre part, de par sa nature pontante, de connecter des unités métalliques entre elles au sein d’entités supramoléculaires de taille importante. Les propriétés photophysiques de quatre complexes basés sur le ligand plan étendu tpac, le [Ru(phen)2tpac]2+ (P) et son homologue dinucléaire le [(phen)2Ru tpac Ru(phen)2]4+ (PP) (à base de ligands ancillaires phen), ainsi que le [Ru(tap)2tpac]2+ (T) et son homologue dinucléaire le [(tap)2Ru tpac Ru(tap)2]4+ (TT) (à base de ligands ancillaires tap), ont été étudiées et comparées entre elles. L’examen de ces propriétés, d’abord pour les complexes seuls en solution, en parallèle avec celles de complexes dinucléaires contenant un ligand pontant PHEHAT, a permis de mettre en évidence l’importance de la nature du ligand pontant utilisé. Ces résultats ont ainsi révélé qu’un choix judicieux du ligand pontant permet de construire des entités de grande taille capables de transférer l’énergie lumineuse vers un centre (cas du ligand PHEHAT), ou, au contraire, de relier entre elles des entités ne s’influençant pas l’une l’autre d’un point de vue photophysique (cas du ligand tpac). Les propriétés des complexes du tpac, étudiés cette fois en présence de matériel génétique (mononucléotide GMP, ADN ou polynucléotides synthétiques), se sont révélées très différentes selon que le complexe portait des ligands ancillaires phen (P, PP) ou tap (T, TT). Seuls les complexes à base de tap sont en effet photoréactifs envers les résidus guanine. Nous avons dès lors focalisé cette partie de notre travail sur les deux complexes T et TT. Cette photoréaction, ainsi que le transfert d’électron photoinduit entre ces complexes excités et la guanine, ont pu être mis en évidence par différentes techniques de spectroscopie d’émission tant stationnaire que résolue dans le temps, ainsi que par des mesures d’absorption transitoire dans des échelles de temps de la nano à la femto/picoseconde. L’étude du comportement photophysique des complexes en fonction du pH a en outre révélé de manière très intéressante que, pour des études en présence d’ADN, la protonation des états excités des complexes devait être considérée. Les résultats de cette étude nous ont fourni des pistes quant à l’attribution des processus observés en absorption transitoire. Le transfert d’électron a également fait l’objet d’une étude par des méthodes théoriques. Ces calculs ab initio ont permis de mettre en évidence une faible influence de l’énergie de réorganisation sur la vitesse de transfert d’électron, qui semble dépendre plus sensiblement de la non-adiabaticité du processus, mais surtout de l’énergie libre de la réaction et d’un éventuel couplage à un transfert de proton. L’ensemble des résultats obtenus avec les complexes T et TT en présence de matériel génétique, qui, de manière assez inattendue, sont très semblables, indiquent que ces complexes présentent tous deux un grand intérêt pour le développement de nouvelles drogues antitumorales photoactivables.

L’objectif de la thèse était le développement de catalyseurs pour la cycloaddition entre alcynes et azotures catalysée par le cuivre(I) (CuAAC), une des réactions les plus importantes de la chimie moderne. Dans un premier temps, nous avons montré que le complexe de cuivre(II) [Cu(C186-tren)]Br2 pouvait être utilisé comme catalyseur pour cette réaction, et ceci sans ajout d’un réducteur sacrificiel externe de type ascorbate de sodium. Des études spectroscopiques (RPE, UV-visible) suggèrent que l’alcyne sert de « réducteur interne ». Dans un deuxième temps, l’utilisation d’un ligand tren portant trois groupements tert-butylbenzène (tBuBz3tren) a permis d’obtenir des complexes supramoléculaires de cuivre(II) solubles dans l’eau par formation de complexes d’inclusion avec des beta-cyclodextrines. Ces complexes se sont avérés être de bons catalyseurs pour la CuAAC, particulièrement en utilisant l’ascorbate de sodium comme réducteur. Nous avons ensuite préparé le complexe de cuivre(II), [Cu(tBuBz3tren)kétoprofénate]kétoprofénate, dont le contre-ion est l’anion kétoprofénate qui possède une fonction benzophénone comme photosensibilisateur. Sous irradiation à 365 nm, ce complexe est réduit très efficacement en cuivre(I) par transfert d’électron photo-induit. Nos études ont montré que le précatalyseur de cuivre(II) peut donc être activé très efficacement par la lumière pour générer une espèce cuivre(I) très réactive pour la cycloaddition de Huisgen. Le contrôle de l’activité catalytique du complexe a été testé dans le méthanol ou le toluène pour la réaction entre différents azotures et alcynes. Les triazoles correspondants ont été isolés avec d’excellents rendements par simple filtration. De plus, une fois la réaction initiée photochimiquement, il est possible de la stopper instantanément en introduisant de l’air dans le milieu réactionnel. Il s’agit du premier exemple de catalyseur photoactivable pour la chimie click. / This thesis focuses on the development of catalysts for the copper-catalyzed reaction between alkynes and azides (CuAAC), one of the most important reactions of modern chemistry. As a first step, we have shown that the copper(II) complex [Cu(C186-tren)]Br2 could be used as catalyst for this reaction, and this without adding an external sacrificial reductant such as sodium ascorbate. Spectroscopic studies (EPR, UV-visible) suggest that the alkyne serves as the "internal reductant" In a second step, the use of a tren ligand (tBuBz3tren) bearing three tert-butylbenzene groups allowed to obtain supramolecular copper(II) complexes that were soluble in water by formation of inclusion complexes with beta-cyclodextrins. These complexes proved to be good catalysts for CuAAC, particularly if using sodium ascorbate as the reductant. We then prepared the copper(II) complex, [Cu(tBuBz3tren)ketoprofenate]ketoprofenate, whose counter-ion is the ketoprofenate anion which contains a benzophenone function as a photosensitizer. Under irradiation at 365 nm, the complex is very effectively reduced to copper(I) by photoinduced electron transfer (PET). Our studies have shown that the copper(II) precatalyst can be very efficiently activated by light to generate a highly active copper(I) catalyst for the CuAAC. The control over the catalytic activity of the complex was tested in methanol or toluene for the reaction between various azides and alkynes. The corresponding triazoles were isolated with excellent yields by simple filtration. In addition, once the reaction is initiated photochemically, it is possible to instantly stopped it by introducing air into the reaction medium. Overall, this is the first example of a photoactivatable catalyst for click chemistry.

Une importante avancée dans la compréhension des mécanismes gouvernant le processus de transport des ions iodures à l’intérieur des cellules thyroïdiennes a été le clonage en 1996 de la protéine responsable de ce transport : le symporteur Na/I (ou NIS). De nombreuses recherches ont été conduites depuis afin de caractériser cette protéine ainsi que les mécanismes qui régulent son expression et son activité. Les mécanismes cellulaires de régulation du transport et les protéines impliquées dans la régulation post-traductionnelle du symporteur restent toutefois largement inconnus. La compréhension de l’ensemble de ces mécanismes permettrait pourtant d’améliorer le traitement d’un grand nombre de patients. Le transport d’iode est en effet non seulement impliqué dans différentes pathologies de la thyroïde, mais aussi dans les contaminations à l’iode radioactif consécutives aux accidents nucléaires et dans de prometteuses stratégies de thérapie génique anticancéreuses. La chémogénomique, aussi appelée génétique chimique, est une approche multidisciplinaire dont le but est d’explorer les systèmes vivants au moyen de petites molécules organiques. Afin de mieux comprendre les mécanismes qui gouvernent le transport d’iode, notre laboratoire a mis en place une stratégie de génétique chimique qui a permis dans un premier temps de découvrir 10 molécules capables d’inhiber le transport d’iode. L’objectif de cette thèse était d’identifier les cibles protéiques de deux de ces molécules : ITB5 et ITB2. Des études d’électrophysiologie et de flux isotopique ayant montré que ces deux molécules ont un mode d’action différent, leur étude devait permettre d’identifier au moins deux protéines impliquées dans le transport des ions iodures.Afin d’identifier les protéines cibles d’ITB5 et d’ITB2, des sondes ont été synthétisées. Ces sondes sont constituées du composé d’intérêt, d’un groupement photoactivable permettant de créer, sous irradiation lumineuse, une liaison covalente avec la ou les protéine(s) cible(s) et d’une molécule de Biotine ou de Desthiobiotine afin d’extraire les protéines marquées des lysats cellulaires. Une fois marquées et capturées sur des billes d’agarose Streptavidine, les protéines d’intérêt ont été séparées sur des gels SDS-PAGE colorés au nitrate d’argent ou au bleu de Coomassie. Les bandes correspondantes ont été excisées, digérées à la trypsine et les peptides obtenus analysés par spectrométrie de masse. L’interrogation de la base de données Swissprot avec les données issues des expériences menées avec la sonde ITB5-P2 a permis d’identifier 3 protéines interagissant visiblement avec ce composé. Les expériences basées sur le composé ITB2 ont du être suspendues par manque de temps mais des résultats encourageants ont déjà été obtenus. Une bande pouvant correspondre à une protéine marquée spécifiquement par la sonde ITB2-P1 a en effet pu être observée en Western-blot suite à une première expérience de capture sur billes. Elle n’a toutefois pas pu être visualisée sur gel du fait d’une présence trop importante de protéines captées non spécifiquement par les billes. Les conditions expérimentales de capture ayant été optimisées avec le composé ITB5, leur application au composé ITB2 devrait maintenant permettre d’obtenir des gels plus propres à partir desquels la bande d’intérêt pourra être excisée pour être, elle aussi, analysée par spectrométrie de masse. / An important breakthrough in the understanding of the mechanisms governing the process of iodide transport inside thyroid cells has been the cloning in 1996 of the protein responsible for this transport : the Na/I symporter (NIS). Different studies have been conducted ever since in order characterize this protein as well as the mechanisms which regulate its expression and its activity. Nevertheless, the cellular mechanisms of transport regulation and the proteins implied in the posttranslational regulation of the symporter remain largely unknown. The full understanding of these mechanisms would allow the treatment improvement of a lot of patients. Iodide transport is indeed involved not only in different thyroid pathologies, but also in radioactive iodide contaminations following nuclear accidents and in promising anticancer strategies by gene transfer. Chemogenomics, also called chemical genetics, is a multidisciplinary approach which goal is to explore the living systems thanks to small organic molecules. To better understand the mechanisms which govern iodide transport, our laboratory has set up a direct chemical genetic strategy which allowed us first to discover 10 molecules able to inhibit iodide transport. The objective of this thesis was to identify the protein targets of two molecules : ITB5 and ITB2. Electrophysiological and isotopic flux studies showed that these two molecules have a different mechanism of action. Their study should then allow the identification of at least two proteins involved in iodide transport.To identify the protein targets of ITB5 and ITB2, different probes were synthesized. These probes are made from the compound of interest, a photoactivable group allowing the creation, under light irradiation, of a covalent bound with the protein target(s) and a Biotin or Desthiobiotine molecule to extract the labeled proteins from cellular lysates. Once labeled and captured on agarose-Streptavidin beads, the proteins of interest were separated on SDS-PAGE gels stained either with silver nitrate or Coomassie blue. The corresponding bands were excised, digested by trypsin and the obtained peptides analyzed by mass spectrometry. A query made in the data bank Swissprot with the data obtained after the experiments conducted with the probe ITB5-P2 allowed us to identify 3 proteins apparently interacting with the compound ITB5. The experiments based on ITB2 had to be suspended because of a lack of time but encouraging results have been obtained. A band which may correspond to a protein specifically labeled by the probe ITB2-P1 has indeed been observed on a Western-blot after a first on-bead capture experiment. However, we couldn’t visualize it on a gel because of the important presence of proteins captured non specifically by the beads. The capture experimental conditions were optimized with the compound ITB5. These conditions will now be applied to the compound ITB2 and this should allow us to obtain cleaner gels on which the band of interest will be excised for an analyze by mass spectrometry.

Ce travail s'inscrit dans le cadre général de la mise au point et de l'étude d'agents potentiellement photothérapeutiques. Dans cette optique, les recherches menées dans notre laboratoire sont consacrées principalement à l'étude de complexes photooxydants de ruthénium(II) contenant des ligands &61552;-déficients TAP (1,4,5,8-tétraazaphénanthrène). Ces composés sont en effet capables, sous illumination, d'oxyder différentes biomolécules pour mener, notamment, à la formation de photoadduits qui pourraient perturber le fonctionnement d'enzymes cellulaires in vivo.<p><p>La première partie de ce travail a été consacrée à la mise au point d'un nouveau système d'ancrage de ces complexes. Elle décrit les voies de synthèse et de purification de deux nouveaux ligands fonctionnalisés: la phen" et le TAP", ainsi que celles de trois nouveaux complexes chélatés par ces nouveaux ligands: le &61531;Ru(TAP)2phen"&61533;2+, le &61531;Ru(TAP)2TAP"&61533;2+ et le &61531;Ru(phen)2phen"&61533;2+. Ces composés ont été attachés, via une liaison oxime, sur oligonucléotides synthétiques et sur polymères biodégradables.<p>La seconde partie de notre travail a été consacrée à l'étude photochimique de conjugués oligonucléotide-complexe sous forme de simples et de doubles brins. Pour les conjugués à base du &61531;Ru(TAP)2phen&61533;2+, nous avons pu mettre en évidence un photocrosslinking lorsque des guanines étaient présentes dans le brin complémentaire. La formation de ce photoadduit est moins efficace que celle observée avec l'ancien système et montre une dépendance en l'extrémité d'ancrage du complexe (5' ou 3'). Pour les conjugués fonctionnalisés avec le &61531;Ru(TAP)3&61533;2+, nous avons montré que le photocrosslinking, dans le duplexe avec guanines, était moins efficace à cause de la photodéchélation de ce composé. De plus, nous avons pu mettre en évidence un quenching de la luminescence par les bases adénines dans les conjugués simples et doubles brins sans guanine ainsi qu'un photocrosslinking dans le duplexe sans guanine. Enfin, nous avons pu déterminer pour la première fois le rendement quantique de la réaction de photojonction via les bases guanines.<p>Nous avons ensuite étudié, d'un point de vue photophysique et photochimique, des conjugués complexe-polymère biodégradable dont le rôle sera de faire pénétrer les composés photoréactifs à l'intérieur des cellules. D'une part, nous avons montré que la présence du polymère avait peu d'influence sur les propriétés photophysiques des complexes. D'autre part, l'utilisation de différentes techniques, nous a permis de démontrer que les complexes ancrés chimiquement sur ces macromolécules sont toujours capables de photooxyder la guanine et de mener à la formation de photoadduits sur GMP et sur oligonucléotides.<p>Finalement, la dernière partie de notre travail a été consacrée à l'étude des complexes photoréactifs &61531;Ru(TAP)2phen&61533;2+ et &61531;Ru(TAP)3& / Doctorat en sciences, Spécialisation chimie / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Une compréhension sans cesse plus pointue des processus élémentaires de transferts de charges et d’énergie, qui sont à la base même de nombreux processus biologiques, permet non seulement l’élaboration mais aussi l’amélioration de la mise au point de molécules photoactives utiles dans différentes applications. C'est le cas (i) de systèmes moléculaires et supramoléculaires destinés à mimer efficacement la photosynthèse, ou encore (ii) de molécules photoactives capables d’interagir avec des macromolécules biologiques et d’induire une transformation de ces biomolécules. C’est dans ce cadre général que s’inscrit l’élaboration de nouveaux complexes polyazaaromatiques de Ru(II) capables d’interagir avec la double hélice d’ADN et de photoréagir avec sa base la plus réductrice, la guanine, par transfert d’électron photoinduit. C’est sur la base de ces processus que des nouveaux agents antitumoraux photoactivables ont pu être développés. L’utilisation de complexes de Ru(II) dans le design d’entités supramoléculaires polymétalliques destinées à jouer le rôle de collecteurs de lumière et permettant ainsi de mimer les systèmes d’antennes naturels s’intègre également dans cette démarche. <p><p>L’ensemble de notre travail s’est concentré sur ces deux domaines d’applications. Par l’étude de différents processus de transfert de charges/d’énergie au sein des complexes seuls (processus intramoléculaires) ou en interaction avec un environnement spécifique (processus intermoléculaires), nous avons souhaité mettre en évidence l’intérêt de l’utilisation d’un nouveau ligand plan étendu, le tpac, au sein de complexes du Ru(II). Un tel ligand permet en effet de conférer d’une part une affinité élevée des complexes résultants pour l’ADN, et d’autre part, de par sa nature pontante, de connecter des unités métalliques entre elles au sein d’entités supramoléculaires de taille importante. <p><p>Les propriétés photophysiques de quatre complexes basés sur le ligand plan étendu tpac, le [Ru(phen)2tpac]2+ (P) et son homologue dinucléaire le [(phen)2Ru tpac Ru(phen)2]4+ (PP) (à base de ligands ancillaires phen), ainsi que le [Ru(tap)2tpac]2+ (T) et son homologue dinucléaire le [(tap)2Ru tpac Ru(tap)2]4+ (TT) (à base de ligands ancillaires tap), ont été étudiées et comparées entre elles.<p><p>L’examen de ces propriétés, d’abord pour les complexes seuls en solution, en parallèle avec celles de complexes dinucléaires contenant un ligand pontant PHEHAT, a permis de mettre en évidence l’importance de la nature du ligand pontant utilisé. Ces résultats ont ainsi révélé qu’un choix judicieux du ligand pontant permet de construire des entités de grande taille capables de transférer l’énergie lumineuse vers un centre (cas du ligand PHEHAT), ou, au contraire, de relier entre elles des entités ne s’influençant pas l’une l’autre d’un point de vue photophysique (cas du ligand tpac). <p><p>Les propriétés des complexes du tpac, étudiés cette fois en présence de matériel génétique (mononucléotide GMP, ADN ou polynucléotides synthétiques), se sont révélées très différentes selon que le complexe portait des ligands ancillaires phen (P, PP) ou tap (T, TT). Seuls les complexes à base de tap sont en effet photoréactifs envers les résidus guanine. Nous avons dès lors focalisé cette partie de notre travail sur les deux complexes T et TT. Cette photoréaction, ainsi que le transfert d’électron photoinduit entre ces complexes excités et la guanine, ont pu être mis en évidence par différentes techniques de spectroscopie d’émission tant stationnaire que résolue dans le temps, ainsi que par des mesures d’absorption transitoire dans des échelles de temps de la nano à la femto/picoseconde. L’étude du comportement photophysique des complexes en fonction du pH a en outre révélé de manière très intéressante que, pour des études en présence d’ADN, la protonation des états excités des complexes devait être considérée. Les résultats de cette étude nous ont fourni des pistes quant à l’attribution des processus observés en absorption transitoire.<p><p>Le transfert d’électron a également fait l’objet d’une étude par des méthodes théoriques. Ces calculs ab initio ont permis de mettre en évidence une faible influence de l’énergie de réorganisation sur la vitesse de transfert d’électron, qui semble dépendre plus sensiblement de la non-adiabaticité du processus, mais surtout de l’énergie libre de la réaction et d’un éventuel couplage à un transfert de proton. <p><p>L’ensemble des résultats obtenus avec les complexes T et TT en présence de matériel génétique, qui, de manière assez inattendue, sont très semblables, indiquent que ces complexes présentent tous deux un grand intérêt pour le développement de nouvelles drogues antitumorales photoactivables.<p> / Doctorat en Sciences / info:eu-repo/semantics/nonPublished